嗜盐菌Salicola marasensis TG-5的色素积聚、组成及鉴定研究

孙 鑫, 侍亚敏,张港生, 朱大玲

(1.天津科技大学 化工与材料学院,天津 300457;2.天津市卤水化工与资源生态化利用重点实验室,天津 300457)

1 前言

嗜盐微生物,作为极端微生物的代表之一,是一类能够生长于中、高浓度盐环境中的微生物,通常包括古细菌、细菌和真核生物三个分支。多数嗜盐微生物分布于海洋、盐湖、盐矿、盐碱土壤以及腌制品中[1-2]。独特的细胞结构和代谢机制使它们能够在极端盐度环境中生存和繁殖,并在维持生存环境的生态系统中发挥积极作用。其中,嗜盐细菌具有耐受性强、生长速度快等特点,在高盐废水生化处理、高值产品开发等领域已有广泛的应用,具有较好的应用前景[3-4]。

已有报道表明许多高盐环境中的嗜盐微生物富含类胡萝卜素,如嗜盐古菌和细菌中富含C50类胡萝卜素(菌红素)、杜氏盐藻(Dunaliellasalina)富含β-胡萝卜素[5]等。类胡萝卜素具有较强的抗氧化性,可以保护细胞免受自由基的抑制,维持细胞的正常代谢[6]。类胡萝卜素还作为维生素a原,在人类健康中发挥重要作用,预防黄斑退行性疾病和癌症,这使得类胡萝卜素在食品、制药和化妆品行业非常有价值[7-8]。嗜盐菌所产的类胡萝卜素已在保健品、饲料添加剂、化妆品抗氧化剂等方面具有较好的应用前景[9-11],如现已开发出天然类胡萝卜素胶囊、β-胡萝卜素含片等产品[12]。通常不同微生物中含有的色素种类并不单一,色素的代谢与细胞所处环境条件密切相关。

大多数嗜盐菌菌落颜色呈红色、橘红色、粉色等,这是因为嗜盐菌需要积累大量类胡萝卜素,来保护细胞不被高盐或高辐射等环境条件所破坏[13-14],通常在胁迫条件下可促进类胡萝卜素在细胞内的积聚。众多研究报道发现嗜盐古菌/细菌中色素主要由大量的菌红素及其衍生物和少量的β-胡萝卜素、番茄红素等组成。菌红素及其衍生物为C50类胡萝卜素,它们不仅可以提高细胞膜的刚性和流动性[15],而且由于其较强的抗氧化特性,可保护细胞免受辐射能量的有害影响和中低盐度产生的渗透胁迫[16-17]。Kushwaha等[18]利用薄层层析法和全光谱扫描确定嗜盐古菌Halobacteriumcutirubrum中的色素为菌红素,主要为单脱水菌红素和双脱水菌红素;Fang等[19]提取了嗜盐古菌Haloferaxmediterranei中的色素,发现其中含有C45类胡萝卜素和菌红素;Jehlicka等[20]对嗜盐细菌Salinibacterrubers色素进行定性分析,发现主要色素为α-菌红素。文章以嗜盐菌SalicolamarasensisTG-5为研究对象,对其在不同盐度条件下的色素积聚量进行分析,并对其所产色素进行鉴定,以期该菌株为色素生产菌株的开发应用提供理论基础。

2 实验部分

2.1 菌种来源

嗜盐菌SalicolamarasensisTG-5为实验室从天津滨海新区某盐场结晶池中筛选获得并保存备用。该菌株耐逆性强且生长速度快,在高盐废水处理和高值产品开发等应用方面具有良好的潜力。

2.2 液体培养基

2216E培养基:蛋白胨5 g/L,酵母粉1 g/L,柠檬酸铁0.01 g/L,NaCl 120 g/L(根据盐度需要添加),加入陈海水充分搅拌,调节至pH值7.6～7.8,定容至1 L。121 ℃ 1×105Pa高压灭菌20 min备用。陈海水的制备:将取自天津滨海新区海边的自然海水静置12 h后,使用脱脂棉过滤掉海水中的大颗粒杂质和生物体后备用。

2.3 实验药品和仪器

AL204精密电子天平,赛多利科学仪器(北京)有限公司,FE20实验室pH计,梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;WZS A3盐度计,上海仪电物理光学仪器有限公司;UV-1800紫外分光光度计,日本岛津有限公司;TGL-16M高速台式冷冻离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司;HNY-200B,恒温培养振荡器,天津市欧诺仪器仪表有限公司;YXQ-LS-50SII,立式压力蒸汽灭菌锅,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;LCMS-IT-TOF液质联用仪,日本岛津有限公司。

2.4 实验方法

2.4.1 生长曲线的测定

将菌株TG-5分别接种于盐度梯度为0%～30%、间隔5 %的2216E液体培养基(pH值7.5、接种量10%)中,37 ℃条件下振荡培养数天,直至达到生长稳定期。每个实验组设置3个平行。每隔6 h,取菌液进行生物量测定。生物量的测定方法采用分光光度法,即测定菌液在波长为600 nm时的光吸收值OD600。

2.4.2 培养盐度对色素积聚的影响

分别设置培养盐度为12%、15%、18%、21%、24%、27%、30%七个实验组,按接种量10%(体积比),分别将活化的菌液接种至100 mL 相应盐度的2216E培养基中,37 ℃振荡培养7 d,观察菌株生长情况和色素积聚情况。

色素的提取方法采用有机溶剂提取法,具体操作参照惠寿年等方法[21],并稍作修改。取20 mL菌液,5 000 r/min、4 ℃冷冻离心15 min,弃去上清液,收集菌体。加入适量混合溶剂甲醇 ∶氯仿(0.8 ∶2.1,体积比)反复浸提直至沉淀变为白色,向红色上清液中加入1.5 mL氯仿和1.5 mL水,剧烈振荡30 min,10 000 r/min、4 ℃冷冻离心10 min,收集上层红色上清液,提取全程进行避光操作,避免色素的降解。最后,将色素粗提液置于暗处,待有机溶剂挥发干后,用少许丙酮溶解,低温避光保存备用。用于后续的色素的连续广谱分析、薄层层析分析等。

2.4.3 色素的连续光谱分析

将色素粗提液稀释至一定浓度,以丙酮溶液做空白对照,采用紫外可见分光光度计分析色素粗提液在200～1 000 nm区间内的连续光谱,确定色素的最大吸收波长。以波长为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制出色素的连续吸收光谱图。

根据连续吸收光谱图测定的特殊峰值,测定色素粗提液在这些特定峰值下的相应OD值,通过比较分析可得到不同盐度条件下菌株TG-5的色素积聚量的差异。

2.4.4 色素的薄层层析分析

取10 cm×20 cm的硅胶板GF 254(100 mm×200 mm,青岛鼎康硅胶有限公司),切成10 cm×10 cm的规格大小,先在硅胶板距离最下方1.8 cm处用铅笔画一条直线作为点样处,每隔一定距离做样品标记,吸取嗜盐菌色素粗提液于划线处点样,点的直径不大于2～3 mm,样品点样间隔距离为1.5～2 cm。点样完成后,静置几秒钟待其晾干,将硅胶板缓慢放置于盛有展开剂为石油醚 ∶丙酮=1.5 ∶1(体积比)的层析缸内(层析缸内需提前放入展开剂使层析缸内的空气饱和),浸入深度约为0.5 cm[22]。待展开剂前沿距离顶端约0.5 cm时,将色谱板取出、晾干。平行实验三次并拍照记录。

2.4.5 色素的鉴定分析

将硅胶板上的条带分别刮下,用适量丙酮溶液重悬洗脱色素,经10 000 r/min离心10 min,取上清,重复2～3次洗脱后收集上清液,置于阴暗干燥处待其挥发干后,复溶于甲醇溶液。使用有机滤膜过滤去除溶液中的杂质,稀释1倍即得到待测样品。

色谱的鉴定分析采用质谱直接进样法。利用三氟乙酸调谐液进行调谐,以保证准确性。具体操作条件如下:进样量和进样流速分别为0.3 μL和0.2 mL/min;采用正离子模式采集,雾化气体和干燥气体为氮气。参数设置为MS1的质量扫描范围为100～1 000m/z;喷雾室电压分别为4.5、-3.5 kV;雾化气体(N2)流量1.5 L/min;干燥气体压力106 kPa;检测电压1.57 kV;曲型脱溶剂管(CDL)温度200 ℃,加热模块温度200 ℃,数据处理采用LCMS solution Version 1.1软件进行分析。

3 结果与讨论

3.1 不同盐度条件下菌株TG-5的生长曲线比较

不同盐度条件下菌株TG-5生长曲线见图1。

图1 不同盐度条件下菌株TG-5的生长曲线Fig.1 The growth curves of strain TG-5 under different salinities

在0%～5%盐度条件下,菌株TG-5生长处于停滞状态,生物量低于0.2。而在10%较低盐度和30%较高盐度条件下,培养初期菌株生长迅速,22 h后进入稳定期,生物量分别稳定在0.3和0.6左右,在此盐度条件下菌株的对数生长期较短且生物量较低。而在15%～20%盐度条件下,培养初期菌体迅速生长,且对数生长期较长,无明显稳定期。培养4 d后,生物量的增长速度放缓,生物量分别可达1.2、1.1左右。15 %盐度条件下,培养5 d时,菌株的生长速率和生物量积聚分别为0.26/d和1.4,所以菌株TG-5对培养盐度要求宽泛,最佳生长盐度条件为15 %。当盐度低于10 %时,菌株TG-5的生长明显受到抑制,这表明此时细胞正耐受低渗压力,已经影响到细胞的正常代谢。汪雪婷等[23]发现嗜盐菌HalobacillusfaecisZSTB203在盐度0%～20%范围内均可生长,且在10 %盐度时生长最好;刘翠华等[24]发现嗜盐菌HalomonassubterraneaYZ1的最适生长盐浓度范围为30～150 g/L;而研究中菌株TG-5的生长盐度范围和最佳生长盐度分别为10%～30%和15%,因此培养盐度对不同嗜盐菌株的影响是有差异的,这可能与菌株分离自何种环境有关。

3.2 培养盐度对菌株TG-5色素积累的影响

培养盐度对菌株TG-5胞内色素积聚影响明显,结果见图2。菌株TG-5在不同盐度培养基中,37 ℃摇床培养7 d后,菌液颜色出现明显的差异。在培养盐度为2%～10%区间内,菌液呈淡黄色;当培养盐度升至12%时,菌液颜色发生明显变化,呈红色,这表明菌株TG-5从该盐度开始积累红色色素。随着培养盐度升高,菌液颜色逐渐加深。因此,后续色素分析实验选取盐度从12%开始,间隔3%,设置实验组采用薄层层析技术进行色素组成分析。

图2 不同盐度条件下菌株TG-5的菌液状态Fig.2 Bacterial liquid state of the strain TG-5 under different salinity conditions

不同盐度条件下菌株色素提取液的连续吸收光谱分析结果表明,不同盐度条件下,色素的连续广谱图和其中的特征吸收峰都相似,因此文章中只列出一张图谱,见图3。色素的丙酮提取液的连续广谱图中共有3个特征吸收峰,分别位于388、495、528 nm波长处。Britton等[25]指出菌红素的吸收峰为465、491、522 nm;Strand等[26]发观Micrococcusroseue中的脱水菌红素在丙酮中的吸收峰为370、388、467、493、525 nm;Fong等[27]对Arthrobacteragilis进行色素分析,发现菌红素的吸收峰为468、494、527 nm。与这些已有研究结果相比,推断菌株TG-5在盐度12%～30%条件下积累的红色色素可能为菌红素或者脱水菌红素。

图3 菌株TG-5色素的连续吸收光谱图Fig.3 Pigment continuous absorption spectra pattern of the strain TG-5

在连续吸收光谱图的基础上,针对388、495、528 nm处三个吸收峰,比较分析了不同盐度条件下菌株TG-5的色素积聚量差异,结果见图4。

图4 不同盐度条件下菌株TG-5的色素积聚量差异Fig.4 Difference of pigment accumulation of the strain TG-5 under different salinity conditions

随着盐度的升高,色素积累量呈现先上升后下降的趋势。色素在波长495 nm处吸光度值较高,当盐度为18%时,色素粗提液的吸光值达到最大值0.98,高于15%和21%盐度条件下的色素积累量。其中,盐度30%条件下菌株的色素积累量最少,仅为盐度18%条件下色素积累量的1/5,这可能是由于极高盐条件下,细胞处于极端逆境胁迫状态,胞内代谢活动变缓,色素代谢也受到影响。Kushwaha等[28]发现Haloferaxmediterranei在盐度15%的培养基中菌株的菌红素含量是盐度35%培养基中的14倍;Sui等[29]发现,与20%盐度相比,在15%盐度条件下HalobacteriumstrainSP-2和HalorubrumstrainSP-4两菌株可以积累更多的C50菌红素。研究菌株TG-5在15%、18%盐度条件下积累色素较多,其次是21%盐度条件,盐度过低或过高都不适宜色素的积累。盐度对色素的影响与对生长的影响情况相近。

菌株TG-5色素提取液薄层层析图谱见图5。

图5 不同盐度条件下菌株TG-5的色素薄层层析图谱Fig.5 Pigment thin-layer chromatography pattern of the strain TG-5 at different salinity conditions

TLC结果表明在12%、21%、24%、27%、30%盐度条件下,色素条带只有2条,即T5和T6,硅胶板从上至下,颜色分别为淡粉色和红色;而在15%和18%盐度条件下,色素条带有4条,即T1、T2、T3和T4,硅胶板从上至下,颜色依次为黄色、淡红色、淡红色和红色。不同盐度条件下色素的积聚种类有差别,且积聚量也有差异。在较低盐度条件下,色素由4条条带组成,其中T4条带的颜色最红,表明含量高。而在较高盐度条件下,色素由2条条带组成,其中T6条带较红,表明含量高。根据色素的迁移速率,可知,T5条带和T2条带的位置一致,T6条带和T3条带的位置一致。

3.3 色素的鉴定分析

采用质谱分析法对菌株TG-5色素的TLC图谱中的条带进行定性分析,图中T1、T2、T3、T4条带相对应的质谱图分别见图6。结果表明4条条带质谱图中特征峰的差别不大,这说明4条条带为同一种物质,且为结构相近的衍生物。通过查阅相关文献和数据库比对,可知响应值701m/z代表C50菌红素分子脱掉2分子H2O的结果,故推测T1组分含有双脱水菌红素[26-27]。T2、T3、T4条带的MS结果中皆含有701m/z的峰值,表明这三种条带为双脱水菌红素的衍生物,这与路万龙[22]和侯靖等[30]对嗜盐古菌的色素成分分析结果一致,发现LC-MS结果中均含有响应值704m/z或705m/z,表明含有双脱水菌红素成分。因此,菌株TG-5胞内积聚的色素为C50类胡萝卜素,主要为双脱水菌红素及其衍生物。

图6 不同条带的MS分析(a)T1条带;(b)T2条带;(c)T3条带;(d)T4条带Fig.6 MS analysis of different bands (a)T1 band; (b)T2 band;(c)T3 band; (d)T4 band

4 结论

1)通过比较不同盐度条件下嗜盐菌SalicolamarasensisTG-5的生长曲线,发现该菌株的盐度生长范围为10%～30%,最佳的生长盐度为15%。

2)色素粗提液的连续吸收光谱分析结果表明色素在388、495、528 nm三个波长处有特征吸收峰,推测色素为菌红素及其衍生物;根据特征峰的峰值比较,培养盐度对色素积累的影响明显,盐度18%时菌株色素积聚量最大。

3)利用薄层层析法分析结果表明:不同培养盐度条件下色素组分也有一定的差异。在较低盐度条件下和较高盐度条件下,色素的组分分别为四种和两种。分别对色素组分进行质谱鉴定,结果表明四种组分皆为双脱水菌红素及其衍生物。