高粱镉胁迫响应基因sbbHLH168的表达特征及生物信息学分析

于文慧 郑佳 李杨华 杨明川 王雅利 张子路 龚利娟 康振辉

摘要［目的］以高梁基因sbbHLH168为研究对象，探究其耐镉胁迫发热分子机制，对培育耐镉高粱提供了理论参考。［方法］从高粱品种“BTx623”镉胁迫下转录组数据（RNA-seq）中筛选出一个受镉胁迫后显著上调表达的基因sbbHLH168，使用在线软件对其生物信息进行分析；通过洋葱表皮侵染进行亚细胞定位；构建pGBKT7-sbbHLH168载体验证sbbHLH168基因的转录激活活性；将水培至四叶一心的高粱置于NaCl、PEG、ABA、ACC、GA和JA溶液处理，分别在0、1、12、24和48 h提取RNA，通过RT-qPCR检测sbbHLH168基因的相对表达量。［结果］sbbHLH168基因的开放阅读框长度为567 bp，编码189个氨基酸残基，蛋白分子量为20.55 kD，理论等电点（PI）为8.86，为碱性带正电的蛋白，定位于细胞核，具有較强的转录激活活性。sbbHLH168基因在盐、干旱和植物激素胁迫下表达量整体呈上升趋势，但表达量在不同处理时间存在明显差异。对sbbHLH168基因在不同组织中的表达发现，该基因在高粱的根和叶中均有表达，其中在盐、干旱、ABA、GA和JA胁迫下，sbbHLH168基因在处理12 h时表达量最高。而在ACC处理时，则在处理24 h时表达量最高。［结论］sbbHLH168基因是一个定位在细胞核有转录激活活性的转录因子，属于bHLH家族。

关键词高粱；sbbHLH168；生物信息学分析；表达特征；转录激活活性

中图分类号Q 81文献标识码A文章编号0517-6611（2023）24-0086-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.019

Expression and Bioinformatics Analysis of Cadmium Stress Response Gene sbbHLH168 in Sorghum bicolor

YU Wenhui1， ZHENG Jia2， LI Yanghua2 et al

（1.College of Bioengineering，Sichuan University of Science & Engineering，Yibin，Sichuan 644000;2. Wuliangye Group Co.， Ltd.， Yibin， Sichuan 644000）

Abstract［ Objective ］The study aimed to explore the molecular mechanism of cadmium stress tolerance in Sorghum bicolor gene sbbHLH168， which plays an important role in plant response to biotic and abiotic stresses， it provides a theoretical reference for breeding cadmiumtolerant Sorghum bicolor. ［Method］A significantly upregulated sbbHLH168 was screened from the transcriptome data （RNAseq） of Sorghum bicolor cultivar ‘BTx623 under cadmium stress， and its biological information was analyzed by online software subcellular localization of sbbHLH168 gene was carried out by infection of onion epidermis， PGBKT7sbbHLH168 vector was constructed to verify the transcriptional activation activity of sbbHLH168 gene， and Sorghum bicolor plants cultured in water were treated with NaCl， PEG， ABA， ACC， GA and JA solutions， RNA was extracted at 0，1，12，24 and 48 hours respectively， and the relative expression of sbbHLH168 gene was detected by RTqPCR. ［Result］The open reading frame length of sbbHLH168 gene was 567 bp， encoding 189 amino acid residues. The molecular weight of sbbHLH168 protein was 20.55 kDa， and the theoretical isoelectric point （PI） was 8.86. sbbHLH168 was a basic protein with positive charge， which was located in the nucleus of cells， it has strong transcriptional activation activity. The expression level of sbbHLH168 was increased under salt， drought and plant hormone stress， but the expression level was significantly different at different treatment time. The expression of sbbHLH168 gene in different tissues showed that sbbHLH168 gene was expressed in root and leaf of Sorghum bicolor， and the highest expression level was observed under salt， drought， ABA， GA and JA stress for 12 h. In ACC treatment， the highest expression level was observed at 24 h. ［Conclusion］sbbHLH168 gene is a transcription factor with transcriptional activation activity located in the nucleus and belongs to bHLH family.

Key wordsSorghum bicolor;sbbHLH168;Bioinformatics analysis;Expression characteristics;Transcriptional activation activity

高粱［Sorghum bicolor（L.） Moench］属于禾本科单子叶植物，具有较强的耐盐碱、耐高温和抗旱等抗逆特性。高粱的生产和生物量相较于其他粮食作物更高，因此是许多非洲和许多发展中国家的重要食物来源［1］。近年来，高粱受到真菌、重金属、低温、干旱等逆境胁迫的影响，严重影响高粱的产量和品质［2］。其中，镉是植物生长发育的一种非必需元素，它很容易被根吸收，并通过木质部运输到葉中。植物内镉的积累会引起各种毒性症状，例如叶片变黄、萎蔫、生物量减少和细胞死亡等［3］。因此，对高粱抗逆胁迫基因进行研究具有重要意义。

自然界的植物在生长发育过程中不可避免地会受到许多生物和非生物胁迫的影响［4］。为了生存，植物本身必须利用广泛的生理生化过程来应对各种压力［5］，这些反应通过激活或抑制基因特异性表达来进行调节［6］。基因特异性表达途径之一是转录因子与顺式元件的相互作用，特异性表达与环境胁迫有关的基因，以维持植物的正常生命活动［7］。转录因子（transcription factor，TF）又称反式作用因子，其主要功能是激活或抑制基因的转录效应。通过转录因子的调控作用，可以利用转录因子来改良植物的抗逆性［8］。根据其DNA保守结构域的不同，可以分为AP2/EREBP、MADS、bZIP和MYB等若干个家族［9］，在与植物抗逆性相关的转录因子家族中，bHLH家族是植物中仅次于MYB家族的第二大家族［10］，它是由bHLH特征结构域定义的DNA结合蛋白超家族，该结构域包含参与DNA结合的基本区域和HLH区域充当的二聚结构域［11］。随着分子生物学的发展和基因组序列的增加，越来越多的bHLH转录因子被鉴定出来。例如，花生（Arachis hypogaea Linn.）、短柄草［Brachypodium sylvaticum（Huds.） Beauv.］、苹果（Malus pumila Mill.）和大豆［Glycine max（Linn.） Merr.］的基因组分别包含261、146、188和155个bHLH基因［9，12-13］。植物bHLH转录因子调节大量基因的表达，涉及广泛的调节途径［14］，如植物次生代谢：水稻（Oryza sativa L.）bHLH家族成员OsbHLH148被证明通过调节茉莉酸信号参与介导耐寒性［15］。bHLH112增加了拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞的ABA 水平。拟南芥AtbHLH40则与赤霉素的合成转导有关［16］。响应逆境胁迫：如AtbHLH12基因可以正向调控拟南芥对盐、干旱及渗透胁迫的抵抗力［17］；IbHLH1在苹果对冷胁迫的适应中发挥重要作用［18］。控制细胞的生长：如水稻的稀穗突变体LAX是控制植株顶端分生组织的主要调节因子［19］。拟南芥SPATULA基因参与花形态建成和角果发育等多种发育过程［20］。AtbHLH95基因通过控制胚胎发育延缓植物的生长［21］；拟南芥的AtbHLH21和水稻的OsbHLH164对花粉粒的形成及绒毡层细胞的发育有着关键的调控作用［22］。这些结果表明，bHLH转录因子除了调节植物生长发育之外，还在植物应对各种非生物胁迫中起着关键作用。已知的植物bHLH基因序列主要来源于水稻和拟南芥2种模式植物，对其他植物bHLH蛋白的功能研究还比较少［23］。

笔者从高粱镉胁迫下的转录组数据中筛选出一个显著上调表达的基因sbbHLH168。通过生物信息学等方法分析该基因的基本特征，并通过实时荧光定量PCR（quantitative real．time PCR，RT-qPCR）检测sbbHLH168基因在不同非生物胁迫处理下在高粱根和叶中的相对表达量，了解其在抗逆胁迫中的作用，以期为sbbHLH168基因的研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料及主要试剂

试验材料包括实验室提供的高粱品种“BTx623”和P30-GFP载体，以及市场上购买的洋葱（Allium cepa L.）。试验所用试剂包括TRIzol试剂和DNA Maker DL 2000购自天根生化科技（TIANGEN）有限公司；PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser反转录试剂盒，TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ购于宝日医（北京）生物技术有限公司，2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金（TransGen Biotech）生物技术有限公司。试验所用设备为Genesy 96T基因扩增热循环仪（西安天隆科技有限公司），TG16高速离心机（四川蜀科仪器有限公司），EF-UPR激光共聚焦显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），Nano Drop 2000分光光度计（Thermo Scientific，美国），凝胶成像系统（Bio-Rad，美国），RQH智能人工气候培养箱（郑州生元仪器有限公司），CFX96 Real-Time PCR System定量荧光PCR仪（Bio-Rad，美国），JY300E电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1多种非生物胁迫处理。

将高粱种子置于水培盒中培养至四叶一心时进行盐胁迫（100 mmol/L NaCl）和干旱胁迫（20% PEG 2 000）以及100 μmol/L ABA（脱落酸）、100 μmol/L ACC（乙烯合成前体）、100 μmol/L GA（赤霉素）和100 μmol/L JA（茉莉酸）处理。并在处理后的0（CK）、1、12、24和48 h分别取其根和叶组织样品，置于液氮中速冻，剩余样品于-80 ℃冰箱保存备用。每组试验设置3次生物学重复［24］。

1.2.2高粱sbbHLH168基因的获取和克隆。

通过对高粱品种“BTx623”进行镉胁迫，从RNA-seq数据筛选到1个受镉胁迫诱导显著上调表达的sbbHLH168基因。根据Trizol试剂法提取各处理高粱根和叶组织样品的RNA，并根据PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，使用Primer Premier 5.0设计引物（sbbHLH168F/R）（表1）。PCR反应体系为20.0 μL∶2.0 μL cDNA、上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 10 μL、6.4 μL ddH2O。PCR反应程序为预变性：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，58.6 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验，将目的片段用DNA纯化回收试剂盒回收后连接至PMD19-T（Simple）载体上，并转化大肠杆菌trans5a感受态细胞，然后挑取阳性克隆提交至华大基因生物科技（重庆）有限公司测序。

1.2.3高粱sbbHLH168基因的相对表达量。

使用Beacon Designer 8.0设计定量引物（QsbbHLH168F/R）（表1）。以cDNA为模板，高粱sbPP2A基因为内参，通过Bio-Rad CFX96对样品sbbHLH168的相对表达量进行检测。反应体系为20.0 μL∶7.4 μL ddH2O、10 μL SYBR/TB Green II、7.4 μL RNase-free ddH2O、1.0 μL cDNA模板及定量引物（10 μmol/L）各0.8 μL，反應程序为预变性：95 ℃ 30 s，变性：95 ℃ 5 s，退火：60 ℃ 30 s，循环40次后进行融解曲线分析。每组试验设3次生物学重复。使用GraphPad Prism 9.0软件作图，同时进行差异显著性分析。

1.2.4sbbHLH168蛋白生物信息学分析。

利用NCBI在线工具查找sbbHLH168基因的CDS序列，通过Translate将其翻译成氨基酸序列。使用Protein Blast对该氨基酸序列进行同源序列比对，将同源序列利用DNAMAN 8.0进行多重序列比对；使用MEGA 11.0软件中的Neighbor-Joining构建同源序列的系统发育树；利用Expasy在线工具Protparam和Protscale对sbbHLH168蛋白的等电点（PI）、分子量（MW）、不稳定系数、氨基酸组成和蛋白亲水性进行分析；通过 TMpred Server程序预测sbbHLH168蛋白的跨膜区；利用SOPMA在线程序预测蛋白的二级结构。

1.2.5sbbHLH168蛋白的亚细胞定位。

通过引物sbbHLH168-SacI-F和sbbHLH168-BamHI-R（表1）进行PCR反应，得到含有SacI和BamHI酶切位点但不含终止密码子的sbbHLH168全长CDS片段，经过双酶切后连接到P30-GFP载体上。经过测序比对，将成功构建的质粒P30-sbbHLH168-GFP与P30-GFP 载体分别通过电击法转化到农杆菌EHA105中，并进行菌落PCR检测。对验证正确的阳性克隆置于YEB液体培养基中，于28 ℃，180 r/min振荡培养至菌液OD600约为1.0，将菌液离心重悬后于无菌条件下侵染洋葱下表皮细胞。将侵染后的洋葱下表皮置于28 ℃暗培养，2 d后将洋葱下表皮细胞分别在荧光显微镜的明场及绿色荧光通道下观察。亚细胞定位载体P30-sbbHLH168-GFP构建见图1。

1.2.6sbbHLH168蛋白的转录激活活性。

以cDNA为模板，用引物 sbbHLH168-BD-F/R（表1）进行PCR扩增，得到含有EcoRI和BamHI酶切位点的sbbHLH168全长cDNA，经双酶切后连接到酵母双杂交的诱饵载体pGBKT7上，酶切鉴定后通过PEG/LiAc法转化至酵母Y2HGold感受态细胞中。同时转化pGBKT7空质粒作为阴性对照，涂布于SD-Trp平板上，待菌落长出后挑取单菌落重悬于10 μL灭菌的双蒸水中，取1 μL重悬液点在SD-Trp和SD-Trp/X-α-gal（α-半乳糖苷酶作用的发色底物）固体培养基上，通过观察菌落是否变蓝来检测sbbHLH168蛋白的转录激活活性。

2结果与分析

2.1高粱sbbHLH168基因的表达量

为进一步探究sbbHLH168基因的表达水平，将其进行不同非生物胁迫及植物生长物质处理。结果表明（图2），sbbHLH168在根和叶中均有表达，并具有组织特异性，其中在叶中的表达量高，根中少。相较于CK，sbbHLH168均有差异性表达，其中盐胁迫（NaCl）能显著诱导其表达，呈先上升后下降的趋势，对高粱叶的诱导在12 h达到最大值，根在24 h达到最大值。聚乙二醇（PEG）、脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）处理下，sbbHLH168基因的表达量呈上升—下降—上升的趋势，均在12 h达到最大值。sbbHLH168在乙烯合成前体（ACC）和赤霉素（GA）处理下，其表达量呈现先上升后下降的趋势，分别在24、12 h达到最大表达量。这表明NaCl、PEG、ABA、ACC、GA和JA等外源非生物胁迫处理可以诱导sbbHLH168的表达，从表达量看，sbbHLH168对NaCl的响应更加强烈。这表明sbbHLH168基因受NaCl、PEG、ABA、ACC、GA和JA等外源非生物胁迫处理的诱导，证明sbbHLH168基因参与高粱的非生物胁迫响应，正向调控其抵抗非生物胁迫的能力。

2.2蛋白的结构预测分析

sbbHLH168基因的开放阅读框为567 bp，编码189个氨基酸残基。蛋白的一级结构预测表明，其分子量为20.55 kD，理论等电点为8.86。蛋白的氨基酸组成中阴性氨基酸（Asp + Glu）有25个，阳性氨基酸（Arg + Lys）有28个，属于碱性蛋白，其不稳定系数为48.84，属于不稳定蛋白。亲/疏水性分析表明，sbbHLH168蛋白的平均亲水系数为-0.286（图3A），即该蛋白为疏水性蛋白。TMpred预测表明该蛋白不含跨膜区（图3B）。保守结构域分析显示，sbbHLH168基因的氨基酸序列在第1～60位有1个bHLH_SF结构域（图3C），表明该蛋白属于bHLH家族。

通过SOPMA对sbbHLH168氨基酸序列进行分析并预测其二级结构（图4A、图4B）。结果表明，sbbHLH168包含α螺旋、β转角、无规则卷曲和延伸链，其中占比最多的是α螺旋（52.13%）和无规则卷曲（36.17%），其空间结构如图所示（图4C）。

2.3sbbHLH168蛋白定位在细胞核且有较强的转录激活活性

通过Cell-PLoc 2.0在线程序进行预测，结果表明该蛋白位于细胞核中。将sbbHLH168与GFP荧光信号融合表达，结果表明，GFP荧光蛋白在整个细胞中均有表达，而sbbHLH168和GFP融合蛋白仅在细胞核中表达（图5A），说明sbbHLH168定位在细胞核中。转录激活活性分析表明，PGBKT7载体转化的酵母仅能在SD/-Trp平板上生长，而PGBKT7-sbbHLH168转化的酵母在SD/-Trp和SD/-Trp/X-a-gal平板上均能生长，且在含X-a-gal的平板上酵母菌落会变蓝。说明sbbHLH168转录因子具有较强的转录激活活性（图5B）。

2.4蛋白序列比对及系统发生树分析

基于NCBI的Protein BLAST程序，比对与sbbHLH168同源的蛋白氨基酸序列。序列对比结果表明，sbbHLH168蛋白与南荻（Miscanthus lutarioriparius）的一致性最高，为77.5%。其次是穇［Eleusine coracana（Linn.） Gaertn.］64.4%、黍（Panicum hallii） 66.15%、黍稷（Panicum miliaceum）66.15%、柳枝稷（Panicum virgatum） 65.62%、小米（Setaria italica） 63.54%、弯叶画眉草［Eragrostis curvula（Schrad.） Nees］62.23%、狗尾草（Setaria viridis）60.96%、二穗短柄草（Brachypodium distachyon） 57.98%等，均表现出较高的同源性。

运用MEGA 11.0软件，通过Neighbor-Joining对筛选出的蛋白序列进行比对分析，构建系统发育树，其中矫正参数值设置为1 000。高粱sbbHLH168和MICAD6211412.1、MICAD6203892.1、SbSORBI 3001G350300、SbBDA96 01G371800和MICAD6232386.1在同一分支，表明其与南荻亲缘关系最近（图6、7）。

3讨论

植物在生长发育过程中易受到生物和非生物胁迫的影响，植物为了适应复杂的生长环境，在长期进化中，植物形成了多种抗胁迫的机制［25］。其中，bHLH基因参与植物代谢调节、生长发育及对环境信号反应等过程。该研究采用实时定量荧光PCR检测高粱在NaCl、PEG、ABA、ACC、GA和JA处理下sbbHLH168基因的表达量，试验结果表明，sbbHLH168基因在根和叶中的表达量整体呈上升趋势，并且盐胁迫能显著诱导其表达，这表明sbbHLH168基因参与了高粱的非生物胁迫响应。目前许多前人的研究都可以证明bHLH基因响应植物的非生物胁迫，如在小麦中，通过TabHLH1基因对ABA途径的调节，提高小麦对干旱的适应性［26］。水稻基因OsbHLH148过表达，调节JA途径和OsJAZ（茉莉酸ZIM结构域）蛋白的功能［27］。PRE1的过表达激活了拟南芥中赤霉素依赖性反应［28］。bHLH39的过表达增加了小麦对盐胁迫的耐受性［29］。35S：CSbHLH增强了转基因拟南芥和黄瓜（Cucumis sativus L.）幼苗对NaCl和ABA的耐受性［30］。苹果中的MdbHLH130通过维持ROS的稳态来提高转基因烟草（Nicotiana tabacum L.）缺水胁迫的耐受性［31］。沙漠杨树（Populus euphratica O.）的PebHLH35在拟南芥中的转基因表达通过调节所得植物的气孔发育和光合作用来增加对缺水胁迫的耐受性［32］。综上所述，bHLH蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥重要作用，可以提高植物抵抗不良环境的能力。今后可以通过构建sbbHLH168基因在植物中的过表达或敲除来进一步研究sbbHLH168基因在植物生长发育和抗逆胁迫过程的功能。

4结论

植物bHLH转录因子在植物的生长发育过程中发挥重要作用，但目前对于高粱bHLH转录因子的研究还缺乏深入研究。该研究以高粱sbbHLH168基因为研究对象，利用PCR技术成功克隆了该基因的cDNA全长序列，并在DNA水平上分析了其基因结构。采用各种生物信息学软件对其编码蛋白sbbHLH168的理化性质、亲/疏水性、保守结构域和二级结构等进行分析，结果表明，sbbHLH168基因全长567 bp，编码189个氨基酸；sbbHLH168蛋白二级结构多为无规则卷曲和a螺旋，是一种无跨膜区域的不稳定疏水性蛋白，具有HLH_SF結构域。系统进化关系分析表明，高粱sbbHLH168与南荻、穇和黍的亲缘关系最近，与植物分类地位一致。

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