冷冻切片和数字切片在生药学实验教学中的应用

李耀利,徐风,叶敏,乔雪

北京大学药学院 (北京 100191)

生药学是应用植物学、植物化学、药物分析学、药理学等学科理论知识和现代技术来研究生药的基原鉴定、采收加工、活性成分、药理作用、品质评价及资源利用等问题的一门学科[1-2]。生药学实验课程主要内容包括药材或饮片的性状观察、显微鉴定和显微化学反应、生药理化鉴定和生药分子鉴定等部分,是培养学生掌握生药学基本方法和实验操作技能、巩固和加深理解理论知识的重要实践教学环节。

近年来,不少院校建立了生药学显微数码互动实验室。教学组在设立生药学显微数码互动实验室基础上,改进了实验教学方法,优化了教学内容,提高了实验教学质量,提升了学生的综合实验能力[3]。笔者通过实验教学实例,介绍近几年来在实际教学工作引入冷冻切片和数字切片的经验,以期能够抛砖引玉,促进高校生药学实验教学的发展。

1 冷冻切片在生药学实验课程中的应用

显微鉴定部分是生药学实验课程主要内容之一。显微鉴定是利用显微镜来观察生药的组织构造、细胞形态及其后含物等特征进行生药真实性鉴定的方法。显微鉴定的第一步是根据观察对象和目的的不同制作合适的显微标本片,可分为粉末标本片、切片标本片、表面标本片和解离组织标本片等。

切片标本片的制作是将生药切成极薄的横切片或纵切片。药检部门实际工作中多用徒手切片法,即直接手拿刀片将材料切成薄片的一种方法。徒手切片法操作简便迅速,但在实验课程中由于学生缺乏经验,切片不易完整、薄厚不够均匀,并且存在安全隐患。

冷冻切片法是在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度,然后使用切片机进行切片的一种方法,多用于医疗和科学研究,尤其临床手术中快速病理诊断多用此法。该法只需在切片前使用OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)或胶水等将组织包埋在样品托上,较传统的石蜡切片法更加简便和快捷。近年来,冷冻切片法越来越多地用于植物和生药材料,特别适用于柔软、含多量薄壁组织、含水量多的材料。

小茴香为伞形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥成熟果实。小茴香药食同源,一直作为果实类生药的代表被选入本校生药学实验课。实验目的主要是让学生掌握小茴香的性状和显微特征,包括横切面组织构造特征、粉末特征和油管解离特征、显微化学反应等,尤其是来源于伞形科植物的果实类生药的显微特征。小茴香外果皮外被角质层,棱脊部位有维管束柱(由2个外韧型维管束及纤维束连接而成),木质部有少数细小导管,维管束柱内外侧有多个木化网纹细胞;胚乳细胞含多数细小的糊粉粒和脂肪油滴。学校从教具公司购买的石蜡切片常常由于切片材料幼嫩,导管和网纹细胞未被染色或染色较浅,不利于学生观察。为了让学生对果实和种子类生药胚乳细胞及其内含物脂肪油滴产生深刻印象,教学组设计了让学生徒手切片并进行显微化学染色反应的实验。但学生缺乏徒手切片经验,徒手切片较厚或薄厚不均,且气泡多,染色效果很不理想,甚至在切片时发生划伤手的情况,导致实验效果不甚理想。

鉴于此,近几年来教学组在生药学实验课上尝试使用冷冻切片机进行切片。冷冻切片机型号为Leica CM1950。实验教师通过预实验,设置冷冻箱温度为-20℃左右,样品头温度为-12℃左右,切片厚度可达30～50μm左右,即可获得满意的小茴香横切片。实验时学生按常规操作,包埋已经软化的小茴香,切取小茴香横切片,分别用稀甘油、间苯三酚硫酸试液、苏丹Ⅲ试液封藏,观察现象。教师和学生通过对比可观察到下列现象:导管和网纹细胞因细胞壁木化,被间苯三酚硫酸试液染成红色;油滴和外果皮细胞外角质层被苏丹Ⅲ试液染成红色(图1)。经过4年的教学实践,多位助教和多数学生反映冷冻切片操作简单、切片完整,细胞界限和维管束清楚,染色效果明显,实验效果较徒手切片大大提升。

A:网纹细胞和木质部,B:油滴,C:角质层

冷冻切片适用于柔软、含多量薄壁组织、含水量较多的材料。全草类生药如麻黄、薄荷和石斛,根和根茎类生药如细辛和麦冬,大部分叶类和花类生药,果实类生药如枸杞子等生药样品均适合,也适用于新鲜的药用植物材料。需要注意的是,为了得到质优的切片,对于不同的材料,教师需要摸索合适的切片厚度、适宜的冷冻箱温度和样品头温度等[4]。由于冷冻切片机已在科研中广泛使用,本次实验也为学生今后的科研工作打下了良好的基础。

2 数字切片在生药学实验课中的应用

目前的生药学实验课中,多使用石蜡永久切片展示生药的组织构造显微特征。石蜡切片制作过程费时费力,每张切片的质量参差不齐,学生观察的效果也会有所不同,并且玻璃材质的石蜡切片容易褪色和破损[5]。教师在准备PPT时,需要拍摄永久石蜡切片。而为了全面和清楚地显示某种生药的组织构造,尤其是药材样品较大时,需要拍摄多张图片合并处理成一张扇形或方形的构造图,此法比较费时费力。

数字切片扫描仪可以对整个石蜡切片进行全信息、全方位和高分辨率地扫描和智能拼接,高保真显现显微镜下景象,并将整张切片转化为数字化显微图像保存,即数字(虚拟)切片。此切片图像可以在计算机上进行动画式放大及缩小、裁切、复制和粘贴等,具有容易保存、观察方便和利于教学等优点[6]。近年来,数字切片越来越多地被应用于医学形态学科,包括人体解剖学、病理学、组织学与胚胎学等,提高了实验课的教学质量,提升了学生的学习效果[5,7]。但在生药学课程中的实际应用报道很少。

教学组采用数字切片扫描仪(型号:滨松NanoZoomer-SQ)扫描了番泻叶、大黄、甘草、肉桂、小茴香等质优的石蜡切片,保存为数字切片。教师在课堂讲授时,首先展示完整的番泻叶、大黄根茎、甘草根、肉桂枝皮和小茴香果实横切面(图2),再放大和移动数字切片,重点展示和讲解典型特征,如大黄的星点、黏液腔和蛇形导管,番泻叶的气孔和簇晶等细微特征。通过近两年的实验报告比较和学生访谈,笔者了解到学生普遍认为数字切片能够清楚地展示药材的显微特征,数字切片能够促进学生对药材组织显微特征的掌握,动画式放大及缩小展示方式提高了学生的学习兴趣,提高了教学效果。

图2 番泻叶横切面(A)和大黄根茎横切面(B)数字切片

教师在生药学实验课中可继续推广数字切片技术:一方面可以构建数字切片数据库,为网络教学提供丰富的电子资源;另一方面,可将数字切片与其他软件结合进行相关的分析,如扫描叶类生药的表面片,使用软件统计分析图像中的气孔、表皮细胞和毛茸等,为生药鉴定和质量评价研究等提供基础。还可设计一个综合性实验,内容包括手绘组织构造图、显微数码相机拍摄及数字切片三部分(图3)。通过这个实验,学生可以深刻体会手绘组织构造图、拍摄显微特征图和数字切片三种显微鉴别图呈现形式的优缺点,体会生药学实验课堂条件的改善历程,了解生药显微鉴定的发展过程。目前,数字切片技术在生药学实验课的应用中还存在不足。如本教学组曾尝试使用数字切片扫描仪扫描生药粉末片,但因粉末片中组织、细胞和内含物种类多,大小和形态不一,重叠交织现象严重,所以扫描图像很不清楚,难以达到观察辨识的实验目的。

图3 手绘、拍摄和数字切片显示大黄根茎组织构造特征

冷冻切片技术和数字切片技术均可被应用于生药学实验课教学。前者具有简便、高效和易操作的优点,可以部分替代目前生药学实验课教学中的徒手切片和石蜡切片;后者具有容易保存和观察方便等优点,目前生药学实验课中数字切片技术多用于对石蜡永久切片进行扫描和保存。相关教师可以尝试扫描染色效果佳、质优的冷冻切片,将数字切片和冷冻切片技术结合,充分发挥其优势,合理利用教学资源,以不断提高生药学教学质量。

致谢:感谢王宝荣老师审阅全文,并给出了很好的建议。感谢陆艳老师准备实验。感谢教学组和仪器平台多位老师的帮助。感谢多位研究生助教的帮助。