基于迭代进化的肠出血性大肠杆菌噬菌体鸡尾酒的抗菌效果评价

摘要：分离到一株抗菌能力较差的新型噬菌体vB_EcoM_CRP22，通过模拟噬菌体与细菌在自然环境中的相互作用，开发了迭代适应性进化的方法使噬菌体感染噬菌体抗性突变菌株，显著提高了噬菌体对肠出血性大肠杆菌（EHEC）的抗菌效果，由噬菌体进化株组合成的鸡尾酒制剂感染细菌后36 h 内能有效控制OD600 低于0.4。该实验为噬菌体疗法的发展提供了新思路。

关键词：肠出血性大肠杆菌；噬菌体疗法；适应性进化；噬菌体鸡尾酒；抗菌效果

中图分类号：Q939.9 文献标志码：A

肠出血性大肠杆菌（EHEC）是一种人类食源性病原菌，可引发多种严重的肠道疾病，包括腹泻、出血性结肠炎（HC）和溶血性尿毒综合征（HUC）等，对公共卫生安全造成极大挑战[1-2]。抗生素常常被用来治疗病原菌感染，然而随着抗生素的广泛使用，病原菌的抗生素耐药性（AMR）问题日趋严重[3-4]。同时，喹诺酮类抗生素等药物的使用可能会诱导大肠杆菌表达志贺毒素[5]。此外，长期使用抗生素容易造成肠道菌群紊乱，对使用者的健康产生持续影响[6]。因此，开发抗生素替代疗法从而对EHEC感染进行预防和治疗是目前需要解决的问题。

噬菌体是自然环境中存在的一种细菌病毒，能够感染细菌并具有宿主特异性。噬菌体疗法是利用噬菌体裂解细菌的特性从而治疗感染性疾病的一种方法，在高效杀灭病原菌的同时降低对人体内有益菌群的影响[7-8]。然而，噬菌体疗法也存在一系列挑战，如虽然一些噬菌体能特异性感染病原菌，但是其抗菌能力还有待提高[9]。这些噬菌体无法长期抑制病原菌的生长，同时噬菌体抗性菌株的产生会影响治疗效果[10]。使用噬菌体鸡尾酒（Phage cocktail）进行治疗是有效的应对策略，该方法将不同噬菌体株进行组合配伍从而可以延长抗菌时间，目前已被广泛应用于对抗AMR 细菌[11-12]。噬菌体鸡尾酒依赖于高度多样性噬菌体株组成的噬菌体库，然而从自然环境中分离噬菌体株需要投入大量的时间和人力，不利于临床新型病原菌的快速治疗[13]。因此，在使用噬菌体鸡尾酒进行治疗的过程中，需要寻找新的策略以快速获得多样性的噬菌体株。

在生态环境中，噬菌体与细菌的相互作用是一场“军备竞赛”，在持续的生存压力下，细菌会不断进化以抵抗噬菌体，而噬菌体也会不断发生进化来对抗细菌[14-15]。已有研究表明，在实验室条件下能够实现噬菌体的适应性进化，并提高噬菌体抗菌能力和生长特性[16]。此外，还有研究表明与细菌共培养后的噬菌体发生了宿主范围的改变，并延缓了噬菌体抗性菌的产生[17-18]。在体内的治疗模型中，经过进化的噬菌体在治疗铜绿假单胞菌感染的过程中表现出了更广的宿主范围和更好的治疗效果[19]。由此可见，适应性进化是获得不同噬菌体株的一个潜在策略。

本研究通过模拟噬菌体与细菌在自然环境中的相互作用，开发了迭代适应性进化的方法以获得不同的噬菌体株，随后将其组成噬菌体鸡尾酒用于抑制EHEC 的生长。首先，从环境中分离到一株能感染EHEC 的大肠杆菌噬菌体， 然而其抗菌效果较弱。随后，使用适应性进化的方法获得5 株噬菌体抗性突变菌株和5 株对其有感染能力的噬菌体进化株。最后，将野生型噬菌体和5 株噬菌体进化株组合成鸡尾酒并对其抑制EHEC 的体外抗菌效果进行评价。本研究开发的迭代适应性进化的方法能快速获得多种噬菌体株，并增强噬菌体的抗菌能力，有望促进噬菌体疗法的发展。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器和细菌培养

本研究使用的LB（Luria-Bertani）肉汤培养基购自海博生物技术有限公司，琼脂、PEG8000 和甘油购自上海麦克林生化科技股份有限公司， 基因组DNA 抽提试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。PBS（磷酸盐） 缓冲液的所有成分（化学纯）购自国药集团化学试剂有限公司，配制方式为称取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、3.58 g Na2HPO4·7H2O、0.27 gKH2PO4 溶于1 L 去离子水，灭菌并常温保存。

用于细菌和噬菌体培养的多功能恒温振荡培养箱（Stab Mini 型）购自上海润度生物科技有限公司，高速台式冷冻离心机（H1750R 型）购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。用于抗菌效果评价的生长测定仪（Bioscreen C plate reader 型） 购自芬兰OyGrowth Curves Ab Ltd，由华东理工大学生物反应器国家重点实验室提供。用于噬菌体形态观察的透射电镜（TEM， JEM-1400Plus 型）购自日本JEOL 公司，由华东理工大学分析测试中心提供。

本研究使用的肠出血性大肠杆菌O157：H7 菌株EDL933 由上海交通大学姚玉峰教授赠予，本文中以EHEC 代指该大肠杆菌菌株。EHEC 和噬菌体抗性菌株均使用LB 肉汤和LB 琼脂培养基进行培养。取细菌划线于琼脂质量浓度为15 g/L 的LB 琼脂培养基， 37 ℃ 培养12 h，然后挑单菌落至LB 肉汤培养基，37 ℃、200 r/min 摇床培养12 h，可进行后续试验。

1.2 噬菌体的分离纯化与透射电镜观察

噬菌体的分离纯化主要通过双层平板实验完成[20]。首先，从华东理工大学河水中取样并以8 000 g条件离心5 min 以去除污水样品中的杂质，随后使用0.22 μm 滤膜过滤除菌。然后，向水样中加入等体积LB 培养基，并按1% 接种量加入大肠杆菌菌液，37 ℃共培养12～24 h。使用0.22 μm 滤膜对共培养液过滤除菌，获得噬菌体液。将100 μL 菌液与100 μL 噬菌体液混合， 37 ℃孵育10 min 后加入55～65 ℃ 的LB 软琼脂培养基（琼脂质量浓度为7 g/L），混合均匀并迅速倾倒于提前配制好的LB 琼脂培养基（琼脂质量浓度为15 g/L）平皿上，静置至完全凝固，37 ℃ 共培养12～24 h，观察噬菌斑形成情况。若存在噬菌斑，使用移液器枪头挑取噬菌体并转移至PBS 溶液，4 ℃ 静置2 h 以上，并对噬菌体溶解液进行3 轮双层平板实验，即可获得纯化的噬菌体株，于4 ℃ 保存在终质量浓度0.2 g/mL 甘油溶液中。

通过TEM 观察单个噬菌体的形态。首先，向过滤除菌的噬菌体液中加入NaCl 至终质量浓度为1.0 mol/L， 加入PEG8000 至终质量浓度为100 g/L，4 ℃ 静置过夜。于4 ℃、12 000 g 条件离心10 min，去除上清液并用PBS 溶解沉淀，最后使用0.22 μm 滤膜过滤除菌，即可获得浓缩的噬菌体液。然后，将浓缩的噬菌体液滴至碳涂层铜栅，静置5 min 后使用滤纸去除多余液体，滴加20 g/mL 磷钨酸溶液染色30 s，随后使用滤纸去除多余液体，静置5 min 后即可进行TEM 观察。

1.3 噬菌体基因组测序与生物信息学分析

使用基因组DNA 抽提试剂盒对噬菌体基因组进行抽提。噬菌体基因组测序委托上海派森诺生物科技股份有限公司完成。蛋白质编码序列（CDS）的预测通过软件GeneMarkS（http：//topaz.gatech.edu/GeneMark/）进行，并通过数据库NCBI Nonredundant、VFDB（Virulence Factor Database） 和CARD（ComprehensiveAntibiotic Research Database） 进行比对和注释。基因组圈图的绘制通过软件CGView Server（https：//stothardresearch.ca/cgview/）完成。基于NCBItBLASTx 比对结果，通过软件Viptree server 4.0（https：//www.genome.jp/viptree/）绘制了噬菌体的矩形蛋白质组系统发育树构建，并对相似噬菌体进行了基因组的可视化线性比对。

1.4 噬菌体抗性菌株的分离

按1% 的接种量将大肠杆菌与其噬菌体接种至LB 培养基，37 ℃ 培养12～36 h 直至共培养液浑浊。将共培养液以4 ℃ 、8 000 g 条件离心5 min， 并用PBS 缓冲液洗涤细菌沉淀3 次。将重悬的菌液在琼脂质量浓度为15 g/L 的LB 琼脂培养基上进行划线，于37 ℃ 培养箱培养24 h。挑取单菌落接种至LB 液体培养基中扩增培养。取不同单菌落的培养液均匀涂布于LB 琼脂培养基，然后在平板上滴加1 μL 噬菌体液，观察抑菌圈的形成情况。若无抑菌圈产生，则说明该菌株为噬菌体抗性菌，于−80 ℃ 保存。

1.5 噬菌体的适应性进化

按1% 的接种量将目标噬菌体抗性菌株和待进化噬菌体的宿主接种至LB 培养基，并按10% 的接种量将待进化的噬菌体液接种至培养液，37 ℃ 共培养12～24 h，直至共培养液浑浊。使用0.22 μm 滤膜对共培养液过滤除菌，将其作为下一轮共培养的噬菌体液，按10% 的接种量接种至LB 培养基，并按1% 接种量接种目标噬菌体抗性菌株和待进化噬菌体的宿主， 进行下一轮共培养。重复上述操作， 并依照1.4 节的实验方法，测定每一轮的噬菌体液对目标噬菌体抗性菌株的感染能力，若产生明显抑菌圈，说明噬菌体发生了适应性进化，随后通过双层平板实验分离出进化的噬菌体株。

1.6 噬菌体的成斑效率测定和宿主谱分析

依照Kutter 的实验方法进行噬菌体成斑效率（EOP）的测定[21]。使用LB 培养基将噬菌体以10 倍浓度进行梯度稀释，以EHEC 或EHEC 噬菌体抗性菌株作为宿主进行噬菌体效价的测定。每个效价测定设置3 个平行。以每株噬菌体的宿主菌作为标准菌株，噬菌体EOP 为以目标菌株为宿主菌测得的效价与以标准菌株为宿主菌测得的效价的比值。

根据EOP 数值水平对噬菌体的抗菌效果进行区分。以10−6 作为EOP 数值的检测下限， EOP gt; 10−6则认为目标噬菌体对目标宿主具有感染能力，而EOP gt;10−3 则认为目标噬菌体对目标宿主具有较强感染能力。以噬菌体株为横坐标，以细菌菌株为纵坐标，绘制出描述噬菌体抗菌效果的宿主谱。

1.7 噬菌体的抗菌效果评价

通过生长测定仪进行噬菌体抗菌数据的采集。首先，测定噬菌体效价和细菌活菌浓度并将它们的浓度分别稀释至108 PFU/mL 和109 CFU/mL。然后，按照感染复数（MOI）为0.1 接种2 μL 噬菌体和2 μL细菌至检测孔板，并补加LB 液体培养基至200 μL/孔，将孔板置于生长测定仪中以37 ℃ 振荡培养36～48 h，生长测定仪每30 min 检测OD600，每组设置3 个平行。使用软件GraphPad Prism 7.0 进行曲线图和散点图的绘制。采用独立的双尾t 检验法（Unpairedtwo-tailed Student’s t-test） 确定统计学显著性， *为Plt;0.05，**为Plt;0.01。

2 结果与讨论

2.1 大肠杆菌噬菌体的分离与特性表征

本研究从环境水样中分离到一株大肠杆菌噬菌体，通过双层平板法进行培养，可观察到噬菌体具有边缘较清晰、透明的圆形噬菌斑，结果如图1（a） 所示。TEM 观察结果显示该噬菌体具有直径约80 nm 的头部和长度约120 nm 的非柔性尾部（图1（b） 所示）。该噬菌体被命名为vB_EcoM_CRP22（简称CRP22），基因组序列已上传至NCBI（Accession： OQ708377），根据NCBI 生物分类数据库（NCBI Taxonomy）[22]，噬菌体CRP22 属于Caudoviricetes 纲Ounavirinae 亚科Felixounavirus 属。

为了考察CRP22 抑制EHEC 的潜力，本研究进行了体外抗菌效果评价，结果如图1（c） 所示。在感染0～8 h，CRP22 能抑制EHEC 的生长，显示了较好的抑菌效果。然而在感染后8 h，噬菌体抗性突变株快速产生导致OD600 大幅度提升，其抗菌效果明显降低。上述结果表明在噬菌体CRP22 感染后8 h 抗菌效果较差，无法对EHEC 实现长时间抑制。

2.2 噬菌体基因组的生物信息学分析

为了解噬菌体的基因组学特征，我们对CRP22噬菌体进行了全基因组测序和生物信息学分析，结果如图2 所示。CRP22 的基因组为dsDNA，全长为87 193 bp，GC 含量约为38.85%。在其基因组中预测得到129 个蛋白质编码序列（CDS），其中包含9 个噬菌体结构相关CDS 和31 个代谢相关CDS，结果如图2（a） 所示。经过数据库VFDB（Virulence FactorDatabase）和CARD（Comprehensive Antibiotic ResearchDatabase）比对，CRP22 基因组上未发现毒力基因或抗生素抗性基因。同时，CRP22 基因组未发现整合酶基因和CRISPR 相关基因元件。上述结果表明CRP22 具有一定的安全性，是适合用于噬菌体疗法的候选噬菌体株。

为了进一步了解CRP22 噬菌体的系统进化关系，本文基于NCBI tBLASTx 比对结果构建了系统发育树，如图2（b） 所示。CRP22 的基因组与Escherichiaphage HY02、Salmonella phage BPS17L1、Escherichiatyping phage 1 和Escherichia coli O157 typing phage12 等多株噬菌体具有较高相似性，但它们的基因排列顺序具有一定的差异，结果如图2（c） 所示。

2.3 迭代共培养实现噬菌体的适应性进化

为了进一步发挥CRP22 噬菌体的治疗潜力，本研究模拟了自然界中细菌与噬菌体相互作用的过程，设计了噬菌体迭代适应性进化的方法，结果如图3所示。本研究旨在通过该方法使噬菌体对EHEC 噬菌体抗性菌（EHEC-RB）产生感染能力，并将进化的噬菌体组合成为噬菌体鸡尾酒，来提前抑制噬菌体抗性菌（RB）的产生从而提高抑菌效果。本研究进行的CRP22 噬菌体的适应性进化实验流程示意图如图3（a） 所示。首先，将CRP22和EHEC 共培养一段时间，分离出一系列EHEC-RB。接下来，将CRP22、EHEC 和EHEC-RB共培养一段时间，其中，EHEC 作为CRP22 扩增的宿主菌，EHEC-RB 作为噬菌体适应性进化的压力。在共培养的过程中使CRP22 进化为能够感染EHEC-RB，并将噬菌体进化株（CRP22-EP）进行分离。由于噬菌体进化是一个随机过程，无法通过一轮共培养完成，因此，在每一轮共培养结束后，将共培养液进行过滤除菌以获得噬菌体液，重复上述流程进行迭代共培养。每天测定噬菌体液对EHEC-RB 株的感染能力直至适应性进化的发生，随后通过双层平板实验分离出进化株（EP）。为了进一步获得不同的进化株，将CRP22-EP和对应宿主菌进行共培养以获得新的EHEC-RB 株，并将新的EHEC-RB株、CRP22-EP 株及其宿主菌重复上述共培养过程，从而获得更多不同的噬菌体进化株。

通过上述迭代适应性进化方法，本研究共获得了5 株EHEC-RB 株（EHEC-RB1～EHEC-RB5）和5 株CRP22-EP 株（CRP22-EP1～CRP22-EP5），并进行了宿主谱分析，结果见图3（b）。不同的噬菌体进化株除了能感染自身的宿主菌外，还能够感染不同的噬菌体抗性突变株。每株噬菌体进化株都显示出了不同的宿主范围，表明它们是不同的噬菌体株并具有宿主特异性。CRP22 和5 株CRP22-EP 的宿主范围组合在一起覆盖了所有EHEC 和5 株EHEC-RB。这表明， 相较于单独使用CRP22 对EHEC 进行抗菌，CRP22 和5 株CRP22-EP 的联合使用可能对EHEC 具有更强的抗菌效果。

2.4 噬菌体进化株鸡尾酒对肠出血性大肠杆菌的抗菌效果

为了评估噬菌体进化株鸡尾酒的抗菌潜力，本研究将CRP22 和CRP22-EP1～CRP22-EP5 配制成噬菌体鸡尾酒，通过体外抑菌实验对其抗菌效果进行评价，噬菌体CRP22 进化株和噬菌体鸡尾酒的抗菌生长曲线图见图4。从6 株噬菌体中任意选取2 株噬菌体株进行等比例混合配制成Cocktail， 称为Cocktail 2， Cocktail 2～Cocktail 6 的配制方法以此类推。结果显示，不同Cocktail 的抗菌效果之间存在显著差异，所选择的噬菌体株数量越多，Cocktail 的总体抗菌效果越好。Cocktail 2 无法有效抑制EHEC，18 h 后OD600 均增长至0.8 以上。Cocktail 3 在抑菌的过程中仍然发现有大量的噬菌体抗性突变株快速生长。Cocktail 4 与Cocktail 5 表现出更好的抗菌效果，部分Cocktail 4 与Cocktail 5 能较好地抑制EHEC，在18 h 后控制OD600lt;0.4，但仍然有一些噬菌体抗性突变株生长。Cocktail 6 能够有效抑制EHEC 的生长且无明显的噬菌体抗性菌生长。36 h 时间点的抗菌效果如图5 所示，由图可见，不同Cocktail 抗菌效果存在差异性， Cocktail 噬菌体种类越多抗菌效果越好。综上所述，噬菌体进化株的加入能够有效提高噬菌体鸡尾酒的抗菌能力和延缓噬菌体抗性突变株的生长，其中Cocktail 6 能有效控制EHEC，具有很强的抗菌效果。

3 结 论

本研究分离到一株大肠杆菌噬菌体CRP22，基因组与多株已知噬菌体存在相似性， 但是其对EHEC 的抗菌效果较弱；为了发挥CRP22 噬菌体对EHEC 的抗菌潜力，本研究开发了一种迭代适应性进化的方式，获得了一系列能感染EHEC 抗性菌株的噬菌体进化株；将CRP22 与5 株噬菌体进化株组合成鸡尾酒（Cocktail 6），其在感染后36 h 能够有效抑制EHEC 的生长，显著提高了CRP22 的抗菌能力。

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（责任编辑：王晓丽）

基金项目： 国家杰出青年科学基金（32025038）；中央高校基本科研业务费专项资金（222201231540）