蓝光对豚鼠屈光系统发育的影响△

王 宵 栾长霖 孙一帆 杨诗巧 王凯磊 郝 瑞 张 伟

近视是常见的屈光不正类型,近年来患病率不断上升,已成为导致视力下降的主要原因,预计到2050年全球近视率将上升到50%[1]。在屈光度大于-6.00 D的情况下,近视可能会导致视网膜、脉络膜等结构的变化,还会增加青光眼、视网膜脱离和脉络膜新生血管等疾病的风险[2-3]。目前的研究表明,户外活动可以有效抑制近视的发展,可能与户外的光强度和光谱波长有关[4],随着科技发展,电子产品的应用和普及,人类生活的光环境也发生变化,其中视频终端设备的照度和波长对近视的发展亦起着重要的作用[5]。

蓝光波长范围为400～500 nm,是短波长可见光中的主要组成部分,具有较高的能量[6]。短波长蓝光经过屈光系统聚焦在视网膜前,一部分蓝光会被角膜和晶状体所吸收,因此,蓝光对眼球屈光系统各部分都会有一定的影响[7]。本研究通过观察蓝光诱导近视豚鼠眼生物学参数、角膜及视网膜的变化,探究蓝光对豚鼠屈光系统发育的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组处理

18只3周龄雄性三色豚鼠(购自北京金牧阳实验动物养殖公司),体重120～150 g,SPF级,饲养于12 h光照/12 h黑暗周期环境,水和食物可随意获得,均选取右眼为实验眼。豚鼠随机分为对照组、白光镜片诱导近视(LIM)组、蓝光LIM组3组,其中,对照组不做任何干预;在实验开始前,蓝光LIM组和白光LIM组豚鼠均右眼配戴-10.00 D镜片,直至实验结束。蓝光LIM组豚鼠使用波长为420 nm LED灯置于笼子上方,对照组和白光LIM组豚鼠置于色温4 500 K的白色LED灯下,照度均为700 lx,每天12 h光照/12 h黑暗。在干预前及干预2周、4周时,测量所有豚鼠屈光度、眼轴长度、晶状体厚度、视网膜厚度、脉络膜厚度。在实验结束后进行豚鼠角膜荧光染色以及视网膜HE染色。所有动物实验均遵循天津市医学实验动物保护中心的指导原则,动物实验方案经我院动物伦理委员会批准(批号：YSY-DWLL-2022249)。

1.2 屈光度检测

在暗室内,每隔5 min给予豚鼠右眼10 g·L-1复方托吡卡胺滴眼液滴眼,共3次,以达到完全睫状肌麻痹,带状光检影镜(苏州六六医疗器械总厂)测量豚鼠屈光度,以水平和垂直两个子午线方向的球镜度平均值为等效球镜度,重复测量3次,取平均值作为最终屈光度。

1.3 眼轴长度和晶状体厚度测量

采用A/P型眼科超声仪(MD-1000A/P型,天津迈达医学科技有限公司)中的A型探头测量眼轴长度,探头直径5 mm,频率为11 MHz,精确度为0.01 mm。用5 g·L-1盐酸丙美卡因滴眼液对豚鼠进行表面麻醉1～2次,测量过程中探头顶端红点与角膜表面中心垂直轻轻接触,当检测到眼球内结构的清晰痕迹且波形一致时,机器自动读出眼轴长度和晶状体厚度,每只眼球连续测量3次,取平均值作为最终结果。

1.4 角膜曲率测量

使用角膜曲率计(YZ38型,苏州六六医疗器械总厂)测量角膜曲率半径。将一个+8.00 D的镜片贴于曲率计镜筒的前表面,所得结果乘0.451为豚鼠角膜曲率半径[8],连续测量3次取平均值。

1.5 OCT检查

使用400 kHz SS-OCTA仪(BM400K,Towardpi医疗技术有限公司,北京)检查。选择十字扫描方式,以视盘作为中心,绘制距离视盘中心1 000 μm、1 500 μm、2 000 μm的三个交点,在四个象限中共12个位置测量视网膜厚度和脉络膜厚度。其中,脉络膜厚度定义为从视网膜色素上皮的外表面到巩膜内表面的距离,视网膜厚度定义为从内界膜到视网膜色素上皮内表面的距离(图1),取平均值作为最终厚度。

脉络膜厚度：从视网膜色素上皮的外表面(黄线)到巩膜内表面(绿线)的距离;视网膜厚度：从内界膜到视网膜色素上皮内表面(黄线)的距离。标记距离视盘中心1 000 μm、1 500 μm和2 000 μm的三个交叉点,垂直线与黄、绿线相交的点为脉络膜。O示视盘。图1 OCT检测指标的界定

1.6 角膜上皮染色

干预第4周末,在豚鼠右眼表面滴入1 g·L-1荧光素钠,用吸纸吸出多余液体,在裂隙灯钴蓝光下观察角膜上皮情况,并采集图像。

1.7 视网膜HE染色

1.8 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析和作图。豚鼠眼屈光度、眼轴长度、晶状体厚度、视网膜厚度和脉络膜厚度均行Shapiro-Wilk正态分布检验,数据符合正态性分布时使用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用独立样本t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 屈光度变化

干预前,3组豚鼠屈光度间差异无统计学意义(P>0.05)。干预2周时,对照组和蓝光LIM组豚鼠屈光度都向远视轻度漂移,干预4周时远视度数逐渐下降,但在不同时间点间各组内差异均无统计学意义(均为P>0.05)。白光LIM组在干预的4周内屈光度不断下降,干预2周、4周时屈光度与干预前相比,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。干预2周时,白光LIM组豚鼠向近视漂移,与对照组相比差异有统计学意义(t=3.603,P=0.005),并且在干预4周时屈光度不断降低,与干预2周时相比差异有统计学意义(t=6.183,P<0.001),表明LIM模型建立成功。干预2周时,蓝光LIM组豚鼠近视屈光度比白光LIM组低(t=2.863,P=0.017),与对照组相比差异无统计学意义(t=0.853,P=0.413)。干预4周时,蓝光LIM组与白光LIM组相比,豚鼠近视屈光度明显减小(t=4.016,P=0.003),与对照组相比差异无统计学意义(t=1.377,P=0.199)(表1)。

表1 干预前及干预2、4周时各组豚鼠生物学参数

以2周作为时间节点,比较各组豚鼠干预前到干预2周(0-2周)与干预2周到干预4周(2-4周)屈光度变化量情况。对照组豚鼠在0-2周屈光度变化量向远视增加,2-4周变化量向近视发展,组内差异有统计学意义(t=3.241,P=0.009)。白光LIM组豚鼠0-2周变化量向近视发展,在2-4周近视变化量增加,组内差异有统计学意义(t=4.308,P=0.002)。蓝光LIM组豚鼠0-2周基本不变,在2-4周向近视发展,组内差异有统计学意义(t=2.720,P=0.021)。组间相比,白光LIM组豚鼠在0-2周变化量向近视偏移量最大,与对照组、蓝光LIM组豚鼠相比差异均有统计学意义(t=4.349、3.827,P=0.001、0.003);在2-4周所有组豚鼠变化量都向近视发展,白光LIM组与对照组、蓝光LIM组豚鼠相比差异均有统计学意义(t=5.624、2.982,P=0.001、0.014)(表2)。

表2 干预周期内各组参数变化量

所有豚鼠角膜曲率半径随时间均逐渐增长,但在相同时间内3组豚鼠间相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。

2.2 眼轴长度及晶状体厚度变化

干预前,3组豚鼠间眼轴长度、晶状体厚度相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。干预4周内,各组豚鼠眼轴长度及晶状体厚度均有一定程度的增长。干预2周时,与对照组和蓝光LIM组相比,白光LIM组豚鼠眼轴长度更长,差异均有统计学意义(t=3.659、4.422,P=0.004、0.001);而蓝光LIM组与对照组豚鼠眼轴长度相比差异无统计学意义(t=0.496,P=0.630)。干预4周时,白光LIM组豚鼠眼轴长度不断增加,与对照组、蓝光LIM组豚鼠相比差异均有统计学意义(t=4.511、4.371,P=0.001、0.001);蓝光LIM组与对照组豚鼠眼轴长度相比差异无统计学意义(t=0.798,P=0.444)。各组豚鼠晶状体厚度变化趋势与眼轴长度变化趋势基本一致(表1)。

比较干预0-2周与干预2-4周时各组豚鼠眼轴长度变化量情况,结果见表2。对照组和白光LIM组豚鼠在0-2周和2-4周时眼轴长度变化量相似,组内差异均无统计学意义(均为P>0.05)。蓝光LIM组豚鼠2-4周眼轴长度变化量与0-2周相比有所增加,但差异无统计学意义(t=1.672,P=0.126)。组间相比,白光LIM组豚鼠0-2周变化量与对照组、蓝光LIM组豚鼠相比差异均有统计学意义(t=4.876、4.665,P=0.001、0.001);在2-4周所有组豚鼠眼轴长度变化量都增大,白光LIM组与对照组、蓝光LIM组豚鼠相比差异均有统计学意义(t=5.101、2.828,P=0.001、0.018)。

2.3 视网膜厚度及脉络膜厚度变化

在实验周期内,对照组豚鼠的视网膜和脉络膜厚度随时间轻微增厚,但在干预2周和4周组内差异均无统计学意义(均为P>0.05);白光LIM组豚鼠视网膜和脉络膜厚度不断变薄,视网膜厚度在干预4周时与干预前相比差异有统计学意义(P<0.05),脉络膜厚度在干预2周和4周组内与干预前相比差异均有统计学意义(均为P<0.05);蓝光LIM组豚鼠在干预2周时脉络膜厚度增加,视网膜厚度轻度增加;在干预4周时脉络膜停止增厚并变薄,视网膜厚度出现下降,但组内差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。

干预2周时,白光LIM组与对照组豚鼠相比脉络膜厚度变薄(t=3.743,P=0.004),视网膜厚度差异无统计学意义(t=1.622,P=0.136);蓝光LIM组与白光LIM组相比,脉络膜厚度轻度增厚(t=2.898,P=0.016),视网膜厚度差异无统计学意义(t=2.161,P=0.056);蓝光LIM组与对照组豚鼠相比,视网膜、脉络膜厚度差异均无统计学意义(t=0.539、0.391,P=0.603、0.734)(表1)。

干预4周时,白光LIM组与对照组豚鼠相比脉络膜厚度继续变薄(t=6.484,P<0.001),并且视网膜厚度也明显下降(t=5.596,P<0.001);蓝光LIM组与白光LIM组豚鼠相比具有更厚的脉络膜(t=5.435,P<0.001)和视网膜(t=1.139,P=0.281);蓝光LIM组与对照组豚鼠相比,视网膜、脉络膜厚度差异均无统计学意义(t=1.139、1.083,P=0.281、0.304)(表1)。

比较干预0-2周与干预2-4周时各组豚鼠视网膜厚度、脉络膜厚度变化量情况,结果见表2。对照组和白光LIM组豚鼠在0-2周与2-4周时,视网膜厚度和脉络膜厚度的变化量几乎不变或轻微增加,组内差异均无统计学意义(均为P>0.05)。蓝光LIM组豚鼠2-4周时视网膜厚度、脉络膜厚度的变化量与0-2周变化量相比明显下降,但组内差异均无统计学意义(P=0.124、0.068)。组间相比,0-2周时白光LIM组与蓝光LIM组豚鼠脉络膜厚度变化量差异有统计学意义(t=3.765,P=0.004),视网膜厚度变化量差异无统计学意义(t=2.096,P=0.062);蓝光LIM组与对照组豚鼠相比,视网膜厚度、脉络膜厚度变化量差异均无统计学意义(均为P>0.05)。2-4周时视网膜厚度、脉络膜厚度变化量各组间相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

2.4 角膜的变化

干预4周时行角膜上皮荧光染色,结果显示,对照组、白光LIM组豚鼠角膜上皮光滑,角膜染色呈阴性;蓝光LIM组豚鼠角膜染色呈阳性,可见明显的角膜损伤(图2)。

A：对照组;B：白光LIM组;C：蓝光LIM组。图2 各组豚鼠角膜上皮荧光染色

2.5 对视网膜的影响

干预4周时,对照组和白光LIM组豚鼠视网膜各层边界清晰,神经节细胞形态正常,未见明显异常,内核层、外核层细胞排列整齐,界限清晰。蓝光LIM组豚鼠视网膜可见神经节细胞层边界不清晰,神经节细胞数量减少,核膜不完整,见核固缩;内核层、外核层细胞排列稀疏紊乱,视网膜色素上皮层厚度变薄(图3)。

A：对照组;B：白光LIM组;C：蓝光LIM组。GCL：神经节细胞层;INL：内核层;ONL：外核层;RPE：视网膜色素上皮层。图3 各组豚鼠视网膜HE染色结果

3 讨论

近视是最常见的屈光不正类型,影响范围广,病因复杂,当发展为高度近视时,常出现严重的并发症[1-3]。随着电子设备的普及,照明环境对屈光不正的影响越来越显著[5-6,9]。眼球在出生后经历正视化,通过反馈机制调节眼轴生长,使视觉焦点保持在视网膜上[10-12]。在近视的发展中,眼球的生物学参数会发生相应的变化,通常会引起更长的眼轴、更薄的脉络膜和巩膜[12-13]。

以往研究显示,蓝光照射会抑制眼轴的延长和近视的发展,但其潜在的机制仍存在争议,推测可能因为蓝光为短波长光,经屈光系统后,其焦点聚焦在视网膜前,产生的近视性离焦或纵向色差(LCA)通过反馈机制抑制了眼球的伸长[14-16]。脉络膜主要由血管组成,为视网膜和巩膜提供丰富的血液和氧气,越来越多的证据表明,脉络膜厚度与近视呈现显著的负相关,脉络膜厚度越薄通常近视度数越高,表明其在近视中的关键作用[12-13]。本研究也观察到类似的现象：蓝光可以抑制眼轴的过度伸长,抑制屈光度向近视漂移,并且增加了脉络膜的厚度。

但在本研究中,我们发现蓝光抑制近视发展的效果随光照时间发生改变,在干预的0-2周内,蓝光LIM组豚鼠抑制近视的效果与时间呈正相关,而在干预2-4周时其屈光度降低,视网膜厚度变化量与0-2周相比明显下降,脉络膜厚度也停止增加。通过角膜荧光染色和视网膜HE染色观察到角膜上皮的损伤和视网膜结构的改变。蓝光是短波长光,具有较高的能量,在以往的研究中,研究者通常使用12 h光照/12 h黑暗周期作为诱导视网膜损伤的一种实验方法,已被证明会导致感光细胞功能障碍,继而导致邻近组织微环境中炎症和血管生成的失衡,产生的脂质过氧化物可引起角膜上皮细胞炎症反应[16-20]。因此,我们推测是由于蓝光的高能量对视网膜造成损伤,破坏角膜或视网膜结构,引起某些影响近视的关键细胞凋亡,继而对抑制近视的效果产生影响,但具体的机制还需要进一步研究。

在本实验中,我们观察到了在近视诱导的情况下,蓝光对豚鼠屈光系统发育的影响。目前的结果表明,蓝光能够抑制近视的发展,减少眼轴的延长,增加脉络膜的厚度,这与先前研究中观察到的现象一致[21]。然而,延长到4周的蓝光光照并没有带来更大的抑制变化量,提示蓝光抑制近视发展存在LCA以外的原因。在目前的研究中,可能的原因有：蓝光引起视网膜多巴胺水平升高[22],降低视网膜维甲酸水平[15],刺激视网膜神经节细胞对蓝光敏感的黑视素蛋白[23]等。据de Moraes等[24]的研究报道,蓝光可以调节超氧化物歧化酶,诱导大鼠主动脉环的血管扩张,提示实验中观察到的脉络膜厚度增加可能是蓝光影响了脉络膜血管,从而影响脉络膜和视网膜的厚度,但具体机制仍需进一步研究。由于个体发育的差异,我们仅对不同组别内实验动物相关的生物学参数进行了发育相关的对照和统计,而且从实验结果来看,不同组内实验动物屈光结果的变化不仅仅与眼轴本身的生长发育有关,可能还与晶状体厚度、脉络膜厚度等结构的生长和发育有相关性[11-13,21],因而得出了本文的结论。目前的研究结果仍具有一些局限性,与人类相比,豚鼠的眼睛相对较小,角膜曲率不同,这可能会导致不同的光学特性和视觉偏差。因此,在进行近视研究时,需要将豚鼠模型的结果与其他模型或观察数据结合起来考虑,以便更全面地了解蓝光对近视患者的影响。

4 结论

蓝光抑制了眼轴的伸长,减缓了屈光度向近视漂移,并且增加了脉络膜厚度,提示蓝光可能通过脉络膜相关机制影响近视的发展,但其抑制近视的效果并不随蓝光暴露时间的延长而增加。长期的蓝光照射还会引起角膜上皮及视网膜的损伤。由此可以推测,蓝光抑制近视的效果并不与时间呈单纯的正相关,长期的蓝光照射可能会影响眼球内的近视相关细胞或蛋白,从而降低抑制效果。在未来的研究中,需要更精确最佳的蓝光照射时间,探究对抑制近视发展的最有效蓝光阈值。