小西葫芦黄花叶病毒甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆

刘莉铭，彭 斌，康保珊，吴会杰，刘 茜，古勤生

（1.河南省果树瓜类生物学重点实验室·中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009；2.中国农业科学院中原研究中心 河南新乡 453500）

小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）属于马铃薯Y 病毒属（Potyvirus），通过蚜虫、机械接触和种子进行传播，主要侵染甜瓜、黄瓜、西瓜、西葫芦等瓜类作物，引起植株生长缓慢、矮化、花叶、蕨叶、新叶变小、果实畸形等，造成巨大经济损失，严重制约瓜果产业的可持续发展。该病毒于1981 年在意大利首次发现[1]，1991 年在我国新疆首次报道[2]，目前在世界范围内广泛分布[3-4]。

获得ZYMV 不同分离物的序列信息，分析其系统进化关系，可以了解它们的发生、起源及变异规律，为防控病害发生提供重要理论依据[5-15]。病毒侵染性克隆的获得使RNA 病毒能够在DNA 水平上应用基因工程手段研究病毒各基因功能及致病机制。前期笔者团队（中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组）从河南临颖的甜瓜发病植株中分离获得ZYMV 分离物CH99/87（CH-87），并对其外壳蛋白基因进行了克隆和序列分析[16]。笔者在此基础上拟通过扩增获得该分离物的全基因组序列，以分析与其他ZYMV 分离物之间的序列一致性和系统进化关系，为深入开展该病毒的遗传多样性分析和进化机制研究奠定基础。同时通过构建全长cDNA 克隆，分析该克隆在不同瓜类作物上的侵染性，为在瓜类作物上开展该病毒的分子致病性和寄主抗病性等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2021 年4—9 月在中国农业科学院郑州果树研究所进行，ZYMV 分离物CH-87 分离自甜瓜发病植株，由中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组鉴定和保存。

1.2 载体构建

取约0.1 g 甜瓜发病叶片，提取叶片总RNA并合成cDNA，具体操作参照RNAsimple 总RNA 提取试剂盒和PrimeScript ™RT reagent Kit with gDNA Eraser 说明书。根据NCBI 数据库中已知ZYMV 分离物的全基因组序列信息，设计4 对引物HF-Z-1F/Z-1R、Z-2F/Z-2R、Z-3F/Z-3R、Z-4F/HF-Z-4R（表1），以cDNA 为模板，对分离物CH99/87 的全基因组进行分段扩增。利用NEBuilder 高保真DNA 组装预混液将获得的4 个PCR 产物与经StuI 和SmaI 双酶切处理的植物表达载体pXT1（由南京农业大学陶小荣教授馈赠）进行同源重组、转化、菌液PCR 筛选、测序验证，最终获得含有 CH- 87 全基因组的 cDNA 克隆pXT1-ZYMV。

表1 试验所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3 序列分析

对pXT1-ZYMV 进行测序、拼接，获得CH-87分离物的全基因组序列。利用Mega X 中的Clustal W 对CH-87 分离物与NCBI 数据库中已知ZYMV 分离物的序列进行比对，再用BioEdit软件进行序列一致性分析[17]。以西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus，WMV，AY437609）为外组，分别基于CP 蛋白和多聚蛋白的氨基酸序列，利用Mega X 软件中的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）对ZYMV 分离物进行系统进化分析[18]。

1.4 侵染性分析

试验于2021 年6—8 月在中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组温室进行。其中，甜瓜品种为白玫，由新疆农业科学院哈密瓜研究中心提供；黄瓜品种为津研4 号，种子购自天津科润农业科技股份有限公司；西瓜品种为郑抗2 号，由中国农业科学院郑州果树研究所提供；西葫芦品种为欧诺，种子购自太谷区雨润谷禾种业有限公司。当以上瓜类作物植株培养至子叶完全展开时用于试验。将pXT1-ZYMV 利用液氮冻融法转入农杆菌GV3101 菌株中，利用菌液PCR 筛选获得阳性克隆，随后进行扩大培养和接种检测，并将发病叶片进一步进行摩擦接种分析，每次接种甜瓜、黄瓜、西瓜、西葫芦各8 株，3 次重复，以接种诱导缓冲液的植株为对照，具体农杆菌培养、诱导和接种方法参照刘莉铭等[19]。待接种28 d 后，利用引物Z-8284F/Z-T7-9337R 对发病叶片进行RT-PCR 扩增，分析pXT1-ZYMV 在不同瓜类作物中的侵染性，以Z-8927F/Z-T7-9337R 为引物，对CH-87 分离物基因组的8927～9337 nt 区域进行扩增，PCR 产物经体外转录获得地高辛标记的RNA 探针，利用dot blot方法进一步检测植株叶片中ZYMV 的侵染情况。

2 结果与分析

2.1 ZYMV分离物CH-87的基因组

CH-87 基因组全长为9592 nt，它的5’UTR 和3’UTR 分别对应基因组的1～138 nt 和9382～9592 nt，全基因组编码1 个由3080 个氨基酸组成的多聚蛋白（139～9381nt，9243nt），经蛋白酶切割，形成10个成熟的蛋 白 质，包 括P1（139～1068 nt，930 nt，310 aa）、HC-Pro（1069～2436 nt，1368 nt，456 aa）、P3（2437～3474 nt，1038 nt，346 aa）、6K1（3475～3630 nt，156 nt，52 aa）、CI（3631～5532 nt，1902nt，634 aa）、6K2（5533～5691 nt，159 nt，53 aa）、NIa-VPg（5692～6261 nt，570 nt，190 aa）、NIa-Pro（6262～6990 nt，729 nt，243 aa）、NIb（6991～8541 nt，1551 nt，517 aa）和CP（8542～9378 nt，837 nt，279 aa），P3 编码区内部通过+2 移码产生PIPO（2889～3122 nt，234 nt）。其具体基因组结构如图1 所示，GenBank 登录号为MN296124。

图1 ZYMV 分离物CH-87 的基因组结构示意图Fig.1 Schematic representation of ZYMV isolate CH-87 genome organization

2.2 分离物CH-87序列分析

序列一致性分析表明，分离物CH-87 与其他分离物的全基因组核苷酸序列一致性平均值为91.42%，与美国BL-67 分离物一致性最高，为97.60%，与韩国分离物KR-PE 和KR-PS 一致性次之，与澳大利亚分离物Gld-1 和Knx-22 一致性最低（表2）。分离物CH-87 与其他分离物的多聚蛋白氨基酸序列一致性平均值为96.45%，与美国BL-67分离物一致性最高，为99.30%，与韩国分离物BR1一致性次之，与新加坡分离物Singapore 一致性最低（表2）。

表2 ZYMV 分离物CH-87 与其他分离物全基因组核苷酸和氨基酸的序列一致性Table 2 The identity of nucleotide sequences and amino acid sequences of complete genome between ZYMV isolate CH-87 and other isolates

基于ZYMV CP 蛋白氨基酸序列的系统进化分析结果显示，供试45 个ZYMV 分离物可以分为A、B 两组，A 组由来自17 个国家的40 个分离物组成，B 组由来自新加坡和澳大利亚的西瓜和西葫芦分离物组成（图2）。其中，A 组进一步聚类为5个亚组I～V。亚组I由来自斯洛伐克、印度、捷克、西班牙、埃及、阿根廷、伊朗、土耳其、伊拉克、以色列、澳大利亚和中国台湾的西葫芦、大豆、西印度黄瓜、笋瓜、南瓜、黄瓜和甜瓜分离物组成，亚组Ⅱ由来自澳大利亚和日本的西瓜、黄瓜、西葫芦、帽儿瓜分离物组成，亚组Ⅲ由来自意大利、澳大利亚和特立尼达和多巴哥的西葫芦、甜瓜和南瓜分离物组成，亚组Ⅳ由来自土耳其、韩国和中国的西葫芦和南瓜分离物组成，亚组V由来自韩国、中国和美国的甜瓜、南瓜、丝瓜和芝麻分离物组成。而笔者获得的CH-87 分离物与美国南瓜分离物（BL-67）亲缘关系最近，与中国丝瓜分离物（CN∶Lc∶17）、芝麻分离物（zz）和韩国的3 个南瓜分离物（BR1、KR-PE、KR-PS）亲缘关系次之，它们均聚于亚组V中（图2）。

图2 基于CP 蛋白氨基酸序列的ZYMV 分离物系统进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of ZYMV isolates based on the amino acid sequences of CP

基于ZYMV 多聚蛋白氨基酸序列的系统进化分析结果显示，供试ZYMV 分离物也可以分为2 组（图3），与图2 系统进化分析结果相比，两者的B 组分离物成员一致，A 组亚组成员组成中有所差异，其中，CH-87 分离物与美国南瓜分离物（BL-67）亲缘关系最近，与中国丝瓜分离物（CN∶Lc∶17）亲缘关系次之，而与中国芝麻分离物（zz）和韩国的3 个南瓜分离物亲缘关系稍远。

图3 基于多聚蛋白氨基酸序列的ZYMV 分离物系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of ZYMV isolates based on the amino acid sequences of ployprotein

2.3 分离物CH-87全长cDNA克隆的侵染性

将CH-87 的全长cDNA 克隆pXT1-ZYMV 经农杆菌介导的方法接种甜瓜、黄瓜、西瓜和西葫芦植株。接种后1 周左右，甜瓜接种植株开始产生花叶症状，接种后2 周左右，甜瓜花叶明显，黄瓜、西瓜和西葫芦接种植株开始产生症状（图4-A）。随着接种时间的延长，甜瓜、西瓜和西葫芦接种植株发病逐渐严重，植株矮化明显，叶片花叶严重、畸形、叶缘呈锯齿状（图4-B）。利用一步RT-PCR 方法对发病植株中ZYMV 的侵染情况进行检测，并经dot blot 进一步分析，确认发病植株均被ZYMV 所侵染（图4-C～D）。将甜瓜发病叶片通过摩擦接种方式进一步接种甜瓜和西瓜植株，在接种后1～2 周，所有接种植株也均可发病，经PCR 分析进一步证实了ZYMV 的侵染。以上结果说明分离物CH-87 的侵染性克隆构建成功，该克隆在4 种供试瓜类作物上均可系统侵染，并产生典型的花叶症状。

3 讨论与结论

笔者基于CP 蛋白和多聚蛋白的氨基酸序列对ZYMV 进行了系统进化分析，发现亚洲的日本、新加坡、韩国、以色列、伊朗、印度、中国、伊拉克、土耳其分离物分散分布于A 组中的3 个或4 个亚组和B 组中，欧洲的斯洛伐克、捷克、西班牙、意大利分离物分布于A 组中的2 个亚组中，而来自不同国家和地区的多个寄主分离物则分散分布于A 组各亚组或B 组中，即各组是有多个来自不同寄主的分离物组成，而并非由单个寄主分离物组成，说明ZYMV 在进化上与地域差异和寄主范围不相关，与付晶晶等[11]报道一致。另外，通过对比本研究的两组系统进化分析结果，发现CH-87 分离物与zz、KR-PA、KR-PS、KR-PE 等这些分离物的亲缘关系远近有所差异。已有研究者发现，基于单一区域序列的分析难以准确反映马铃薯Y 病毒属成员的系统进化关系[13，20-21]，笔者在本研究中进一步证实了基于单一区域序列进行进化分析的局限性。

针对ZYMV 序列进行的多项研究表明，不同分离物之间存在不同程度的序列差异，其中尤以P1 保守性最差[12-13，22]。ZYMV 侵染性克隆的获得使人们可以开展该病毒分子致病性相关工作，以揭示不同分离物之间的序列差异在病毒致病性中所起的作用及对寄主范围的影响。目前已有ZYMV 侵染性克隆成功构建的报道[23-25]，笔者在本研究中针对甜瓜分离物CH-87 进行了侵染性克隆的构建，并通过接种试验证实了该克隆在4 种瓜类作物上的适用性。另外，在此侵染性克隆的基础上，笔者已成功表达了eGFP 报告基因[19]。笔者的试验对该分离物的基因组信息的详细描述和系统分析为更好地将该分离物的侵染性克隆和eGFP 重组克隆应用于瓜类作物相关研究提供了基础。