CRMP2对七氟醚诱导的发育大鼠远期记忆功能障碍的影响

黄泽琪 张昆

七氟醚（sevoflurane，Sev）是婴儿最常用的挥发性麻醉剂之一。随着儿科手术数量和类型的增加，早期和重复暴露于七氟醚的情况迅速增加。许多研究表明，发育中的大脑暴露于七氟醚会导致成年期长期神经认知障碍和学习障碍［1］。最近研究发现，婴儿期的灵长类动物暴露于七氟醚可引起海马CA1 区突触超微结构变化，引起长期行为缺陷［2］。此外，临床报告表明，接受麻醉的婴儿表现出长期行为和记忆障碍，这些缺陷与突触功能和神经元回路的紊乱有关［3］。

CRMP2（collapsin response mediator protein 2，CRMP2）为崩塌反应调节蛋白2，主要在神经系统中表达，在神经元极性建立和轴突导向中起重要作用。神经元极化是神经元的小突起分化成轴突和树突的阶段，增加CRMP2 的表达能够改变海马神经元的极化，并在神经元中诱导多轴突［4］。同时，CRMP2 活性受到磷酸化状态的精确调控。有研究发现，在自身免疫性脑脊髓炎（EAE）动物模型中，在EAE 的发作高峰期，病变周围的轴突中磷酸化的CRMP2 增加［5］。在前期实验中，我们发现七氟醚能够引起CRMP2 不同位点的磷酸化引起神经发育异常。但CRMP2 是否为七氟醚诱导神经毒性途径的确切靶点，目前尚未可知。

因此，本研究拟采用海马定位注射技术，调控SD 幼鼠海马CRMP2 的表达，研究CRMP2 在七氟醚所致发育大鼠远期记忆功能障碍的影响。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂SD 大鼠七氟醚暴露密封装置，电热恒温水浴箱（北京市永光明医疗仪器厂），冰冻切片机（Leica），微量注射器（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），荧光显微镜Leica DMi8（Germany），七氟醚（雅培有限公司），野生型CRMP2 腺病毒（WT-CRMP2）（和元生物技术（上海）股份有限公司），CRMP2 抗体（CST）；β-actin 抗体（Santa Cruz）。

1.2 动物与分组出生3 天的SD 幼鼠（postnatal day 3，P3）购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2016-0041。本实验经过中山大学动物伦理委员会批准，伦理批件编号：SYSU-IACUC-2023-000306

1.2.1 SD 幼鼠海马定位注射 8 只P5 幼鼠通过微量注射器将2 ul 台盼蓝稀释液通过海马体表定位进行注射染色，10 min 后处死取出大脑组织，切片显微镜观察台盼蓝注射位置。

1.2.2 海马转染WT-CRMP2 腺病毒效率 6 只P5幼鼠随机分成WT-NC 组和WT-CRMP2 组，将WTNC 和带有荧光蛋白GFP 的WT-CRMP2 腺病毒稀释成1.0×109，将2 ul 病毒注射进海马区，3 天后处死，部分取海马组织行Western-blot 检测CRMP2 表达，部分取大脑组织切片，荧光显微镜下观察感染率。

1.2.3 场景恐惧记忆实验分组 30 只P5 幼鼠随机分别为Air+WT-NC 组，Sev+WT-NC 组，Sev+WTCRMP2 组，腺病毒注射后养至P7，进行air 或Sev暴露4 h，P31-P32 进行情景恐惧实验。

1.3 方法（1）SD 幼鼠海马定位注射位置的确定将台盼蓝溶于4%生理盐水中，过滤待用。P5 幼鼠用高浓度Sev 迅速麻醉后，用微量注射器从前囟向后2-3 mm，向左或向右1-2 mm，深度1-2 mm，注射2 ul 台盼蓝溶液染色，注射后密切观察幼鼠的呼吸、皮肤颜色等生命体征。（2）幼鼠Sev 暴露模型建立根据实验分组，将Sev 组幼鼠置于密封箱中，经氧气将Sev 输送至密封箱中，气体检测仪监测Sev、O2和CO2浓度，维持2.8%的Sev 浓度。air 组幼鼠置于另一玻璃箱，通入空气。两组动物玻璃箱均置于36℃水浴箱中，暴露4 小时。

1.4 Western blot 检测蛋白的表达海马定位注射3 天后将幼鼠处死，冰上分离幼鼠大脑海马组织，加入裂解液匀浆后提取蛋白，BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度并调平各组蛋白浓度，行电泳、转膜、封闭，加入CRMP2 和β-actin 抗体。

1.5 组织冰冻切片SD 幼鼠大脑海马腺病毒注射后3 天后处死，取大脑组织固定、漂洗和脱水后，放入OCT 包埋剂中冷冻和保存，切片机切取大脑组织，荧光显微镜下通过绿色荧光蛋白观察腺病毒表达情况。

1.6 场景恐惧记忆实验将P31 大鼠放置于带有电击的试验箱中，适应120 秒后，分别在120 秒、180 秒、240 秒、300 秒和360 秒时对大鼠进行白噪音刺激（2000Hz；90dB），持续30 s，并在声音刺激最后2s 同时给予持续2 s 的足部电击（1mA），以建立恐惧记忆模型。实验结束后让动物在实验箱内继续停留2 分钟后放回饲养笼饲养。24 h 后将大鼠放回实验箱，记录大鼠木僵时间（8 min）。

1.7 统计学处理用GraphPad 9 统计软件分析，数据用均数±标准差（mean±SD）表示。用单因素方差分析（one-way ANOVA）对多个组均数间进行比较，并采用Turkey 检验对各组行两两比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 确定SD 幼鼠海马定位注射位置以幼鼠头部前囟为原点，向左或向右偏1 mm，向后2.5 mm，进针2 mm，行海马定位注射台盼蓝溶液染色，大体解剖可见海马区有台盼蓝溶液。冰冻切片显微镜下见海马区有穿刺孔径，孔径附近有台盼蓝染料（图1）。

图1 A、B 分别为×0、×40 倍数下的大脑组织切片

2.2 WT-CRMP2 腺病毒转染效率与对照组相比，WT-CRMP2 组CRMP2 的表达未有统计学意义（图2）。免疫荧光结果显示，对照组无法检测到绿色荧光。WT-CRMP2 组中海马和大脑皮质区均检测到绿色荧光（图3），表明大脑皮质和海马均感染了腺病毒，并成功表达了CRMP2。

图2 病毒转染后Western-Blot 的检测结果

图3 病毒转染后免疫荧光的检测结果（×0）

2.3 WT-CRMP2 腺病毒对七氟醚诱导的大鼠恐惧实验的影响在恐惧实验训练中，大鼠在每个时间段的“木僵”时间逐渐增加，且大鼠在各个阶段的“木僵”时间百分比相近，未有统计学差异（图4 A）。24 h 后行记忆检测，与Air+WT-NC 组相比，Sev+WT-NC 组的大鼠“木僵”时间明显降低（P＜0.001）。与Sev+WT-NC 组相比，Sev+WT-CRMP2 组大鼠“木僵”时间明显恢复（P＜0.01）（图4 B）。

图4 A 每个训练阶段木僵时间的百分比；B 记忆检测时木僵时间的百分比；**P＜0.01；***P＜0.001。

3 讨 论

3.1 大鼠海马成功转染腺病毒并表达了CRMP2海马位于大脑丘脑和内侧颞叶之间，是参与学习和记忆的重要脑区。同时，海马在体表的位置较易定位，本研究通过台盼蓝染料显示了海马在体表的定位，后续通过此定位进行病毒转染实验。由于腺病毒转染效率高，表达稳定，转染3-4 天表达达到高峰，因此，本研究选择腺病毒进行转染并在表达高峰期检测CRMP2 表达，结果没有明显变化。可能是因为该腺病毒带有神经元特异性-syn 序列，无法感染除神经元以外的细胞。且提取的蛋白不仅有神经元，还有大量的神经胶质细胞。为了进一步验证感染效率，我们构建了带有-GFP 序列的WT-CRMP2 腺病毒，免疫荧光结果显示海马和皮质均有绿色荧光，说明腺病毒成功转染海马并表达了CRMP2。

3.2 促进CRMP2 表达逆转了七氟醚所致的远期记忆功能障碍CRMP2 在神经元中参与调节生长锥的动力学以及突触组装、神经递质传递和钙离子稳态等［6］。有研究发现，在海马神经元中过表达的CRMP2，突触蛋白表达增多，兴奋性突触后电流振幅和频率增强，树突棘形成和成熟增多［7］。Fu 等人发现反复短期七氟醚暴露会导致突触可塑性相关蛋白表达下降，海马可塑性功能障碍，引起大鼠学习和记忆能力受损［8］。我们前期的研究发现，七氟醚能够引起不同位点CRMP2 磷酸化，引起大鼠学习和长期记忆功能损害。与本次研究结果相符，促进CRMP2 的表达改善了七氟醚诱导的大鼠远期记忆功能障碍，提示七氟醚可能是通过干扰CRMP2 的功能，参与大鼠远期记忆功能障碍。

综上所述，本研究通过在新生幼鼠海马转染WT-CRMP2 腺病毒，发现七氟醚诱导新生大鼠远期记忆功能障碍的机制可能与抑制CRMP2 表达有关。