云南边境地区肉牛弓形虫感染情况调查及基因分型研究

马慧　程文杰　贺君君　杨建发　邹丰才　王开胜

摘要：目的 为了解云南省边境地区肉牛弓形虫感染的流行情况，分别从德宏傣族景颇族自治州、保山市、西双版纳傣族自治州等地区，共采集858头肉牛组织样品2 574份。方法 本研究分别提取其组织DNA，利用巢式PCR方法对弓形虫SAG3基因进行检测，在此基础上针对阳性DNA样本SAG3基因开展了PCR-RFLP分型研究，初步确定了主要流行株的基因型。结果 该批组织样品中有来自89头牛呈弓形虫SAG3基因阳性，弓形虫总感染率为10.37%（89/858）。不同地区、不同品种肉牛之间弓形虫感染率具有显著的差异（P<0.05），其中，德宏地区的样品均显示为阴性，而保山、西双版纳地区的阳性率分别为0.33%（1/300，95% CI=0.00～0.99）、25.14%（88/350，95% CI=20.60～29.69）；不同品种中，黄牛感染率最高（23.73%）。基因分型结果显示，云南省边境地区肉牛感染为SAG3表面抗原Ⅰ型。结论 本研究通过对云南部分边境地区的肉牛弓形虫感染情况进行调查，为云南边境地区肉牛弓形虫的流行病学研究提供参考数据。

关键词：云南边境地区；肉牛；弓形虫；流行病学调查；基因分型

中图分类号：S858.23文献标志码：A文献标识码

Investigation and genotyping of Toxoplasma gondii infection in beef cattle

in Yunnan border areas

MA  Hui1，CHENG  Wenjie1，HE  Junjun1，YANG  Jianfa1，ZOU  Fengcai1，WANG  Kaisheng2*

（1 College of Veterinary Medicine， Yunnan Agricultural University， Kunming，Yunnan 650201， China; 2 College of Biology

and Pharmacy， Yulin Normal University， Yulin，Guangxi 537000， China）

Abstract：  Objective In order to understand the prevalence of Toxoplasma gondii infection in beef cattle in Yunnan Province， 2574 tissue samples were collected from 858 beef cattle in Dehong Dai and Jingpo Autonomous Prefecture， Baoshan City and Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture. Methods DNA was extracted and SAG3 gene of T. gondii was amplified by nested PCR. PCR-RFLP gene typing was performed using DNA sample which was SAG3 gene positive. Results Showed that 134 samples were positive from 89 of 858 beef cattle were positive for SAG3 gene of T. gondii， and the total infection rate of T. gondii was 10.37% （89/858）. The infection rate of T. gondii was significantly different among beef cattle from different regions and breeds（P<0.05）. No T. gondii positive samples were found in Dehong， while the positive rates in Baoshan and Xishuangbanna were 0.33% （1/300， 95% CI=0.00-0.99） and 25.14% （88/350， 95% CI=20.60-29.69）， respectively. It was found that SAG3 gene of T. gondii in beef cattle in the border areas of Yunnan Province belong to genotype I. Conclusions The infection of T. gondii in beef cattle in the border areas of Yunnan Province was investigated in this study， this study provided reference data for the epidemiological study of T. gondii in beef cattle in Yunnan border areas.

Key words： Yunnan border area;beef cattle;Toxoplasma gondii;epidemiological survey;genotyping

弓形蟲（Toxoplasma gondii）主要寄生于人和动物真核细胞内，是一种人畜共患胞内寄生虫，夏秋季为弓形虫感染高发季［1］。弓形虫病在全球广泛流行，隐性感染为主，呈慢性经过。当宿主免疫力低下时，其会对被感染动物造成严重危害，致妊娠母畜流产或胎儿停止发育等。在牛弓形虫病中，弓形虫可能引发宿主严重贫血、高热，生产性能降低等症状，从而使养牛业遭受巨大损失［2］。

弓形虫病常导致人类的脑膜脑炎，同时，其可通过感染孕妇，进一步感染胎盘，从而诱发胎儿出现免疫缺陷。研究显示，人感染弓形虫病可能是由于食用了未煮熟的肉或偶然摄入了猫粪便中的弓形虫卵囊［3］。据报道，全球有些地区超过60%人口存在弓形虫血清抗体［3］。我国牛弓形虫病感染率为 0～52.2%［4］，且在华北地区广为流行［3］；羊弓形虫病感染率为 1.40%～29.86%［4］；猪弓形虫病感染率可高达 7.19%～75.95%［5］。有报道显示，云南边境地区存在弓形虫感染风险［6-8］，但是云南边境地区肉牛弓形虫流行病学调查尚未见相关报道。

因此，为了明确云南边境地区肉牛弓形虫感染的最新情况，本研究拟通过对云南边境地区牛弓形虫的流行病学进行调查，对采集的样品弓形虫基因型的分析，以期为云南边境地区的弓形虫病防治提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

2020年8～10月，分别从德宏傣族景颇族自治州、保山市、西双版纳傣族自治州的208、300和350头（共计858头）肉牛采集了共2574份肝、肺、淋巴结等组织样品，并记录相应牛只的年龄、性别、品种等信息，将样品装于放有冰袋的泡沫箱中，带回实验室，置于4 ℃冰箱，保存待检。

1.1.2 主要试剂

组织DNA提取试剂（北京天根生化科技有限公司产品），Taq酶、dNTP等PCR所需试剂（大连宝生物工程有限公司产品），Nci Ⅰ 限制性内切酶（美国NEB公司产品）。

1.1.3 弓形虫标准株DNA

弓形虫标准对照株GT1、PTG、CTG株由朱兴全教授在中国农业科学院兰州兽医研究所工作期间惠赠。

1.2 方法

1.2.1 SAG3基因巢式PCR检测

1.2.1.1 巢式PCR扩增引物

使用DNA提取试剂盒提取组织样品DNA，根据弓形虫SAG3序列特异性引物对所有样品进行检测。引物由上海生工有限公司合成，其序列见表1。

1.2.1.2 巢式PCR扩增体系及条件

PCR反应体系为25.0 μL，其中ddH2O 16.5 μL，dNTP 2.0 μL，MgCl22.0 μL，10×PCR buffer（Mg2+free）2.5 μL，上下游引物各0.15 μL，Taq酶 0.2 μL，DNA模板1.5 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，30个循环;72 ℃终延伸7 min。扩增结束后，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.2 PCR-RFLP基因分型

1.2.2.1 巢式PCR扩增引物

通过1.2.1中的方法检测出的阳性样品与标準对照株GT1、PTG、CTG株与SAG3基因进行同时扩增，其中SAG3基因巢式PCR引物见表1。

1.2.2.2 巢式PCR扩增SAG3基因体系

PCR反应体系为25.0 μL，其中10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，MgCl 2.0 μL，上下游引物各0.15 μL，DNA模板1.5 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 16.5 μL。第一轮反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。第二轮反应条件为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增结束后，使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

针对SAG3基因检测结果为阳性的样品切胶回收后，进行PCR-RFLP分型分析，37 ℃酶切30 min。用相应的内切酶37 ℃金属浴30 min，酶切体系为：内切酶0.4 μL，Cutsmart buffer2 μL，PCR产物6 μL，ddH2O 11.6 μL，共计20 μL。酶切结束后，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 数据处理

将检测数据输入IBM SPSS Statistic 21，按品种、性别和区域进行统计处理，分析品种、性别、区域等因素对肉牛弓形虫感染的影响，并对SAG3基因分型PCR-RFLP结果综合分析，从而系统了解云南省边境地区肉牛弓形虫病的流行状况。

2 结果与分析

2.1 弓形虫感染风险因素分析

对来自德宏、保山、西双版纳三地区的858头肉牛的共2 574份肝、肺、淋巴结等组织样品进行巢式PCR检测，发现134份样品阳性，扩增出约225 bp的目的条带（图1），134份组织样品分别属于89头牛，弓形虫总感染率为10.37%（89/858）。

根据不同地区肉牛弓形虫的检测结果（表2）显示：德宏地区的样品均显示为阴性，而保山、西双版纳地区的阳性率分别为0.33%（1/300，95% CI=0.00～0.99）、25.14%（88/350，95% CI=20.60～29.69），不同地区间弓形虫感染率差异极显著（χ2=138.72，df=2，P=0.00<0.01）。

不同品种肉牛弓形虫感染情况显示（表3），在4个品种的牛中，黄牛弓形虫阳性率最高，为23.73%（70/295，95% CI=18.87～28.58）而瘤牛中未发现弓形虫的感染，不同品种肉牛弓形虫感染率差异极显著（χ2=127.87，df=3，P=0.00）。

不同性别肉牛弓形虫的检测结果（表4）显示，母牛弓形虫阳性率16.7%高于公牛9.90%，但差异不显著（χ2=2.612，df=1，P=0.106）。

2.2 PCR-RLFP基因分型结果

本研究对弓形虫SAG3基因阳性的样品进行该基因扩增，并进行序列分析，将134份阳性PCR产物的测序结果进行Blast比对分析，结果显示，134份样品序列与登录号为MH744785、MH744784、LC414532的序列相似性为100.0%。

针对弓形虫SAG3位点进行酶切，所有样品经酶切发现存在3个条带，酶切位点位于65与127 bp，与Ⅰ型标准株GT1株相同（图2）。

3 讨论与结论

弓形虫是一种寄生于细胞内的单细胞原虫，弓形虫病在全球范围均具有广泛的流行性，对人类健康以及养殖业经济造成严重危害。食用感染弓形虫的畜禽是人感染弓形虫的主要途径，其中弓形蟲感染的牛肉是人弓形虫病的重要感染源之一。

（1）肉牛弓形虫流行情况分析。

对云南边境地区肉牛弓形虫的检测数据显示，其弓形虫感染总阳性率为10.37%。同时，结合近五年国内外有关弓形虫的相关报道［9-12］，本研究发现西双版纳地区肉牛的弓形虫阳性率高达25.14%，同国内其它地区相比［13］，此次研究地区的感染率较高，风险较大，值得警惕。而云南接壤国缅甸在之前进行的研究中，分别报道了家养山羊（11.4%）、家猪（18.4%）和野生食虫蝙蝠（29.3%）的弓形虫感染，这表明这种感染在该国的家畜和野生动物中普遍存在［14］。边境地区为跨国贸易往来频繁区域，屠宰场部分生猪源于境外，因此要加强屠宰场猪肉的检疫，防止境外弓形虫传入我国［8］

（2）肉牛弓形虫感染风险因素分析。

通过本研究发现在云南不同地区、品种、性别等因素对弓形虫感染存在影响，其中地理因素对弓形虫的阳性率存在显著影响。本研究调查了云南德宏傣族景颇族自治州、保山市、西双版纳傣族自治州等多个地区牛弓形虫感染情况，我们发现西双版纳地区阳性率明显高于其他两地区，根据显著性结果分析可能与西双版纳部分地区少数民族遗有吃生肉的习惯有关，从而加快了弓形虫的感染与传播。该风险因素与陈文承等［13］对湖南郴州市调查结果具有一致性。在不同品种肉牛弓形虫感染调查中发现在4个品种的肉牛中，黄牛弓形虫阳性率最高，不同品种肉牛弓形虫感染率差异极显著。

人和家畜等中间宿主、以及终末宿主猫的感染会增加肉牛感染弓形虫的风险［14］。家猫是弓形虫的重要宿主，而且有报道称人类弓形虫血清阳性与弓形虫阳性猫密切相关。全世界家猫中弓形虫的血清阳性率估计约为30%～40%。与其他亚洲国家相比，我国家猫弓形虫感染率高于日本（6%～16%）、泰国（11.0%）、马来西亚（14.5%）、但低于新加坡（30.7%）、印度尼西亚（59.4%）、伊朗（63%）和越南（72.3%）［14］。期间，我们发现，相对于周边地区，猫在调查区域数量较多，分布更广，活动频繁。目前虽暂未出现该地区关于猫感染弓形虫的相关数据报道，但是根据国内外弓形虫流行风险因素，我们推测弓形虫感染率的差异与不同地区猫的弓形虫感染率密切相关。除家猫外，大量流浪猫在全国范围内漫游，就像在其他国家一样，这可能使弓形虫在流浪猫中的感染和传播更为普遍［14］。

（3）弓形虫基因分型结果分析。

弓形虫在全球分布广泛，主要基因型包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。不同基因型的毒力不同，其毒力因受到毒力蛋白多态性的影响［15］。通过对基因型分析，可以了解该地区弓形虫毒力以及传播途径，并且给出针对性的防治措施。国内目前尚无关于云南边境肉牛弓形虫基因分型相关报道。本研究针对SAG3基因检测结果为阳性的样品进行PCR-RFLP分型分析。PCR-RFLP技术首先通过对目的基因扩增，然后利用特异性内切酶切割产生不同大小的片段。目前，该技术已在弓形虫基因分型上被广为应用［16］。本研究中的弓形虫阳性样品均可以扩增出SAG3基因片段，针对弓形虫SAG3位点进行酶切，酶切位点位于65与127 bp。酶切结果与Ⅰ型标准株GT1株的酶切结果相同，故本研究鉴定到的弓形虫为SAG3基因Ⅰ型，研究结果与泰安市商品性鸡产品弓形虫感染情况调查及基因分型的研究［17］以及云南省家禽弓形虫感染的流行病学调查及基因分型结果［18］一致。根据弓形虫数据库现有数据，本次研究可能还有其他基因型尚未检测到，因此，今后将扩大采样范围和增加样品数量，进行更深入分析。

3.4 结论

本次调查发现，云南边境的西双版纳地区肉牛弓形虫感染阳性率（25.14%）偏高，是人畜感染的基因型，具有感染人的风险；同时，猫作为其终末宿主，其数量的增加及其活动范围增大，加大了弓形虫对人畜感染的风险。因此，今后研究将进一步扩大采样的范围及数量，并对边境地区的猫进行弓形虫的流行病学调查，同时还需要重点关注和检测云南边境地区的肉牛弓形虫流行病学的动态变化，如边境海关加强对跨境肉牛的检验检疫，另外，有必要同接壤的相关国家的学者进行国际合作，进行相关研究，从而降低人畜感染风险。

参考文献（References）

［1］陈仁锋.弓形虫病的诊断与防治分析［J］.畜禽业，2022，33（1）：125-126.

CHEN R F. Analysis of diagnosis and control of toxoplasmosis［J］. Animal and Poultry Industry， 222，33（1）：125-126.

［2］赵娜.犬猫弓形虫病的防治措施［J］.畜牧兽医科技信息，2021（9）：226.

ZHAO N. Control measures of toxoplasmosis in dogs and cats［J］. Animal Husbandry and Veterinary Science and Technology Information，2021（9）：226.

［3］张越，王华琳，丁莹莹，等.我国人群和某些动物弓形虫感染研究进展［J］.动物医学进展，2018，39（10）：96-101.

ZHANG Y， WANG H L， DING Y Y， et al. Research progress of Toxoplasma gondii infection in Chinese population and some animals［J］. Progress in Veterinary Medicine，2018，39（10）：96-101.

［4］朱正，孙莹莹，李楷，等.我国牛羊弓形虫感染情况及影响因素研究进展［J］.动物医学进展，2017，38（3）：107-110.

ZHU Z， SUN Y Y， LI K， et al. Research progress of Toxoplasma gondii infection and its influencing factors in cattle and sheep in China［J］. Progress in Veterinary Medicine，2017，38（3）：107-110.

［5］華利忠，魏德宝，王佳，等.东北及华北地区猪弓形体血清学调查［J］.中国预防兽医学报，2016，38（2）：124-127，141.

HUA L Z， WEI D B， WANG J， et al. Serological investigation of porcine toxoplasmosis in northeast and north China［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2016，38（2）：124-127，141.

［6］杨国琴，宋海洋，吕艳，等.云南临沧市牛羊犬弓形虫病血清学调查报告［J］.养殖与饲料，2017（9）：83-84.

YANG GQ， SONG H Y， LYU Y， et al. Serological investigation of Toxoplasmosis in cattle， sheep and dogs in Lincang city， Yunnan Province［J］. Culture and Feed Science，2017（9）：83-84.

［7］李海龙，夏彬彬，李倩，等.云南省边境地区人群弓形虫感染血清流行病学调查［J］.中国血吸虫病防治杂志，2019，31（2）：216-217，221.

LI H L， XIA B B， LI Q， et al. Seroepidemiological investigation of Toxoplasma gondii infection in population in border areas of Yunnan Province［J］. Chin J Schistosomiasis Control，2019，31（2）：216-217，221.

［8］孙春雪，夏彬彬，张莉，等.云南省边境地区猪弓形虫血清流行病学调查［J］.黑龙江畜牧兽医，2018（16）：100-101.

SUN C X， XIA B B， ZHANG L， et al. Seroepidemiological investigation of Toxoplasma gondii in pigs in border areas of Yunnan Province［J］. Heilongjiang Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2018（16）：100-101.

［9］OMID P，HOSNY E A，FALK M，et al. Seroprevalence and molecular detection of Bovine Anaplasmosis in Egypt［J］. Pathogens，2020，9（1）：64.

［10］李继红.牛弓形虫感染情况调查［J］.中国动物保健，2021，23（8）：37-47.

LI J H. Investigation of toxoplasma gondii infection in cattle［J］. China Animal Health，2021，23（8）：37-47.

［11］ZHOU P， ZHANG H， LIN R Q， et al. Genetic characterization of Toxoplasma gondii isolates from China［J］. Parasitology International，2009，58（2）：193-195.

［12］董路，何紫薇，程文杰，等.越冬红嘴鸥及栖息环境部分动物弓形虫流行情况分析［J］.野生动物学报，2021，42（1）：137-142.

DONG L， HE Z W， CHENNG W J， et al. Analysis on the prevalence of Toxoplasma gondii in wintering red-billed gulls and some animals in their habitats［J］. Acta Wilologica Sinica，2021，42（1）：137-142.

［12］杨娜，丁莹莹，李佳祺，等.辽宁地区猪弓形虫感染现况调查及感染因素分析［J］.沈阳农业大学学报，2019，50（4）：476-480.

YANG N， DING Y Y， LI J Q， et al. Investigation and analysis of toxoplasma gondii infection in pigs in liaoning province［J］. Journal of Shenyang Agricultural University，2019，50（4）：476-480.

［13］陈文承，陈芬，扶亚祥，等.湖南省郴州市黄牛弓形虫病血清流行病学调查及风险因素分析［J］.中国动物检疫，2022，39（5）：12-17.

CHEN W C， CHEN F， FU Y X， et al. Seroepidemiology and risk factors of Toxoplasmosis in yellow cattle in Chenzhou city， Hunan Province［J］. China Animal Quarantine， 2022，39（5）：12-17.

［14］BAWM S， PHYU A Z， CHEL H M. Seroprevalence of Toxoplasma gondii in household cats in Myanmar and molecular identification of parasites using feline faecal oocysts［J］. Food Waterborne Parasitol， 2020，20：e00094.

［16］王雪，郑雪莹，拱海鸥，等.北京地区猫弓形虫感染流行病学风险分析［J］.中国兽医杂志，2019，55（9）：71-74.

WANG X， ZHENG X Y， GONG H O， et al. Epidemiological risk analysis of Toxoplasma gondii infection in cats in Beijing［J］. Chinese Journal of Veterinary Medicine，2019，55（9）：71-74.

［15］孫青松，王千寻，宫凤颖，等.弓形虫基因型分型研究新进展［J］.特种经济动植物，2020，23（2）：10-13.

SUN Q S， WANG Q X， GONG F Y， et al. Advances in genotyping of Toxoplasma gondii［J］. Journal of Special Economic Plants and Animals，2020，23（2）：10-13.

［16］胡春昀，朱世范，沈际慧，等.江苏省临床病猪弓形虫感染风险因素及PK1基因型分析［J］.畜牧兽医科学，2021（13）：7-9.

HU C Y， ZHU S F， SHEN J H， et al. Risk factors and PK1 genotype analysis of Toxoplasma gondii infection in clinically ill pigs in Jiangsu province［J］. Animal Husbandry and Veterinary Science，2021（13）：7-9.

［17］王瑞彪．泰安市商品性鸡产品弓形虫感染情况调查及基因分型的研究［D］．泰安：山东农业大学，2018.

WANG R B. Investigation and genotyping of Toxoplasma gondii infection in commercial chicken products in Tai′an City［D］. Tai′an： Shandong Agricultural University， 2018.

［18］李珂，刘欣超，赵津，等.云南省家禽弓形虫感染的流行病学调查及基因分型研究［J］.畜牧与兽医，2021，53（10）：105-111.

LI  K， LIU X C， ZHAO J， et al. Epidemiological investigation and genotyping of Toxoplasma gondii infection in poultry in Yunnan Province［J］. Animal Science and Veterinary Medicine，2021，53（10）：105-111.

（责任编辑：编辑唐慧）

收稿日期：2022-09-18

基金项目：国家自然科学基金项目（跨境肉牛弓形虫相关研究）（32260889）

作者简介：马慧（1998—），女，硕士研究生，专业方向为动物寄生虫学研究。

*通信作者：王开胜（1974—），男，副教授，从事分子遗传与动物育种研究，e-mail：wks@ylu.edu.cn。