含钙添加剂处理下不同秸秆腐解产物可溶性有机质三维荧光特征变化

夏明明,刘 佳,吴 萌,樊剑波,刘晓利,陈 玲,马昕伶,李忠佩,刘 明*

1. 中国科学院南京土壤研究所/土壤与农业可持续发展国家重点实验室,江苏 南京 210008 2. 中国科学院大学,北京 100049 3. 江西省农业科学院土壤肥料与资源环境研究所/国家红壤改良工程技术研究中心,江西 南昌 330200

引 言

我国作为农业大国,农作物秸秆种类众多、 数量丰富,理论年产量8亿吨以上,并且秸秆产量逐年增多。 然而,秸秆随意丢弃、 露天焚烧等系列问题仍较为突出。 秸秆含有大量营养元素,如氮、 磷、 钾以及植物生长所需的中、 微量元素,农作物秸秆腐解还田是其资源化利用的重要途径之一。 花生和水稻秸秆作为南方典型秸秆类型,其腐解还田作为一种土壤培肥措施及补充土壤有机质的手段也可作为土壤改良的有效措施。

外源添加剂能够加快有机物料腐解进程、 减少养分损失、 提高腐解产物品质,一直是有机物料转化研究的热点。 有研究表明,钙离子可以迅速结合到腐殖酸分子上,将小分子腐殖酸连接起来,形成结构更复杂的大分子结构[1]; 钙离子还可将腐殖酸表面相邻的官能团连接起来[2]。 因此,含钙添加剂对有机物料腐解产物中大分子结构的形成具有重要影响,对腐解产物品质的提升具有潜在作用。 但是,目前关于含钙化学添加剂促进有机废弃物腐解的相关研究仍较少,并且大多关注其对有机物快速腐熟和养分损失的影响。 例如,添加氰氨化钙可以维持牛粪和玉米秸秆混合腐解高温期,促进物料腐熟[3]; 氯化钙能够减少鸡粪堆腐过程中的氨挥发[4]; 磷石膏每增加1 kg·t-1,能减少牛粪堆腐过程中0.11%的氮损失[5]; 也有报道表明,氯化钙或硫酸钙提高了秸秆腐解过程中的EC值,降低了pH值,抑制秸秆分解。 由此可见,对于不同类型含钙添加剂处理后有机物料的腐解效果,缺乏系统性研究,目前结论还不一致。 并且,受限于此前的研究手段,关于含钙添加剂对秸秆腐解产物化学物质组成结构影响的认识尚不充分。

可溶性有机物(DOM)是一大类结构复杂,分子量大小差异较大的可溶性有机组分的混合体,是有机物料分解过程中最为活跃的部分[6]。 研究可溶性有机物化学组成性质的变化,对于了解有机物料分解过程具有重要意义。 现代光谱技术,如三维荧光光谱分析方法,能够便捷、 灵敏地检测出DOM丰富的荧光信息,表征和区分其性质组成。 在此基础上,结合平行因子分析(PARAFAC)可以有效解读出三维荧光光谱的复杂信息,分离识别主要的荧光组分。 本研究针对花生、 水稻秸秆,添加含钙化学添加剂,进行秸秆腐解实验,采用三维荧光光谱结合PARAFAC平行因子分析,揭示不同含钙添加剂类型和添加量对秸秆分解产物DOM荧光特征的影响,研究结果将有助于深入理解秸秆分解的腐殖化过程。

1 实验部分

1.1 供试材料

供试秸秆均来自江西省鹰潭市余江区刘家站刘垦三分场,其中花生秸秆含碳365.04 g·kg-1、 氮13.16 g·kg-1、 磷1.14 g·kg-1、 钾31.17 g·kg-1; 水稻秸秆样品含碳403.88 g·kg-1、 氮6.17 g·kg-1、 磷0.44 g·kg-1、 钾16.66 g·kg-1; 含钙化学添加剂为草酸钙(CaC2O4)、 氢氧化钙[Ca(OH)2]。

1.2 试验设计

试验共设置6组处理,其中不同水平添加剂按照等钙量投入,参考此前文献报道设置8%添加量[7],设置4%减半添加量作为对比,因此处理分别为: 花生秸秆添加4%草酸钙(L-OCa-PS)、 花生秸秆添加8%草酸钙(H-OCa-PS)、 花生秸秆添加4%氢氧化钙(L-HCa-PS)、 花生秸秆添加8%氢化钙(H-HCa-PS)、 水稻秸秆添加4%草酸钙(L-OCa-RS)、 水稻秸秆添加8%草酸钙(H-OCa-RS)、 水稻秸秆添加4%氢氧化钙(L-HCa-RS)、 水稻秸秆添加8%氢氧化钙(H-HCa-RS),每个处理重复3次。 取100 g粉碎秸秆,按上述比例加入草酸钙或者氢氧化钙后,加入去离子水,保持含水量为65%,加入0.5%秸秆腐解菌剂(湖南豫园生物科技有限公司豫园菌剂,其有效菌种为枯草芽孢杆菌、 米曲霉和酿酒酵母,有效活菌数(cfu)≥2.0亿/g,纤维素酶活≥100 U·g-1,蛋白酶活≥15 U·g-1),搅拌均匀后,25 ℃通气腐解30 d。

1.3 方法

1.3.1 腐解产物养分含量测定

秸秆腐解产物风干后,采用重铬酸钾-浓硫酸外加热法测定腐解产物总碳(TC)含量,凯氏定氮法测定腐解产物总氮(TN)含量,钼锑抗比色法测定腐解产物总磷(TP)含量; 氢氧化钠熔融-火焰光度法测定腐解产物总钾(TK)含量[8]。

1.3.2 腐解产物DOM三维荧光测定

秸秆腐解产物与去离子水按照1∶5比例混合,200 r·min-1振荡16 h后,4 ℃下12 000 r·min-1离心15 min,上清液过0.45 μm微孔滤膜,得到DOM滤液。 采用日立F-7000荧光光谱仪测定DOM滤液的三维荧光光谱(EEM)。 激发(excitation wavelength,Ex)和发射(emission wavelength,Em)波长范围分别设置为200～450和250～600 nm,分别以5和1 nm的激发和发射波长间隔记录荧光强度读数,扫描速度为2 400 nm·min-1,激发和发射光谱通带均设置为5 nm。 减去去离子水的荧光EEMs,消除样品矩阵数据中的Raman散射峰,利用200～600 nm范围内吸光度数据对荧光EEM进行校正,消除内滤效应,采用0.01 mg·L-1的硫酸奎宁稀硫酸溶液对样品荧光强度进行标准化(QSU)。

1.4 数据分析

根据前人研究方法[9],利用MATLAB软件DOMFluor软件包进行平行因子分析(PARAFAC),解析腐解产物DOM的荧光组分和荧光特征。 通过370 nm激发波长下的450与500 nm发射波长荧光强度比值计算McKnight index。 通过255 nm激发波长下的435～480 nm发射波长荧光强度与300～345与435～480 nm发射波长荧光强度和的比值计算腐殖化指数(humification index,HIX)。 通过310 nm激发波长下的380 nm发射波长荧光强度与430～435 nm发射波长最大荧光强度比值计算生物源指数(biological index,BIX)。

利用SPSS13.0软件进行数据统计分析。 采用多因素方差分析明确不同用量和类型含钙添加剂下腐解产物养分、 三维荧光组分、 荧光指数差异显著性,采用线性回归分析明确腐解产物养分、 三维荧光组分、 荧光指数之间的相互关系。

2 结果与讨论

2.1 不同含钙添加剂类型及添加量对不同秸秆腐解产物养分含量影响

添加剂类型、 添加量和秸秆类型及其交互作用均影响秸秆腐解产物养分含量。 总体上,除低量添加剂花生秸秆处理外,草酸钙处理的秸秆腐解物总碳含量显著大于氢氧化钙处理; 高量添加剂处理下秸秆腐解产物总碳含量显著小于低量处理,可能是由于高量添加剂处理下微生物不断分解碳源并释放,导致腐解产物中总碳含量显著小于低量处理; 不同秸秆类型对于腐解产物总碳没有明显影响。 添加剂类型和添加量对于腐解产物总氮和总磷没有明显影响; 除高量氢氧化钙处理外,花生秸秆腐解产物的总氮和总磷含量显著大于水稻秸秆。 添加剂类型对于腐解产物总钾含量没有明显影响; 除高量添加氢氧化钙水稻秸秆处理外,低量添加剂处理秸秆腐解产物总钾含量大于高量处理; 花生秸秆腐解产物的总钾含量大于水稻秸秆(表1)。 腐解产物养分含量变化一方面取决于不同秸秆自身碳、 氮、 磷、 钾含量,另一方面也与有机物料腐解矿化以及干物质减少产生的“浓缩效应”有关。

表1 不同含钙添加剂类型及添加量对秸秆腐解产物养分含量影响Table 1 Effect of different types and amounts of calcium-containing additives on the nutrient content of straw decomposition products

2.2 不同含钙添加剂类型和添加量对不同秸秆腐解产物DOM荧光组分的影响

基于3DEEM和PARAFAC方法识别秸秆腐解产物DOM荧光组分。 所有数据(Complete)被随机分成Split1和Split2两个半区数据,Split1、 Split2以及Complete数据集得到DOM组分载荷谱图几乎一致,满足PARAFAC模型“解唯一性”,表明PARAFAC分析模型可靠性较高。 结果表明,秸秆腐解产物DOM荧光组分主要有3个。 根据文献[10],组分C1的主次峰波长(Ex/Em)分别为340/414和245/414 nm[图1(a,d)],属于类胡敏酸; 组分C2的主次峰波长(Ex/Em)分别为370/480和280/480 nm[图1(b,e)],属于类胡敏酸; 组分C3的主次峰波长(Ex/Em)分别为280/350和225/350 nm[图1(c,f)],属于类色氨酸。

图1 腐解产物DOM 组分荧光谱图的PARAFAC模型输出及验证结果(a)—(c)为PARAFAC模型输出荧光组分; (a): Componet 1类胡敏酸,(b): Componet2类胡敏酸,(c): Componet3类色氨酸; (d)—(f)为组分对应的载荷验证结果,左峰: 激发波长载荷,右峰: 发射波长载荷; 绿色和蓝色分别代表两个半数集载荷数据,红色曲线代表全集载荷数据Fig.1 Output and verification results of PARAFAC model of DOM component fluorescence spectrogram of the decomposition product(a)—(c) shows the three fluorescence components,including (a): Compone1humic-like,(b): Compone2 humic-like,(c): Compone3 tryptophan-like,outputted from PARAFAC model; (d)—(f) shows the split-half verification results corresponding to the components; excitation (left) and emission (right) loading spectra were estimated from two random halves of data set (Split1-green line and Split2-blue line),and the complete data set (red line)

添加剂的类型、 添加量和秸秆类型的交互作用均影响腐解产物DOM各组分荧光强度和比例(表2)。 总体上,草酸钙处理的秸秆腐解产物DOM的C1组分荧光强度显著大于氢氧化钙处理; 除草酸钙处理的水稻秸秆外,高量添加剂处理的C1组分荧光强度大于低量处理; 花生秸秆腐解产物DOM的C1组分荧光强度显著高于水稻秸秆。 除低量添加剂处理的花生秸秆外,氢氧化钙处理的秸秆腐解产物DOM的C1组分比例显著大于草酸钙处理; 低量草酸钙处理的秸秆腐解产物DOM的C1组分比例大于高量草酸钙处理,但是氢氧化钙添加量效果相反; 花生秸秆腐解产物DOM的C1组分比例显著高于水稻秸秆。

表2 不同含钙添加剂类型和添加量对不同秸秆腐解产物DOM荧光组分的影响Table 2 Effect of different calcium-containing additive types and additions on the fluorescence fraction of different straw decomposition products

氢氧化钙处理的花生秸秆腐解产物DOM的C2组分荧光强度高于草酸钙处理,而水稻秸秆腐解产物DOM中结果相反; 高量添加剂处理的花生秸秆腐解产物DOM的C2组分荧光强度高于低量添加剂处理,但是在水稻秸秆腐解产物DOM中结果相反; 花生秸秆腐解产物DOM的C2组分荧光强度显著大于水稻秸秆。 氢氧化钙处理的秸秆腐解产物DOM的C2组分比例显著高于草酸钙处理; 除氢氧化钙处理的花生秸秆外,低量添加处理的秸秆腐解产物DOM的C2组分比例高于高量添加剂处理; 除低量草酸钙处理的秸秆外,水稻秸秆腐解产物DOM的C2组分比例大于花生秸秆。

草酸钙处理的秸秆腐解产物DOM的C3组分荧光强度显著高于氢氧化钙处理; 除氢氧化钙处理的花生秸秆外,高量添加剂处理的秸秆腐解产物DOM的C3组分荧光强度大于低量处理; 除低量草酸钙处理的秸秆外,水稻秸秆腐解产物DOM的C3组分荧光强度显著高于花生秸秆。 草酸钙处理的秸秆腐解产物DOM的C3组分比例显著高于氢氧化钙处理; 除氢氧化钙处理的花生秸秆外,高量添加剂处理的秸秆腐解产物DOM的C3组分比例高于低量添加剂处理; 草酸钙处理的水稻秸秆腐解产物DOM的C3组分比例高于花生秸秆,氢氧化钙处理结果相反。

C1与C2类胡敏酸是较常见的高分子腐殖质[11]。 与腐殖质组分相比,类蛋白质组分C3相对更容易被微生物所分解利用[12]。 上述结果表明氢氧化钙对于秸秆腐解和腐殖化具有促进作用。 线性回归分析结果表明,组分C1类胡敏酸与组分C2类胡敏酸无相关性[图2(a)],但是组分C1类胡敏酸[p<0.01,图2(b)]、 C2类胡敏酸(p<0.001,图2(c)]与组分C3类色氨酸呈显著负相关。 秸秆腐解产物DOM中类胡敏酸比例与总碳含量呈显著负相关(p<0.05,图3),表明秸秆充分分解后,小分子量的蛋白质和氨基酸组分可能进一步结合形成分子量较大的腐殖质组分。

图2 不同荧光组分比例的相互关系Fig.2 Interrelationship of different fluorescent component ratios

图3 C2荧光组分比例与总碳关系Fig.3 Relationship between fluorescence component ratio of C2 and total carbon

2.3 不同含钙添加剂类型和添加量对不同秸秆腐解产物DOM荧光指数影响

HIX指数代表DOM的腐殖化程度。 氢氧化钙处理的秸秆腐解产物DOM的HIX值明显高于草酸钙处理,表明氢氧化钙处理后秸秆腐解产物中DOM的芳香化程度更高,可能是氢氧化钙处理下,微生物种类更多,微生物对DOM的转化作用更加强烈; 除氢氧化钙处理的花生秸秆外,低量添加剂处理的秸秆腐解产物DOM的HIX指数高于高量添加剂处理; 除低量氢氧化钙处理外,花生秸秆腐解产物DOM的HIX指数高于水稻秸秆[图4(a)]。

图4 不同含钙添加剂类型和添加量对不同秸秆腐解产物荧光指数影响Fig.4 Effect of different calcium-containing additive types and additions on the fluorescence index of different straw decomposition products

BIX指数代表DOM的新鲜度,即新生成的有机物质占DOM的比例。 草酸钙处理的秸秆腐解产物DOM的BIX值明显高于氢氧化钙处理,表明草酸钙处理下秸秆腐解产物DOM中新生成的有机物质较多; 高量添加剂处理的秸秆腐解产物DOM的BIX高于低量添加剂处理; 花生秸秆腐解产物DOM的BIX指数明显高于水稻秸秆[图4(b)]。

McKnight指数可指示DOM的来源,该指数小于1.4时,DOM主要来源于陆生植物; 大于1.9时,DOM主要来源于微生物转化产物; 处于两者之间代表两种来源有机物质共存。 草酸钙处理的秸秆腐解产物DOM的McKnight值明显高于氢氧化钙处理,表明含钙添加剂的种类会明显影响秸秆腐解产物DOM中腐殖质的来源; 高量草酸钙处理的秸秆腐解产物DOM的McKnight指数高于低量处理,氢氧化钙处理的结果相反; 花生秸秆腐解产物DOM的McKnight指数高于水稻秸秆[图4(c)]。 高量草酸钙处理秸秆腐解产物DOM主要来自于微生物的转化,而其他处理DOM来自于微生物转化和陆生植物。

线性回归分析结果表明,不同荧光指数间存在显著或极显著的相关关系[图5(a—c)]。 其中,秸秆腐解产物DOM中McKnight和 HIX呈显著负相关[p<0.01,图5(a)],与BIX间呈极显著正相关[p<0.001,图5(b)],而HIX与BIX呈极显著负相关[p<0.001,图5(c)],表明秸秆腐解产物DOM组分芳香度程度受有机物质来源影响; 来源于微生物降解的新鲜有机物质比例越大,DOM芳香度越低。 秸秆腐解产物DOM中BIX和总碳含量呈正相关[p<0.05,图6],表明秸秆腐解不充分条件下,DOM中新生成的有机物质比例较高。

图5 不同荧光指数的相互关系Fig.5 Interrelationship of different fluorescence index

图6 生物活性指数(BIX)与腐解产物总碳关系Fig.6 Relationship between bioactivity index (BIX) and total carbon of decomposition products

3 结 论

含钙添加剂种类、 添加量、 秸秆类型及其交互作用对秸秆腐解产物中的养分含量和荧光组分等均有影响,通过三维荧光光谱结合PARAFAC方法可较好表征腐解产物可溶性有机物的化学性质。 总体上,氢氧化钙可以促进秸秆腐解以及腐解产物的腐殖化,花生秸秆的腐解效果好于水稻秸秆,其中8%氢氧化钙处理的花生秸秆腐解效果较好。 研究结果将有助于深入理解秸秆分解的腐殖化过程,为提高秸秆腐解产物品质提供参考。