真核翻译延伸因子1家族成员在肺腺癌发生发展中的作用

武 乐，柳江枫，梁万丰，杨晔宏，胡 刚，杨俊涛

1南开大学统计与数据科学学院，天津 300071 2中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所重大疾病共性机制研究全国重点实验室，北京 100005

肺癌是世界上最常见的癌症之一，其高发病率和高死亡率是全球公共卫生的威胁[1-2]。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌占肺癌的85%，肺腺癌是常见的非小细胞肺癌组织学亚型[3]。早期诊断和治疗对改善肺腺癌的预后非常重要。肿瘤是由多种因素引起的疾病，并且肿瘤和正常样本之间有许多基因的表达水平不同[4]。真核翻译延伸因子1(eukaryotic translation elongation factor1，EEF1)复合物含有EEF1D、EEF1A1和EEF1A2等。有研究表明EEF1D基因表达与卵巢癌细胞对顺铂的敏感性有关[5]，EEF1A1在人结肠腺癌中的差异表达已被鉴定，可能对预后有良好的影响[6]，EEF1A2的表达与乳腺癌的良好预后有关[7]。有报道EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的表达在其他肿瘤中也发挥着作用，如骨肉瘤和肝癌[8-10]。为更好地进行疾病的诊断、治疗和改善预后，阐释肿瘤免疫微环境和信号通路的调控机制非常必要。有报道磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶(protein kinase B，Akt)信号通路在肺腺癌的一些功能中发挥作用[11-13]。然而，目前EEF1D、EEF1A1、EEF1A2在肺腺癌中的相关特异性研究较少。本研究通过揭示EEF1D、EEF1A1、EEF1A2在肺腺癌进展中的潜在机制，探讨是否可作为肺腺癌预后的生物标志物，为早期诊断和治疗肺腺癌提供新的策略。

材料和方法

样本信息及数据处理在UCSC Xena(https：//xenabrowser.net/datapages/)数据库下载癌症基因组图谱项目肺腺癌患者的FPKM格式的转录组测序数据和临床特征数据后进行分析(正常样本59例、肺腺癌样本513例)，包括年龄、性别、体重、人种、肿瘤状况、M分期、每天吸烟情况、T分期、N分期、肿瘤分期；将FPKM格式的转录组测序数据转换为TPM格式，并进行log2转换。批次效应由R软件Limma包的normalizeBetweenArrays函数去除。在临床蛋白质组肿瘤分析联盟数据库下载归一化数据(https：//proteomic.datacommons.cancer.gov/pdc)，共分析211例肺腺癌和癌旁组织样本。

组织阵列及免疫组织化学分析将75例肺腺癌患者的癌组织和每例患者对应的癌旁组织用4%多聚甲醛固定24 h，并用石蜡包埋。将石蜡块制作成4 μm厚的连续切片，按照标准的免疫组织化学程序，在63 ℃下烘蜡1 h后，在LEICA全自动染色机中脱蜡。修复抗原后，在室温蒸馏水中自然冷却10 min以上。用PBS缓冲液冲洗并与EEF1D、EEF1A1、EEF1A2抗体(EEF1D以1∶1000稀释；EEF1A1以1∶2000稀释；EEF1A2 以1∶5000稀释)进行一抗和二抗孵育。载玻片经过DAKO全自动免疫组织化学仪显色和苏木素复染后，室温晾干玻片，中性树脂封片。成像采用LEICA扫描仪。染色强度以0分(阴性)、1分(弱性)、2分(中性)或3分(强性)为主要特征[14]。最终得分为肿瘤细胞阳性百分比与染色强度分数的乘积。

统计学处理采用R软件(V4.2.1)，经Shapiro-Wilk检验，转录组数据、蛋白质组数据、免疫组织化学数据均不符合正态分布，采用Mann-WhitneyU检验评估肺腺癌组织和癌旁组织中EEF1D、EEF1A1、 EEF1A2表达水平的差异。EEF1D、EEF1A1、EEF1A2表达水平在各临床病理特征分组中的差异分析采用Mann-WhitneyU检验。为评估肺腺癌患者的生存预后，采用Kaplan-Meier方法对EEF1D、EEF1A1、EEF1A2不同表达水平的生存率进行比较，采用Log-rank方法对生存曲线之间的差异进行检验。采用单样本基因集富集分析算法探讨肿瘤免疫细胞浸润[15]。通过Pearson及Spearman统计方法分析EEF1D、EEF1A1、EEF1A2表达水平与免疫细胞和PI3K/Akt信号通路的关键基因之间的关系。当P<0.05，r>0.1时，认为相关性显著且呈正相关；当P<0.05，r<-0.1时，认为相关性显著且呈负相关。双侧P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

EEF1D、EEF1A1、EEF1A2基因和蛋白的表达水平采用Mann-WhitneyU检验，评估癌症基因组图谱数据库的572例肺腺癌组织和癌旁组织样本的EEF1D、EEF1A1、EEF1A2基因表达水平，结果显示EEF1A1基因在肿瘤组织中的表达低于非癌组织，而EEF1D和EEF1A2基因在肿瘤组织中的表达高于非癌组织，差异有统计学意义(P均<0.001)(图1A)。采用Mann-WhitneyU检验分析57例肺腺癌配对样本的EEF1D、EEF1A1、EEF1A2基因表达水平，结果显示EEF1D和EEF1A2基因在肿瘤组织中的表达水平均显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P均<0.001)，但EEF1A1基因表达水平差异无统计学意义(P=0.160)(图1B)。

EEF1：真核翻译延伸因子1

采用Mann-WhitneyU检验，评估临床蛋白质组肿瘤分析联盟数据库的211例肺腺癌组织和癌旁组织样本的EEF1D、EEF1A1、EEF1A2蛋白表达水平，结果显示EEF1D、EEF1A1、EEF1A2蛋白在肿瘤组织中表达均显著高于非癌组织(P均<0.001)(图1C)。100对肺腺癌配对样本的EEF1D、EEF1A1、EEF1A2蛋白表达结果显示，EEF1D(P<0.001)、EEF1A1(P<0.001)、EEF1A2(P=0.002)蛋白在肿瘤组织中的表达水平均显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(图1D)。

EEF1D、EEF1A1、EEF1A2表达水平与临床病理特征的关系采用Mann-WhitneyU检验，评估肺腺癌患者EEF1D、EEF1A1、EEF1A2基因表达与临床病理变量之间的关系。结果显示EEF1A1在白人患者中的表达水平显著高于非洲裔美国人(P=0.042)，在T1期表达水平显著低于T4期(P=0.019)，在M0与M1期中表达水平差异无统计学意义(P=0.450)，而在MX期的表达水平显著低于M0期(P<0.001)和M1期(P=0.012)(图2A)。EEF1A2在病理诊断年龄≤65岁患者的表达水平显著高于>65岁的患者(P=0.003)，在N0期表达水平显著低于N1期(P=0.025)，在肿瘤Ⅰ期的表达水平显著低于肿瘤Ⅱ期(P=0.025)(图2B)。EEF1D的表达水平在这些临床特征分组中差异均无统计学意义(P均 >0.05)(图2C)。

图2 EEF1A1(A)、EEF1A2(B)、EEF1D(C)表达水平与临床病理变量之间的关系

A.EEF1D、EEF1A1、EEF1A2蛋白表达与预后的相关性；B.EEF1D基因表达与预后的相关性；C.EEF1A2基因表达与预后的相关性

A.EEF1D的表达与免疫细胞的相关性；B.EEF1D的表达水平与免疫细胞富集分数的关系

A.EEF1A2的表达与免疫细胞的相关性；B.EEF1A2的表达水平与免疫细胞富集分数的关系

EEF1D、EEF1A1、EEF1A2表达水平与生存预后分析采用Kaplan-Meier曲线分析EEF1D、EEF1A1、EEF1A2基因和蛋白表达水平对肺腺癌患者总生存期的影响，结果显示与EEF1A1蛋白低表达的患者相比，EEF1A1蛋白高表达患者的总生存期预后较差(P=0.039)，EEF1A2则与EEF1A1表现相反(P=0.012)，EEF1D蛋白表达与预后无相关性(P=0.320)(图3A)。EEF1D基因表达水平对肺腺癌患者预后的影响与肿瘤(P=0.002)、男性(P=0.024)、M0分期(P=0.004)、T2分期(P=0.038)、肿瘤Ⅰ期(P=0.019)有关(图3B)，EEF1A2 基因表达水平对肺腺癌患者预后的影响与每天吸烟>2.27支(P=0.043)有关(图3C)，EEF1A1基因表达水平对肺腺癌患者预后的影响与临床病理特征无相关性(P>0.05)。

EEF1D、EEF1A1、EEF1A2表达水平与肿瘤免疫微环境的关系采用R软件中的基因集变异分析包对癌组织的转录组测序数据进行免疫浸润相关分析。结合Spearman相关分析结果显示，EEF1D表达与活化CD8 T细胞(r=0.135，P=0.002)、CD56明亮自然杀伤细胞(r=0.135，P=0.002)、CD56暗淡自然杀伤细胞(r=0.242，P<0.001)、单核细胞(r=0.127，P=0.004)呈显著正相关，与中央记忆CD8 T细胞(r=-0.181，P<0.001)、调节性T细胞(r=-0.148，P<0.001)呈显著负相关；EEF1A1表达与中央记忆CD8 T细胞(r=0.166，P<0.001)、效应记忆CD4 T细胞(r=0.116，P=0.009)、γτT细胞(r=0.232，P<0.001)、未成熟树突状细胞(r=0.190，P<0.001)、巨噬细胞(r=0.147，P<0.001)、肥大细胞(r=0.329，P<0.001)呈显著正相关，与活化B细胞(r=-0.195，P<0.001)、CD56暗淡自然杀伤细胞(r=-0.202，P<0.001)、效应记忆CD8 T细胞(r=-0.128，P=0.004)、未成熟B细胞(r=-0.164，P<0.001)、17型T辅助细胞(r=-0.160，P<0.001)呈显著负相关；EEF1A2表达与CD56暗淡自然杀伤细胞(r=0.164，P<0.001)、中央记忆CD4 T细胞(r=0.111，P=0.012)呈显著正相关，与活化B细胞(r=-0.145，P<0.001)、活化CD4 T细胞(r=-0.116，P=0.008)、活化CD8 T细胞(r=-0.111，P=0.012)、嗜酸性粒细胞(r=-0.152，P<0.001)、未成熟B细胞(r=-0.169，P<0.001)、未成熟树突状细胞(r=-0.122，P=0.006)、自然杀伤细胞(r=-0.175，P<0.001)、2型T辅助细胞(r=-0.137，P=0.002)呈显著负相关(图4～6)。

EEF1D、EEF1A1、EEF1A2高、低表达与免疫细胞的富集分数关系结果显示，活化CD4 T细胞(P=0.003)、中央记忆CD8 T细胞(P<0.001)、调节性T细胞(P=0.010)和2型T辅助细胞(P=0.013)免疫细胞EEF1D低表达的富集分数显著高于高表达，但单核细胞(P=0.047)、活化CD8 T细胞(P<0.001)和CD56暗淡自然杀伤细胞(P<0.001)免疫细胞EEF1D低表达的富集分数显著低于高表达。活化B细胞(P<0.001)、未成熟B细胞(P=0.008)、CD56暗淡自然杀伤细胞(P<0.001)、效应记忆CD8 T细胞(P=0.041)和17型T辅助细胞(P<0.001)免疫细胞EEF1A1低表达的的富集分数显著高于高表达，但中央记忆CD8 T细胞(P=0.003)、效应记忆CD4 T细胞(P=0.005)、巨噬细胞(P=0.004)、γτT细胞(P<0.001)、肥大细胞(P<0.001)、T滤泡辅助细胞(P=0.032)和未成熟树突状细胞(P=0.002)免疫细胞EEF1A1低表达的的富集分数显著低于高表达。活化B细胞(P<0.001)、嗜酸性粒细胞(P=0.015)、未成熟B细胞(P<0.001)、肥大细胞(P=0.021)、骨髓来源抑制细胞(P=0.018)和自然杀伤细胞(P=0.002)免疫细胞EEF1A2低表达的富集分数显著高于高表达，但CD56明亮自然杀伤细胞(P=0.022)、单核细胞(P=0.049)和CD56暗淡自然杀伤细胞(P<0.001)免疫细胞EEF1A2低表达的富集分数显著低于高表达(图4～6)。

EEF1D、EEF1A1、EEF1A2表达水平与PI3K/Akt信号通路的关系基因共表达分析和基因关联分析结果显示，EEF1D基因表达显著关联AKT1(r=0.189，P<0.001)、PIK3C2A(r=-0.257，P<0.001)、PIK3C3(r=-0.166，P<0.001)、PIK3CG(r=-0.268，P<0.001)、PIK3CA(r=-0.450，P<0.001)、PIK3R1(r=-0.197，P<0.001)、PIK3R2(r=0.179，P<0.001)、PTEN(r=-0.155，P<0.001)等PI3K/Akt信号通路的基因表达(图7)；EEF1A1基因表达显著关联AKT1(r=-0.104，P=0.018)、PIK3C2A(r=0.184，P<0.001)、PIK3C3(r=0.274，P<0.001)、PIK3CG(r=0.157，P<0.001)、PIK3CA(r=0.185，P<0.001)、PIK3R1(r=0.186，P<0.001)、PIK3R2(r=-0.115，P=0.009)、PTEN(r=0.280，P<0.001)、YBX1(r=0.160，P<0.001)等PI3K/Akt信号通路的基因表达(图8)；EEF1A2基因表达显著关联AKT1(r=0.225，P<0.001)、PIK3C2A(r=-0.259，P<0.001)、PIK3C3(r=-0.202，P<0.001)、PIK3CG(r=-0.151，P<0.001)、PIK3R1(r=-0.117，P=0.008)、PIK3R2(r=0.137，P=0.002)等PI3K/Akt信号通路的基因表达(图9)。

PI3K/Akt：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B

A.EEF1A1的基因表达与PI3K/Akt信号通路关键分子表达水平的热图；B.EEF1A1的基因表达与PI3K/Akt信号通路关键分子表达水平的相关性

A.EEF1A2的基因表达与PI3K/Akt信号通路关键分子表达水平的热图；B.EEF1A2的基因表达与PI3K/Akt信号通路关键分子表达水平的相关性

A.EEF1D的蛋白表达与PI3K/Akt信号通路关键分子表达水平的热图；B.EEF1D的蛋白表达与PI3K/Akt信号通路关键分子表达水平的相关性

A.EEF1A1的蛋白表达与PI3K/Akt信号通路关键分子表达水平的热图；B.EEF1A1的蛋白表达与PI3K/Akt信号通路关键分子表达水平的相关性

EEF1D蛋白表达与PI3K/Akt信号通路的AKT1(r=-0.208，P=0.033)、PIK3CA(r=-0.341，P<0.001)、PTEN(r=-0.236，P=0.015)和YBX1(r=0.646，P<0.001)蛋白表达显著相关(图10)；EEF1A1蛋白表达与PI3K/Akt信号通路的PIK3R2(r=-0.207，P=0.034)、PTEN(r=-0.302，P=0.002)和YBX1(r=0.465，P<0.001)蛋白表达显著相关(图11)；EEF1A2蛋白表达与PI3K/Akt信号通路的关键蛋白表达无相关性(图12)，结合STRING的蛋白质相互作用分析结果显示，EEF1D、EEF1A1、EEF1A2与PI3K/Akt信号通路的关键分子有强烈的相互作用(图13)。

图13 EEF1D、EEF1A1、EEF1A2与PI3K/Akt信号通路关键分子相互作用的网络图

免疫组织化学验证为进一步验证EEF1D、EEF1A1、EEF1A2表达的结果，本研究收集75例配对的肺腺癌和癌旁组织样本，使用免疫组织化学实验验证EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的表达，根据Mann-WhitneyU检验和免疫组织化学结果，EEF1D、EEF1A1、EEF1A2在癌组织中的蛋白表达水平均显著高于癌旁组织(P均<0.001)(图14)。

A.肺腺癌中EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的代表性染色强度图(×200)；B.EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的免疫组织化学评分在癌组织和非癌组织中的比较；C.EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的免疫组织化学评分在癌组织和癌旁组织中的比较

讨 论

多种致癌基因和肿瘤抑制因子的改变都涉及到肺腺癌的发生和发展[4，16-17]。本研究显示肺腺癌组织中EEF1A1基因表达显著低于非癌组织，而EEF1A1的蛋白表达趋势则相反。EEF1D和EEF1A2的基因和蛋白表达水平较非癌组织显著提高。配对样本结果显示，肺腺癌组织的EEF1D和EEF1A2基因和蛋白表达水平以及EEF1A1蛋白表达水平均显著高于癌旁组织，同时，研究显示EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的表达水平与肺腺癌患者的一些临床病理特征及预后有关。此外，EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的表达水平与免疫细胞浸润相关，并与PI3K/Akt信号通路的关键分子相互作用。

有研究表明EEF1D与鳞状肺癌细胞株系的阿霉素耐药变体的多药耐药机制相关[18]，EEF1A1是一种抗凋亡因子，是改进基于人表皮样肺癌细胞凋亡诱导策略的重要分子靶点[19]。然而，EEF1D、EEF1A1、EEF1A2在肺腺癌中的机制尚未完全清楚。本研究显示EEF1D、EEF1A1、 EEF1A2的表达在肺腺癌组织和癌旁组织中差异有统计学意义。EEF1A1蛋白高表达显示预后较差，与EEF1A2观察到的趋势相反。EEF1D和EEF1A2基因表达水平通过部分临床病理特征影响肺腺癌患者的预后，提示EEF1D、EEF1A1、EEF1A2可能是区分肺腺癌组织和非癌组织潜在的预后生物标志物。

在增殖性糖尿病视网膜病变中，EEF1A1的表达与CD4 原始T细胞数量呈正相关，与B细胞数量呈负相关[20]。然而，在肺腺癌中EEF1D、EEF1A1、EEF1A2表达与免疫细胞浸润的相关性分析较少。本研究EEF1D、EEF1A1、EEF1A2在肺腺癌中的表达水平与几种肿瘤浸润免疫细胞相关，提示EEF1D、EEF1A1、EEF1A2与肺腺癌的免疫浸润存在潜在的相关性。据报道，CD56暗淡自然杀伤细胞是一种强有力的细胞毒性介质，表达Ig样自然杀伤受体和FCγ受体Ⅲ (CD16)，是丰富的杀伤抑制受体[21]。细胞毒性CD8+ T细胞参与消除细胞内感染和恶性细胞，CD8+ T细胞代谢与转录、翻译和表观遗传变化相结合，以应对感染[22]。外周未成熟B细胞通过产生天然抗体的效应因子和在免疫应答中作为抑制CD4+ T细胞反应的调节因子发挥作用[23]。

与肿瘤的侵袭性和转移性密切相关的PI3K/Akt信号通路调控肿瘤细胞的增殖和存活，并在人类多种肿瘤中表现出调控异常。EEF1D、EEF1A1、EEF1A2参与多种疾病的PI3K/Akt信号通路。例如，在胶质瘤中，阻断EEF1D可以抑制上皮细胞间质转化和PI3K/Akt活性，从而抑制细胞生长和肿瘤进展[24]。在帕金森病中，EEF1A亚型可能在PI3K/Akt/mTOR通路的调节中发挥作用[25]。然而，肺腺癌的相关研究较少。本研究基因共表达分析和基因关联分析表明，EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的表达与PIK3R2、AKT1、PTEN、PIK3CA、PIK3C2A、PIK3C3、PIK3R1、YBX1、PIK3CG的表达显著相关。因此，EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的表达可能影响PI3K/Akt信号通路。本研究提示EEF1D、EEF1A1、EEF1A2可能通过在PI3K/Akt信号通路中发挥作用，影响多种免疫细胞状态，从而影响肿瘤的发生和发展，但这需要在其他实验中验证。

本研究的局限性：本研究结果基于数据分析，并采用免疫组织化学方法进行初步验证，需要更详细的实验进一步研究验证。

综上，本研究揭示EEF1D、EEF1A1、EEF1A2可能成为肺腺癌患者预后的潜在生物标志物，并可能通过在肿瘤免疫及PI3K/Akt信号通路中发挥作用进而影响肺腺癌的发生和发展。