海南茄子根结线虫病原鉴定及抗性砧用种质筛选

邹 敏 陶 涛 杨 洋 周珊珊 张世才 陈国康 王永清* 田时炳*

（1 重庆市农业科学院，重庆 401329；2 西南大学植物保护学院，重庆 400716）

茄子（SolanummelongenaL.）是我国设施栽培的主要蔬菜之一，长期连作重茬栽培已导致严重的根结线虫等土传病害发生。利用抗性砧木进行嫁接栽培是控制茄子根结线虫病害的有效措施（周宝利，1997；刘富中 等，2021）。

根结线虫（Meloidogynespp.）是全球农作物生产上重要的病原物之一，危害包括经济作物、粮食作物等在内的3 000 多种植物（Abad et al.，2003；Jones et al.，2013）。目前，国际上已报道的根结线虫有100 余种（Bernard et al.，2017）。在我国，北方保护地设施蔬菜上最常见的是南方根结线虫（M.incognita）（金娜 等，2022），而南方最常见的有南方根结线虫、花生根结线虫（M.arenaria）、北方根结线虫（M.hapla）和爪哇根结线虫（M.javanica）（赵磊 等，2010；贾美清和吴光红，2011）。海南省是我国重要的南菜北运基地，也是主要的农作物南繁南鉴试验基地，但根结线虫发生严重，病原种类繁多，且在不同地区和作物间存在不同优势种群。其中，湛江根结线虫（M.zhanjiangensis）是危害海南省番石榴的优势种群（芮凯 等，2005），南方根结线虫是危害海南省肾茶的优势种群（于旭东 等，2009），南方根结线虫和象耳豆根结线虫（M.enterolobii）是危害海南省葫芦科蔬菜的优势种群（黄伟明，2010），拟禾本科根结线虫（M.graminicola）是危害海南省水稻的优势种群（罗激光，2019）。近年来，研究人员通过对海南省18 个市县的根结线虫进行鉴定，明确象耳豆根结线虫已取代南方根结线虫成为蔬菜上的优势类群（龙海波等，2015；李周容 等，2020）。

本试验于2019-2022年在重庆南繁南鉴蔬菜示范基地（海南省乐东县利国镇）茄子南繁加代时进行，利用形态学鉴定和分子生物学鉴定明确基地内茄子根结线虫病原种类，通过病土苗期鉴定法与田间病圃诱发鉴定相结合，筛选高抗根结线虫的茄子种质，以期为高抗根结线虫茄子砧木的培育奠定理论依据和材料基础。

1 材料与方法

1.1 材料

从重庆南繁南鉴蔬菜示范基地田间病圃采集根结线虫病株根系，用于根结线虫病原种类鉴定；58份砧用茄子种质由重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所茄科蔬菜创新团队从全国各地搜集、保存（表1），用于根结线虫抗性鉴定。本试验田间病圃鉴定于2019年开始进行，在前期调查中已发现病情指数大于60 的感病种质LJ-12 等（即感病种质），且此次鉴定的种质中包含抗病种质水茄，因此，在病土苗期鉴定时不再另设抗病、感病对照。

表1 58 份砧用茄子种质编号及拉丁名

1.2 方法

1.2.1 病原体形态学鉴定 用手术刀在发病的植株根部直接挑取发育比较成熟的雌性线虫若干于载玻片上，在光学显微镜下观察，轻压线虫，使其内容物流出，变得相对透明。用挑针固定线虫，手术刀切割线虫腹部末端，将线虫分为前后两大部分，后半部分继续切割，整理残片后观察其会阴花纹并拍照记录（刘丹 等，2021）；观察线虫前半部分的形态结构，切取头部的口针，利用目尺在40 倍显微镜下分别测量线虫口针长度和DEGO 长度（指背食道腺开口至口针基部球的距离）。

1.2.2 病原体 rDNA-ITS 鉴定 取植株发病部位进行研磨处理，使用DNA 提取试剂盒（TaKaRa 公司）提取根结线虫DNA。使用特异性引物对提取的DNA 进行PCR 扩增。不同种类根结线虫PCR扩增的特异性引物均参考李荣兰等（2023）的方法进行设计，详见表2。

表2 根结线虫PCR 鉴定引物信息

PCR 反应体系为50 μL：25 μL 2×Es Tax Master Mix，19 μL ddH2O，2 μL 模板DNA，2 μL上游引物，2 μL 下游引物。PCR 反应程序为：94℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，共35 个循环；最后72 ℃延伸10 min。使用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，胶回收之后送生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序。获得的序列与NCBI 序列数据库进行同源序列比对分析，利用MEGA 11.0 软件构建系统发育树。

1.2.3 抗病性鉴定 病土苗期接种鉴定于2021年12月上旬进行。田间挖取根结线虫重病植株根系周围土层深5～25 cm 的土壤，与无病虫商品育苗基质按照体积比1∶1 混匀，用于茄子种质育苗。每穴播种2～3 粒，常规育苗管理，间苗时每穴保留1 株壮苗。播种50 d 后将植株连根拔起，清水洗净根部，调查各植株根结线虫发病情况。3 次重复，每重复10 株。根结分级标准：0 级，无根结；1 级，1/3 以下须根有根结；3 级，1/3～2/3 的须根有根结；5 级，2/3 以上须根有根结或主根有根结。

田间病圃诱发鉴定于2019-2021年进行。每年9月中旬进行茄子育苗，10月中旬定植于基地根结线虫病圃，每年每份种质定植20 株，翌年春季试验结束时（2月中下旬）将植株连根拔起，调查根系根结线虫发病情况。分级标准（张铭真，2017）：0 级，无根结；1 级，根结不明显，占整株根系1%～5%；2 级，根结部分占整株根系6%～25%；3 级，根结部分占整株根系26%～50%；4 级，根结部分占整株根系51%～75%；5 级，根结部分占整株根系75%以上。

根据2 种抗病性鉴定方法调查的病情等级，计算病情指数：DI=∑（病级×该级病株数）／（最高病级×调查株数）×100，并根据各自3 次重复的结果计算平均病情指数。依据目前国际通行的以根结线虫病情指数（DI）划分抗性等级（陆景伟 等，2022）：DI=0，免疫（I）；0＜DI≤20.0，高抗（HR）；20.0＜DI≤40.0，抗病（R）；40.0＜DI≤60.0，感病（S）；60.0＜DI≤80.0，中感（MS）；80.0＜DI≤100.0，高感（HS）。

2 结果与分析

2.1 根结线虫的形态学鉴定

显微镜下观察到根结线虫雌虫会阴花纹，有1个呈方形的背弓，尾端区有1 个清晰的旋转纹，平滑至波形，在侧区出现断裂纹和叉形纹。口针向背部弯曲，针锥前半部呈圆柱状，后半部呈圆锥状，口针平均直径为15.21 μm，DEGO 平均长度为2.98 μm。初步确定为南方根结线虫（M.incognita）（图1）或花生根结线虫（M.arenaria）。同时，通过形态观测根结线虫30 头，其中具有方形背弓的南方根结线虫28 头，检出频率为93.33%；而背线腹线在侧线交叉的花生根结线虫2 头，检出频率仅为6.67%。表明南方根结线虫是侵染海南茄子的优势类群。

图1 南方根结线虫形态特征（左为会阴花纹，右为口针及食道）

2.2 根结线虫rDNA-ITS 鉴定

以提取的病原线虫DNA 为模板，使用根结线虫通用引物和5 种特异性引物进行扩增之后，南方根结线虫特异性引物检测得到长度为935 bp 的扩增片段（NanFang），花生根结线虫特异性引物检测得到长度为410 bp 的扩增片段（HuaSheng）。将其克隆后所获得到的测序结果与NCBI 数据库中的序列进行BLAST 比对分析，发现用南方根结线虫特异性引物扩增的序列与南方根结线虫KP411871.1的一致性为99.89%，用花生根结线虫特异性引物扩增的序列与花生根结线虫MW315990.1 的一致性为99.76%，以爪哇根结线虫（M.javanica）KF041313.1 作为外群构建系统发育树。分析结果显示，NanFang 和HuaSheng 这2 个序列分别与南方根结线虫（M.incognita）、花生根结线虫（M.arenaria）的序列聚为一类（图2）。

图2 基于不同根结线虫rDNA-ITS 序列构建的系统发育树

2.3 砧用茄子种质的抗病性鉴定

两种方法对58 份砧用茄子种质的抗病性鉴定结果见表3，病土苗期接种鉴定的病情指数为0～71.59，田间病圃诱发鉴定的病情指数为0.40～72.80，2 种方法鉴定参试种质的整体病情程度基本一致，病土苗期鉴定的总病情指数高于田间病圃诱发鉴定。其中，抗性等级相同的种质有34份，占58.62%，病情指数之差＜20.0 的种质有53份，占91.38%。病土苗期鉴定将参试种质抗性划分为5 级，其中免疫1 份、高抗5 份、抗病25 份、感病22 份、中感5 份；田间病圃鉴定将参试种质抗性划分为4 级，其中高抗9 份、抗病23 份、感病21 份、中感5 份。根据2 种方法的抗病性鉴定结果，对根结线虫表现为高抗的砧用茄子种质有6份，分别为水茄、蒜芥茄、LJ-7、Ng1-039、Ng1-021、Ng1-003。

表3 58 份砧用茄子种质的根结线虫病抗性鉴定结果

3 讨论

本试验发现，在重庆南繁南鉴蔬菜示范基地（海南省乐东县利国镇），茄子不是受单一根结线虫种类侵染，而是由南方根结线虫和花生根结线虫复合侵染。根据显微镜下30 头根结线虫形态特征观测显示，具有方形背弓的南方根结线虫检出频率占93.33%，而花生根结线虫检出频率仅为6.67%，即南方根结线虫为该南繁基地田块的优势病原线虫，该结果与前人研究结果基本一致（陈绵才 等，2001；贾本凯，2012）。据此，后续开展的茄子砧用种质抗病性鉴定所针对的病原线虫为南方根结线虫（M.incognita）。据研究报道，在我国重庆、四川等多数根结线虫发病地区，南方根结线虫是主要种类（罗佳 等，2021；陆景伟 等，2022）。因此在南繁基地获得的茄子抗性评价结果，对重庆、四川等以南方根结线虫为优势类群的地区具有重要参考及应用价值。

本试验以田间病土作为接种病源，同时采用病土苗期接种鉴定和田间病圃诱发鉴定，2 种方法鉴定的茄子种质整体病情程度基本一致。其中，抗性等级评价相同的种质有34 份，抗性等级评价相邻的种质有23 份，仅1 份种质（Ng1-047）抗性等级评价相差2 级（苗期评价为抗病，田间评价为中感）。同时，苗期鉴定的总病情指数高于田间鉴定，对于高抗种质的筛选更加严苛。对比2 种方法可知，82.76%的种质田间鉴定抗性评价级别优于（或等于）苗期鉴定，其中3 份田间表现高抗的种质（BW9、Ng1-015、Ng1-018），苗期鉴定结果为抗病。因此，苗期鉴定方法可靠，同时缩短鉴定时间，为根结线虫鉴定提供了新方法。最后，结合2种方法的鉴定结果，并以病情指数较高的结果进行最终评价，筛选出高抗根结线虫的茄子砧用种质6份，这些种质可为茄子抗病育种奠定材料基础。

4 结论

根据病原线虫形态学和rDNA-ITS 分子生物学鉴定结果，确定南方根结线虫为侵染海南茄子的优势类群；结合病土苗期接种与田间病圃诱发2 种方法的抗病性鉴定结果，筛选出高抗根结线虫的砧用茄子种质6 份，分别为水茄、蒜芥茄、LJ-7、Ng1-039、Ng1-021、Ng1-003。