琼脂扩散法用于放线菌源生防菌剂筛选的活性影响因素

张志刚，王开梅，吴兆圆，万中义，方 伟

（湖北省生物农药工程研究中心/湖北省农业科技创新中心生物农药分中心，武汉 430064）

在使用化合物或提取物进行杀菌活性测试体系中，活性化合物处于持续降解中，而病原菌处于持续增殖的进程中，直接使用活性成分进行测试需要较高的浓度才能显示出稳定的活性。因此，提高筛选体系敏感度的常用方法是提取、浓缩。在生防杀菌剂的筛选中，提取和浓缩也只能反映生防菌的部分效果。在琼脂扩散法中使用含有活菌的发酵液，解决了活性成分浓度持续降低而靶标持续增殖引起的假阴性难题。样品菌能保持持续生长，活性物质总量也保持持续增长，解决了活性成分的分解和培养基对活性成分稀释的问题，且无需采用提取、浓缩等通用方法，简化了筛选流程，也降低了筛选成本。琼脂扩散法为靶标病原菌和发酵液样品中的活菌（放线菌）同时提供了持续生长的条件。在靶标病原菌持续扩增的同时，发酵液中的活性成分也在持续产生。因此，含有活菌的放线菌源样品中不仅包括代谢产物（活性化合物），而且在测试的培养过程中，代谢产物还在持续产生。所以在使用琼脂扩散法对化合物测试时，随着培养时间的延长，化合物的浓度会降低，抑菌圈会缩小或者消失。因此，在对含有活菌的样品进行测试时，影响活性反应的因素就更加多样。使用琼脂扩散法对生防杀菌剂样品进行的测试，更接近生防菌在实际应用中的状态。由于靶标菌和样品（含有活菌）都处于动态变化中，为了反映含有活菌发酵液的真实活性，减少漏筛，必须对活性反应的影响因子进行深入了解，进而进行合理地调控。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物病原菌 胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeobosporioides）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）、西瓜猝倒病菌（Pythium aphanidematum），菌种由湖北省生物农药工程研究中心微生物资源研究室保存，菌株长期保存条件为-80 ℃，用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行活化传代后用于试验。

1.1.2 培养基 全营养固体培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基粉40 g/L，美国BD 公司）、半营养固体培养基（马铃薯葡萄糖无琼脂培养基粉12 g/L，美国BD 公司；琼脂粉15 g/L，DH010-4 型，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）、全营养液体培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基粉24 g/L，美国BD 公司）、水琼脂培养基（琼脂粉15 g/L，DH010-4 型，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。

1.1.3 标准品及测试用放线菌菌株 标准品有咪鲜胺（Prochloraz，99.5%）、甲霜灵（Metalaxyl，99.7%）；测试用放线菌菌株有A17815、A22193、A65560，阴性对照菌株为A50052。

1.1.4 放线菌发酵液 放线菌发酵液由湖北省生物农药工程研究中心微生物资源研究室提供。发酵培养基配方为HB-M-19：葡萄糖5.0 g/L，可溶性淀粉40.0 g/L，玉米粉15.0 g/L，豆饼粉25.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，硫酸铵0.5 g/L，溶于约950 mL 无菌水中，调节pH 7.0，用无菌水调节至1 000 mL。

1.1.5 主要仪器、设备 台式振荡器、血球计数板、移液器、光学显微镜、DH-S10 型手持式组织匀桨机、手持式红外测温仪、超声波振荡器、牛津杯［（外径×内径×高），7.8 mm×6.0 mm×10.0 mm］、100 mm×100 mm 方形培养板、恒温培养箱、台式离心机（EPPENDORF5418 型）、Millex-GP 0.22 μm 过滤器、无菌操作台、数显游标卡尺。

1.2 方法

1.2.1 培养基及测试培养板制备 全营养固体培养基、半营养固体培养基、全营养液体培养基、水琼脂培养基灭菌后备用［1，2］。培养板制备分两步，第一步制作基层，基层可以用全营养固体培养基或者水琼脂培养基。基层培养基经加热后移入空白培养板中，加入量为10 mL，静置冷却备用。第二步制作病原真菌层，基层培养基完全冷却凝固后，把孢子悬浮液或菌丝悬浮液（室温）与全营养固体培养基（40～45 ℃）按1∶1（V∶V）混合成病原菌悬浮培养基，迅速移入第一层基层表面，轻轻晃动培养板，使病原菌悬浮培养基均匀、完整地覆盖基层，静置、冷却备用。病原菌培养基完全冷却凝固后，在表面加上牛津杯，每个培养板中加入牛津杯的数量和相邻牛津杯间的距离可根据试验样品的数量进行调整，以保证不同样品形成的抑菌圈不发生交差重叠为准。

1.2.2 发酵液样品及标准化合物样品准备 根据试验设计的需要，发酵液或标准化合物的用药量调控使用2 种方式［3，4］。一种是使用固定浓度，通过调整加样体积来控制用药量；另一种是使用固定加样体积，把样品稀释成不同浓度。发酵液稀释为12 个浓度：100%（F）（发酵液原液）、50.00%（F）、25.00%（F）、12.50%（F）、6.25%（F）、3.13%（F）、1.56%（F）、0.78%（F）、0.39%（F）、0.20%（F）、0.10%（F）、0.05%（F）。根据需要把标准化合物配制成合适的浓度。咪鲜胺：1.50、0.75、0.37、0.19、0.08、0.04 mg/L。甲霜灵：1.50、0.75、0.37、0.19、0.08、0.04 mg/L。

1.2.3 供试病原真菌感染液制备 ①灰霉病菌孢子悬浮液制备［5］。灰霉病菌在半径为45 mm 的平皿中以全营养固体培养基进行培养，培养3 周后产生大量真菌孢子。在平皿中加入10 mL 无菌水，用接种环轻刮培养物表面，获得孢子悬浮液。如果孢子悬浮液中混有少量菌丝，可用双层灭菌医用纱布将菌丝滤除。用血球计数板进行孢子计数。用无菌水稀释到试验所需要的浓度，备用。②胶孢炭疽菌、番茄枯萎病菌丝悬浮液制备［6，7］。以全营养液体培养基进行扩大培养，培养1 周后的纯培养物移入高速搅拌机，以5 000 r/min 的速度搅拌，用无菌水稀释到试验所需要的浓度，备用。③西瓜猝倒病菌丝悬浮液制备［8，9］。以全营养液体培养基进行扩大培养，将培养2 d 后的纯培养物移入高速搅拌机，以5 000 r/min的速度搅拌，用无菌水稀释到试验所需要的浓度，备用。灰霉病菌孢子悬浮液浓度为10 000 个孢子/mL，胶孢炭疽菌、番茄枯萎病菌、西瓜猝倒病菌菌丝悬浮液浓度为30 000 个菌丝/mL［10，11］。

1.2.4 琼脂扩散法中活性反应的多样性

1）活性评价指标［12］。琼脂扩散法中活性基本表现是在样品周围形成抑菌圈，在样品通量小的情况下，通常直接测量抑菌圈大小（半径、直径或面积）来标记活性强度。在高通量筛选中，为了方便统计，通常以分级的方式对活性进行记录。琼脂扩散法中不同样品的活性反应不仅表现在抑菌圈的大小，而且在抑菌圈的边缘和圈内也有不同的活性反应。所以在本研究中，用2 个指标来对抑菌活性进行记录。指标一是直接测量抑菌圈半径，指标二是不考虑抑菌圈大小，按抑菌圈内病原菌生长情况进行分级，分级梯度为0、3、7、9。梯度分级标准：0 表示无抑菌圈；3 表示抑菌圈内菌丝生长密度比对照略小，圈内菌丝生长缺损率在30%以下；7 表示抑菌圈内菌丝生长有部分缺损，圈内菌丝生长缺损率为30%～90%；9 表示抑菌圈边缘清晰，圈内菌丝生长缺损率在90%以上。

2）琼脂扩散法中不同样品的活性反应差异。由于本试验中要加入的样品为液态，而且加入样品体积也不尽相同，为了避免样品直接加在培养基表面引起样品扩散面积的差异，所以样品加入牛津杯中。把几个测试菌株的发酵液配制成不同浓度，按照试验要求把不同体积的药液移入到“1.2.1”中提前制备的培养基表面的牛津杯中。培养条件：温度20 ℃，相对湿度为70%～80%，黑暗。2 d 后记录所有抑菌圈半径（指标1）和抑菌圈内病原菌生长情况（指标2）。

1.2.5 琼脂扩散法中病原菌菌丝悬浮液处理方法对活性反应的影响试验 琼脂扩散法中靶标病原菌菌丝相互交织成网状，需要进行前处理。菌丝的切割处理可能影响菌丝活力。把菌丝通过高速旋转的刀片进行切割，制成均匀的菌丝悬浮液，以便菌丝能均匀分布在上层固体培养基中，按“1.2.3”中的方法对胶孢炭疽菌、番茄枯萎病菌和西瓜猝倒病菌丝悬浮液进行切割处理，处理时长分别为1、10、60 s。处理后的菌丝悬浮液按“1.2.1”的方法制备感染培养基。以标准菌株A65560 和阴性对照菌株A50052 作为指示菌。标准菌株A65560 和阴性对照菌株A50052 均使用发酵液，加入样品量为0.06 mL/孔。培养条件：温度20 ℃，相对湿度为70%～80%，黑暗。观察培养2 d 的活性反应，记录抑菌圈形态和病原菌菌丝覆盖在培养基表面的状况。

1.2.6 琼脂扩散法中病原真菌浓度与活性反应的影响试验 按“1.2.3”中的方法对胶孢炭疽菌、番茄枯萎病菌和西瓜猝倒病菌丝悬浮液进行切割处理，处理时长分别为60、60、1 s。计数各病原菌悬浮液中菌丝浓度，以无菌水调整菌丝浓度达12 000、6 000、3 000、1 500、750 个/mL。处理后的菌丝悬浮液按“1.2.1”中的方法制备感染培养基。感染培养基终浓度分别为60 000、30 000、15 000、7 500、3 750 个/mL。以标准菌株A65560 和阴性对照菌株A50052 作为指示菌。标准菌株A65560 和阴性对照菌株A50052 均使用发酵液，加入样品量为0.06 mL/孔，重复3 次。培养条件：温度20 ℃，相对湿度为70%～80%，黑暗。观察培养2 d 的活性反应，记录抑菌圈半径和病原菌菌丝覆盖在培养基表面的状况。

1.2.7 琼脂扩散法中样品处理及样品加入量与活性反应的关系 按“1.2.3”中的方法对胶孢炭疽菌、番茄枯萎病菌和西瓜猝倒病菌丝悬浮液进行切割处理，处理时长分别为60、60、1 s。计数各病原菌悬浮液中菌丝浓度，以无菌水调整菌丝浓度达6 000个/mL。处理后的菌丝悬浮液按“1.2.1”中的方法制备感染培养基。感染培养基终浓度为3 000 个/mL。以标准菌 株A22139、A65560、A19790 和 阴 性 对 照 菌 株A50052 作为样品菌，以咪鲜胺、甲霜灵为标准化合物样品。对标准菌株A22139、A65560、A19790 样品进行如下分类和处理：a.发酵液；b.离心上清液，为发酵液经过4 000 r/min 速度离心所得上清液；c.过滤除菌上清液，为发酵液经过滤除菌体及培养基的滤液；d.滤渣，为发酵液过滤后余下的滤渣（含有菌体及培养基），再以无菌水还原到发酵液同等体积，重复操作5 次后所得悬浮液。所有标准菌株样品按“1.2.2”中的方法进行稀释。牛津杯中加入样品量分别为180、90、45、20、10、5、2 μL。重复3 次。培养条件：温度20 ℃，相对湿度为70%～80%，黑暗。观察培养2 d 的活性反应，测量并记录抑菌圈半径及抑菌圈形态。

2 结果与分析

2.1 琼脂扩散法中活性反应的多样性

琼脂扩散法中样品在不同区域分布不均匀，因此与其他要求样品均匀分布的生物测定方法在活性表现方面有独特之处。样品活性受到化合物扩散速率及活性特征（抑制或杀灭）的双重影响。不同的放线菌发酵液样品和标准化合物样品在琼脂扩散法中的活性反应具有多样性。3 个样品的测试浓度如表1 所示，测试结果见图1。如图1a 所示，样品咪鲜胺（行1）及样品A22139 形成的抑菌圈外缘呈毛刺状，而样品A65560 形成的抑菌圈外缘平整；如图1b、图1c 所示，抑菌圈半径与样品浓度呈正相关，但抑菌圈内病原菌生长特征与样品浓度无关。

图1 三个样品的不同浓度与活性反应的关系

表1 三个样品的测试浓度

2.2 琼脂扩散法中靶标病原菌菌丝悬浮液处理方法对试验的影响

标准菌株A65560 用于显示抑菌圈的形态，阴性对照菌株A50052 用于比较加样区域与空白区域病原菌菌丝生长状态。结果（图2）表明，3 种病原菌对菌丝破碎时间的反应不同。随着菌丝破碎时间（1、10、60 s）的延长，胶孢炭疽病菌和番茄枯萎病菌的生长状况更好，培养基表面的菌丝更加均匀；西瓜猝倒病菌则呈现出相反的结果，即随着菌丝破碎时间（1、10、60 s）的延长，培养基表面的菌丝分布越不均匀，缺损越严重。

图2 不同菌丝破碎时长对菌丝生长的影响

2.3 琼脂扩散法中靶标病原菌浓度与活性反应的关系

混入上层培养基中靶标菌的浓度会直接影响培养过程中单位面积菌丝的含量。从图3a、图3b、图3c 可以看出，单一浓度（标准菌株A65560）发酵液，引起的抑菌圈半径（指标1）与混入培养基中靶标菌的浓度呈负相关，同时抑菌圈半径也有上限。由表2 可知，抑菌圈内部的靶标菌生长特征（指标2）与靶标菌在培养基中的浓度不相关。

图3 抑菌圈半径（指标1）与培养基中靶标菌浓度的关系

表2 抑菌圈内部的靶标菌生长特征（指标2）与培养基中靶标菌浓度的关系

2.4 琼脂扩散法中样品处理及样品加入量与活性反应的关系

由表3 可知，同一个样品作用于同一靶标所形成的抑菌圈半径大小与样品加入量呈正相关。含有活菌的发酵液加入量2～180 μL 都能检出活性，且活性反应强度随样品加入量的减少变化不明显；标准化合物与过滤除菌的发酵液引起的活性反应相似，仅在几个较大样品加入量时才能显示活性，而且随着样品加入量的减少，活性反应明显变弱；发酵液比经过离心的上清液（仍然含有活菌）表现出更强的活性，经过离心的上清液比过滤除菌的上清液也表现出更强的活性，可见活菌的存在可以提高筛选敏感度。

表3 样品加入量对抑菌圈半径（指标1）的影响

由表4 可知，同一个样品作用于不同靶标，形成的抑菌圈形态不一定相同，但是同一样品作用于同一靶标所形成的抑菌圈形态完全一致，与样品加入量无关。

表4 样品加入量与对抑菌圈形态（指标2）的影响

3 小结与讨论

当样品液加入牛津杯后，一方面，样品中的杀菌活性化合物以牛津杯为中心向周边的培养基扩散，当抑菌化合物接触到已经混在培养基中的靶标菌时，靶标菌的菌丝生长受到抑制，因此形成抑菌圈。抑菌化合物扩散的同时，化合物会被培养基稀释。以牛津杯为中心，样品浓度由内向外递减，对靶标菌的抑制作用也由内向外递减，当浓度降到不足以形成对靶标菌的生长产生抑制作用时，就形成了抑菌圈的边界。随着时间的推移，样品在培养基中的扩散也在持续，培养基中的化合物浓度一直处于动态变化中。如果样品不包含活菌，抑菌化合物的浓度会持续下降。如果样品中含有活菌，活菌仍在产生抑菌化合物，则培养基中的抑菌化合物总量会持续增加，并且维持着一定的动态平衡。另一方面，当靶标菌混入培养基后，靶标菌的菌丝会持续扩张生长，随着时间的推移，单位面积菌丝含量会递增，对抑菌化合物的反抑制作用增强。菌丝含量和化合物浓度始终处于动态变化中，因此作为这一动态变化的反应——抑菌圈的形成必定会受到这两方面的综合影响。同一放线菌菌株的不同样品类型活性大小表现为发酵液＞离心上清液＞滤渣＞过滤除菌上清液。直接使用发酵液进行筛选不仅操作简便，而且提高了筛选的敏感度。使用含活菌的生防菌样品的筛选要求生物测定的培养过程中，活菌仍然保持正常生长状态。由于待筛选的大多数放线菌的适应培养基和培养条件并不相同，所以普筛中采用相同培养基和培养条件进行分批处理发酵，活性测试结果也只需确定活性的有无。对于通量要求较大的筛选，初筛可以选择只使用指标2 作为检测标准，在复筛中才使用测量抑菌圈半径的指标1。相对于使用化合物或提取物进行的杀菌活性筛选，直接使用发酵液进行筛选不仅降低了样品制备的高成本，而且还提高了筛选的敏感度。使用含有活菌的样品进行的生防菌活性测试综合考虑了抑菌活性化合物及活菌的单一和协作效果，提高了筛选的敏感度。同时，由于样品及靶标都处于持续生长状态中，所以影响活性强度的因素也更复杂，为了提高筛选结果的稳定性，需要根据不同病原菌靶标和样品特征对筛选细节进行调整［13，14］。此外，感染培养基的混合温度及基层培养基和含靶标菌的上层培养基厚度也对抑菌圈直径（指标1）有影响，这些影响均可以通过操作的标准化进行控制。使用牛津杯固定样品的琼脂扩散法（在样品量小或者样品流动性不影响试验时，可以不使用牛津杯）在其他微生物源生防杀菌剂筛选中的优势有待进一步研究。