芥子咳喘贴早期安全性评价实验研究

王道涵 袁晓雯 乔艳雪 赵荣华 王素梅 马雅銮

(1 北京中医药大学东方医院儿科,北京,100078; 2 中国中医科学院中医基础理论研究所,北京,100700; 3 中国中医科学院中药研究所,北京,100700)

小儿支气管炎是常见的小儿下呼吸道疾病之一,可由病毒和(或)细菌感染,过敏原刺激以及各种理化因素导致支气管黏膜损伤而出现的急慢性炎症。本病预后轻重差别大,小年龄患儿在某些病原体感染后临床表现较重,预后较差[1-2]。本病西医治疗以对症处理为主,多依靠口服或静脉给药,由于患儿依从性较差,且部分药物存在一定不良反应,症状短期内难以得到理想控制。中医将本病归属“咳嗽”范畴，历代医家非常重视外治法的应用，其中，中药贴敷技术历史传承悠久，其通过精准取穴、经皮给药，避免了药物在体内的首过效应，具有维持有效药物浓度时间长，不良反应小的优点[3-4]。国家级名老中医、著名中医儿科专家王素梅教授经古方优化及工艺改进，创制而成的芥子咳喘贴是一种治疗小儿支气管炎的有效外用贴剂。为评价该贴剂的安全性，本实验拟对其进行皮肤急性毒性、皮肤刺激性及皮肤过敏相关试验研究，为临床试验提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康日本大耳白兔20只,体质量2 500～3 000 g;健康Hartley豚鼠30只,体质量250～300 g,受试动物均为清洁级,雌雄各半,购自北京昌扬西山养殖场,实验动物合格证号:SCXK(京)2011-0010。饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物中心,实验动物使用许可证号:SCXK(京)2010-0032。动物饲养室条件:温度22～25 ℃,湿度40%～60%,通风良好。本实验经北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会批准(伦理审批号:202022)。

1.1.2 实验药物与试剂 芥子咳喘贴,组方:白芥子、延胡索、细辛、干姜、冰片、紫草、甘草,购自北京中医药大学东方医院中药房,经北京中医药大学中药学院谭鹏副教授负责鉴定;赋形剂,由北京中医药大学中药学院提供。

1.1.3 试剂与仪器 2,4-二硝基氯代苯丙酮液(上海梯希爱化成工业发展有限公司,批号:47HAM-HM);总胆固醇(Total Cholesterol,TC)试剂盒(批号:CH0101152),三酰甘油(Triglyceride,TG)试剂盒(批号:CH0101151),高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein,HDL)试剂盒(批号:CH0101161),低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)试剂盒(批号:CH0101162),谷丙转氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)试剂盒(批号:CH0101201),谷草转氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)试剂盒(批号:CH0101202),以上试剂盒均购自四川迈克生物科技公司。尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)试剂盒(批号:HY-N0015),肌酐(Creatinine,CRE)试剂盒(批号:HY-N0017),以上试剂盒购自北京华英生物技术研究所;尿酸(Uric Acid,UA)试剂盒(批号:C01221),购自南京建成生物工程研究所;苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色试剂(批号:G1120),购自北京索莱宝有限公司;全自动生化分析仪(Beckman Coulter公司,美国,型号:CX4);型电子分析天平(METTLER TOLEDO公司,瑞士,型号:LE204E);手提式高压灭菌锅(上海比朗仪器有限公司,型号:YXQ-SG46-280);宠物电推剪(深圳市科德士电子厂,型号:CP-9600)。

1.2 方法

1.2.1 皮肤用药急性毒性试验 选择日本大耳白兔12只,雌雄各半,试验前24 h将日本大耳白兔臀背部沿脊柱两侧脱毛,每侧脱毛面积约15 cm×10 cm,脱毛后检查有无皮肤划伤并剔除划伤者。给药当日随机分为3组并施药物,每组4只。空白对照组(赋形剂2 g/只)、芥子咳喘贴常规剂量组(2 g/只)、芥子咳喘贴高剂量组(8 g/只),药物均匀涂抹于脱毛区,用油纸、纱布、胶布固定,单笼饲养,每日2次,2次用药间隔6 h,包扎24 h后温水洗净,分别于给药前、给药后第3天、第7天观察日本大耳白兔全身中毒表现,包括呼吸,四肢活动,体质量,皮肤,毛发,眼睛,黏膜,脊神经等变化[5-6]。第8天将所有日本大耳白兔心脏取血,取血前禁食12 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后开胸暴露心脏,用10 mL注射器经左心室抽取血液标本5 mL,测定各组血生化指标并比较组间差异[7-8]。

1.2.2 单次给药完整皮肤刺激试验 选择日本大耳白兔4只,雌雄各半,脱毛方法参照1.2.1。给药当日每只日本大耳白兔分别沿脊柱左侧脱毛区涂以低剂量芥子咳喘贴1 g,右侧涂以等量赋形剂作为赋形剂侧,包扎24 h后温水洗净,并于1、24、48、72 h观察日本大耳白兔皮肤有无红斑、水肿现象,以及上述变化的恢复情况和时间,并与赋形剂侧进行比较。试验结果按皮肤刺激性反应评分标准进行评分,计算平均分值,进行刺激强度评价[9-10]。见表1～2。

表1 皮肤刺激性及过敏反应评分标准

表2 皮肤刺激强度评价标准

1.2.3 多次给药完整皮肤刺激试验 选择日本大耳白兔4只,雌雄各半,脱毛及给药方式参照1.2.2,1次/d,连续7 d,最后1次给药24 h后温水洗净,并于1、24、48、72 h观察日本大耳白兔皮肤有无红斑、水肿,涂抹部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙、皮肤菲薄,以及上述变化的恢复情况和时间,并与赋形剂侧进行比较。试验结果按皮肤刺激性反应评分标准进行评分,计算平均分值,进行刺激强度评价。见表1～2。

1.2.4 皮肤过敏试验 选择Hartley豚鼠30只,雌雄各半。试验前24 h将Hartley豚鼠背部沿脊柱两侧脱毛,每侧脱毛面积3 cm×3 cm。随机分为3组并施以药物,即:空白对照组、阳性对照组、芥子咳喘贴组,每组10只。致敏接触:取芥子贴膏剂0.2 g涂于动物左侧脱毛区,用一层油纸及二层纱布覆盖固定,持续6 h后温水洗净,后于第7、14天以同样方式重复给药1次,共3次。空白对照组和阳性对照组以同样方式分别涂赋形剂0.2 g和2,4-二硝基氯代苯丙酮液0.2 mL。激发方法:末次致敏后,将3种药物分别等量涂于各自组别动物右侧脱毛区,6 h后温水洗净,分别于去除药物后6、24、48、72 h观察皮肤过敏情况,进行皮肤过敏反应评分和皮肤致敏性评价[11]。见表1,表3。

表3 皮肤致敏性评价标准

2 结果

2.1 急性毒性试验对日本大耳白兔一般状况影响 给药期间及停药后,各组日本大耳白兔发育正常,毛发光泽,反应机敏,呼吸平稳,饮水、摄食及排便、排尿正常,天然孔道无异常分泌物。动物行为、肌肉紧张力等均未见异常表现。动物眼结膜、口腔黏膜和气道黏膜未见有分泌物、充血、发绀、黄疸等现象。未见眼睑下垂,眼球突出、震颤和混浊。各组无动物死亡。

2.2 急性毒性试验对日本大耳白兔体质量、大体解剖状况影响 5各组动物体质量平稳增长,给药前、给药3 d后和给药7 d后各组日本大耳白兔体质量差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。日本大耳白兔皮肤、脊神经及各脏器未见明显异常改变。见图1。

图1 各组用药后各组织病理学检测结果(HE染色,×100)

表4 芥子咳喘贴对日本大耳白兔体质量的影响

2.3 急性毒性试验对日本大耳白兔脏器质量及脏器系数影响 与空白对照组和芥子咳喘贴常规剂量组比较,芥子咳喘贴高剂量组肝脏质量明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,芥子咳喘贴高剂量组肺脏质量明显增加(P<0.05),左右肾脏质量明显降低(P<0.05);与空白对照组和芥子咳喘贴常规剂量组比较,芥子咳喘贴高剂量组肝脏脏器系数明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,芥子咳喘贴高剂量左右肾脏脏器系数明显降低(P<0.05),芥子咳喘贴常规剂量组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5～6。

表5 各组日本大耳白兔脏器质量比较

表6 各组日本大耳白兔脏器系数比较

2.4 急性毒性试验对日本大耳白兔血生化指标影响 各组日本大耳白兔血脂(TC、TG、HDL、LDL)、肝功(GPT、GOT)及肾功(BUN、CRE、UA)差异无统计学意义(P>0.05)。见表7～8。

表7 各组日本大耳白兔血脂指标比较

表8 各组日本大耳白兔肝肾功指标比较

2.5 完整皮肤刺激试验结果 单次给药结果显示,全部日本大耳白兔皮肤在各观察时间点均未出现红斑、水肿,两侧皮肤刺激评分均为0。多次给药结果显示,3只日本大耳白兔皮肤在各观察时间点均未出现红斑、水肿,两侧皮肤刺激评分均为0;1只兔子给药4 d后,芥子咳喘贴侧皮肤出现明显可见红斑及水肿,给药7 d后,该侧红斑增多,呈紫红色并有焦痂,赋形剂侧皮肤出现中度到严重红斑,停药24 h后,芥子咳喘贴侧与赋形剂侧红斑数量比为20∶5。停药72 h后,芥子咳喘贴侧红斑好转,赋形剂侧红斑加重,二者红斑数量比为20∶25,其刺激强度平均分值1.5,为轻度刺激。试验期间各组日本大耳白兔均未出现死亡。

2.6 皮肤过敏试验结果 芥子咳喘贴组、空白对照组均未引起Hartley豚鼠皮肤出现红斑、水肿等过敏反应,致敏率均为0。阳性对照组所有Hartley豚鼠在激发6 h后出现皮肤红斑、水肿,涂抹部位未出现色素沉着、出血点、皮肤粗糙、皮肤菲薄,部分Hartley豚鼠出现中度到严重红斑,水肿隆起超过1 mm,反应级数为3级,48 h后上述过敏症状出现减轻反应级数为2级,72 h后明显消退,表现为轻度红斑、水肿,反应级数为1级。试验期间各组Hartley豚鼠均未出现休克和死亡。

3 讨论

芥子咳喘贴处方灵感来源于明末清初医家张璐所著《张氏医通》里“白芥子散”组方,该贴剂的多个衍生方在临床广泛用于小儿急性支气管炎、咳嗽变异性哮喘、反复呼吸道感染的治疗[12-14]。临床研究证实,芥子咳喘贴适宜小儿急性支气管炎属肺经蕴热证型,对咳嗽、咯痰、喘促症状具有显著治疗作用[15]。药效学研究显示,芥子咳喘贴具有明显的镇咳、祛痰作用。在抗炎方面,常规剂量组对部分炎症介质,如单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素-6具有一定程度抑制作用[16]。

本方以白芥子为君药,主要成分为白芥子苷、芥子碱和脂肪酸等,其药理成分白芥子苷通过分解产生硫代异氰酸对羟苄酯,为强力皮肤发红剂,该化学物质经穴位给药透皮量和稳定透皮速率较高,且药物经穴位的透过量稳态透皮速率更高,穴位皮肤滞留量显著高于非穴位皮肤[17-18]。是促进全方经皮吸收、提高疗效的重要保证[19]。硫代异氰酸对羟苄酯对皮肤刺激作用的层次不同,超剂量或皮肤给药时间过长可造成皮肤刺激损伤或过敏反应[20]。

急毒结果显示,芥子咳喘贴对日本大耳白兔一般状况无显著影响,给药期间及停药后,各组日本大耳白兔生理发育、机体代谢及行为活动等各项指标正常。高剂量组对日本大耳白兔肝脏、肺脏、左右肾脏质量和脏器系数有一定影响,表现为肺脏质量增加,肝脏、左右肾脏质量和脏器系数减少,但各组血生化指标并未出现显著差异,说明芥子咳喘贴高剂量对某些脏器发育具有一定抑制作用,但短期给药未出现脏器功能损害。

皮肤过敏试验结果显示,芥子咳喘贴对Hartley豚鼠无明显过敏反应;单次给药完整皮肤试验结果显示,芥子咳喘贴对日本大耳白兔无明显皮肤刺激反应。多次给药完整皮肤试验结果显示,从第4天起,部分日本大耳白兔皮肤出现红斑及水肿,停药3 d后皮损逐渐减轻;表明芥子咳喘贴多次给药对日本大耳白兔皮肤具有一定刺激性,考虑到动物与人体皮肤结构不同,药物透皮吸收速率不同,故经人体皮肤给药后出现皮损的时间、程度以及预后可能与本试验结果有所差异,提示临床如需要多次给药,应合理安排给药间隔时间,以连续给药不超过3 d为宜,避免皮肤刺激发生。

本研究表明芥子咳喘贴是一种安全性较高的外用贴剂,预期临床应用安全性良好,上述结果可为临床推广提供可资借鉴的参考依据。不足的是,本研究并未进行药物长期毒性试验,难以全面评估药物对重要脏器是否具有远期损伤以及评估毒性反应剂量。课题组将在下阶段组方优化中进一步完善相关研究。

利益冲突声明:所有作者声明不存在利益冲突关系。