两株内生镰刀菌对甘蓝产量及根际微生物的影响

祝 英 仝倩倩 巩晓芳 金军民 袁志林 李锦成 王治业

（1 甘肃省科学院生物研究所，甘肃省微生物资源开发利用重点实验室，甘肃兰州 730000；2 兰州大学生态学院，草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州 730000；3 榆中县农业技术推广中心，甘肃兰州730102；4 中国林业科学院亚热带林业研究所，浙江杭州 311400；5 西安思源中学，陕西西安 710038）

蔬菜生产复种指数高，土壤利用强度大，连作和高频水肥、农药过量投入是普遍存在的现象，因此导致病害频发、土壤质量和蔬菜品质下降，影响了蔬菜种植的经济效益和可持续发展。土壤微生物是土壤肥力形成和持续发展的核心动力，土壤微生物菌群失衡是诱发蔬菜病害的关键因素之一，通过利用微生物肥料对土壤微生物区系调控，降低植物病害发生率并维持土壤生产力成为当前研究的热点和难点问题（刘正洋 等，2020）。研究表明，施用微生物肥料可有效缓解蔬菜种植过程中病害的发生，促进蔬菜作物生长，并减少化肥、农药的用量，是我国蔬菜绿色生产普遍推广的农艺措施之一（于亚楠 等，2022；Qi et al.，2022）。

蔬菜生产上施用的微生物肥料主要有生防菌和促生菌两大类，包括由常见的芽孢杆菌属、根瘤菌属、固氮螺菌属等细菌和木霉、白僵菌、绿僵菌、拟青霉、被毛孢等真菌菌株制备的农用微生物菌剂、复合微生物肥料和生物有机肥等产品（仝倩倩 等，2022）。筛选并开发新型、高效、广谱的功能菌株是微生物肥料研发的基础和关键。近些年从常见致病微生物疫霉属（Phytophthora）获得的寡雄腐霉菌株是广谱生防菌株，制备的寡雄腐霉孢子粉广泛应用于各种农作物病害的绿色防治，其效果显著（姜一鸣 等，2017；李伟山 等，2022）。镰刀菌（Fusarium）属的黄色镰刀菌（F.culmorum）和假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）是禾本科植物茎基腐病和穗枯萎病的主要致病菌（Alahmad et al.，2018；Backhouse & Burgess，2022）。 然而越来越多的研究表明植物内生镰刀菌不但不致病，还能促进植物生长，并且提高植株对环境胁迫的耐受性（Maciá-Vicente et al.，2008；Skiada et al.，2019）。从盐生植物滨麦健康植株中分离的2 株内生镰刀菌〔黄色镰刀菌（F.culmorum）和假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）〕不但能促植物生长，还能提高植株的耐盐性（潘雪玉 等，2018），是极具开发潜力的植物益生菌。但是，这2 株内生镰刀菌能否作用于蔬菜进而发挥类似效果，以及如何影响蔬菜产量与作物根际微生物群落组成及多样性特性的研究还未见报道。

本试验以中甘21（易感黄萎病和黑腐病）、满月56（抗枯萎病）、喜美（抗黄萎病和黑腐病）3个甘蓝品种为试材，研究2 株内生镰刀菌制备的农用微生物菌剂对春、秋茬甘蓝产量及根际土壤微生物类群的影响，并进一步分析不抗病品种中甘21秋茬根际土壤细菌和真菌的多样性，探索内生镰刀菌菌剂缓解连作障碍、促生增产的根际土壤微生物调控功能，以期为高效、广谱功能菌株研发和在蔬菜绿色生产上应用提供技术支持和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点位于甘肃省兰州市榆中县三角城乡高墩营村高原夏菜甘蓝主要种植区，前茬作物为玉米。该地年平均气温6.57 ℃，属典型温带半干旱大陆性气候，年均降雨量350 mm，全年无霜期159d。

春茬甘蓝为新茬，定植前0～20 cm 土壤有机质含量16.65 g·kg-1，总氮含量0.991 g·kg-1，有效磷含量65.739 mg·kg-1，速效钾含量696.19 mg·kg-1，pH 值7.8；秋茬甘蓝为连作，定植前0～20 cm 土壤有机质含量18.97 g·kg-1，总氮含量1.058 g·kg-1，有效磷含量64.071 mg·kg-1，速效钾含量728.33 mg·kg-1，pH 值8.0。

1.2 试验材料

供试甘蓝品种为中甘21（北京华耐农业发展有限公司），易感黄萎病和黑腐病；满月56（北京华耐农业发展有限公司），抗枯萎病；喜美（广东金作农业科技有限公司），抗黄萎病和黑腐病。采用72 孔穴盘育苗，育苗基质按照腐殖质∶珍珠岩粉∶蛭石粉=6V∶3V∶1V混配均匀后进行紫外消毒。

供试菌株为黄色镰刀菌（F.culmorum）和假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum），均由中国林业科学院亚热带林业研究所提供。市售微生物菌剂对照为多利维生寡雄腐霉卵孢子，捷克生物制剂有限公司生产。

菌剂制备：菌种取出后室温放置2 d，分别转接至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）试管斜面上，28～30 ℃培养4 d，得到活化菌种；然后转接至PDA 液体培养基，28 ℃、200 r·min-1条件下培养4 d，再按3‰的接种量接种至扩大发酵罐PDA培养基中，装液量为发酵罐容积的60%～75%，28 ℃、200 r·min-1条件下培养5 d，得到扩繁菌液；将扩繁菌液匀浆后稀释涂布，有效活菌数为12.5 亿个·mL-1，pH 值为6.8，符合GB 20287-2006《农用微生物菌剂》中液态菌剂的技术指标要求。

1.3 试验设计

设置3 个菌剂处理，分别为黄色镰刀菌（F.c处理）、假禾谷镰刀菌（F.p 处理）、多利维生寡雄腐霉卵孢子（M 处理）。将菌剂分别与育苗基质混合均匀，接种量为基质干质量的5‰，补充水分使基质含水量保持在60%左右，然后装盘。每个菌剂处理分别播种3 个甘蓝品种，以等量无菌水处理为对照（CK），每处理6 盘。大田定植时每小区种6 行，每行10 株，共计60 株，株距20 cm，行距40 cm，小区面积5 m2，3 次重复，完全随机排列。

春茬甘蓝2020年2月21日播种育苗，4月9日大田定植，中甘21 和满月56 于6月14日采收测产，喜美于6月26日采收测产；秋茬甘蓝6月6日播种育苗，7月8日大田定植，中甘21 和满月56 于9月2日采收测产，喜美于9月14日采收测产。

春茬甘蓝定植前，分别采集幼苗根际土壤，对5 类可培养微生物进行类群分析。春、秋茬甘蓝采收期，每处理随机选取9 株植株，采用抖根法去掉根围土，使用毛刷将根际土壤刷下来，收集后分成2 份，1 份风干后过筛，用于土壤理化性质测定；1份放入无菌袋后4 ℃保存，对中甘21 秋茬采收期根际土壤进行细菌和真菌多样性分析。

1.4 项目测定

土壤养分指标测定：有机质含量测定采用重铬酸钾容量法，总氮含量测定采用H2SO4-全自动凯氏定氮仪，有效磷含量测定采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，有效钾含量测定采用NH4Ac 浸提-火焰光度法（鲁如坤，2000）。

土壤微生物类群分析：采用稀释涂布平板法培养5 类微生物，细菌使用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，稀释倍数为1×10-8；真菌使用马丁氏培养基，稀释倍数为1×10-3；放线菌使用改良高氏1号培养基，稀释倍数为1×10-5；氨化细菌使用蛋白胨琼脂培养基，稀释倍数为1×10-6；好气性自生固氮菌使用改良瓦克斯曼77号培养基，稀释倍数为1×10-5（林先贵，2010）。

细菌和真菌多样性测定：采用E.Z.N.A.DNA Kit（OMEGA，Bio-Tek，USA）提取中甘21 秋茬采收期根际土壤的DNA，分别利用细菌16S rRNA引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）以及真菌引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAG AGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTT CATCGATGC-3′）进行PCR 扩增。PCR 反应体系（20 μL）：ProTaq10 μL，上、下游引物（5 μmol·L-1）各0.8 μL，模板DNA 200 ng，ddH2O 补足20 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物（3 μL）采用2%（m/V）琼脂糖凝胶电泳检测，采用Quanti Fluor TM-ST（Promega，USA）进行定量，利用Tru Seq TMDNA Sample Prep Kit（NEB，USA） 构建Miseq 文库。将得到的细菌和真菌Miseq 文库，利用PE250 平台测序，Miseq 测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.5 数据处理

试验数据采用SPSS 22.0（IBM，USA）软件进行双因素方差分析（ANOVA），显著性差异用LSD 值检验（P＜0.05）。采用Origin 2021 软件作图和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

使用FLASH（V1.2.11）软件对测序Reads 进行pair-end 双端序列拼接，用QIIME 数据分析包删除低质量的原始序列。利用MAARJAM 数据库（http：//maarjam.botany.ut.ee/）丢弃嵌合序列。使用97%的同一性阈值将有效读数分配到操作分类单位（OTU）或虚拟分类单元（VT）中。利用SILVA（v128，http：//www.arb-silva.de）和MAARJAM 数据库鉴定代表性序列。

为进一步分析不同菌剂处理对不抗病品种中甘21 秋茬根际土壤细菌和真菌的调控效应，选取属水平优势种群计算其调控效应（孔涛 等，2021）。

调控效应=（SAi-SACK）/SACK×100%

式中：SAi为菌剂处理门水平物种的平均OTU；SACK为对照门水平物种的平均OTU。

2 结果与分析

2.1 两株内生镰刀菌对不同甘蓝品种产量的影响

从表1 可以看出，与对照相比，不同菌剂处理对3 个甘蓝品种的春茬产量均无显著影响；但均显著提高了中甘21 秋茬产量，而对满月56 和喜美的秋茬产量亦无显著影响。

表1 不同菌剂处理对不同甘蓝品种春、秋茬产量的影响

2.2 两株内生镰刀菌对不同甘蓝品种根际土壤养分含量的影响

从表2 可以看出，中甘21 F.p、M 菌剂处理及对照的春茬根际土壤有机质、总氮含量均显著高于秋茬，而有效钾含量均显著低于秋茬；M 菌剂处理及对照的春茬根际土壤有效磷含量均显著高于秋茬。春茬生产中，与对照相比，F.p 菌剂处理显著提高了根际土壤有机质含量，但有效钾含量显著降低；M 菌剂处理显著提高了土壤有效磷含量，而F.c、F.p 处理显著降低了有效磷含量。秋茬生产中，与对照相比，F.c 菌剂处理显著提高了根际土壤有机质含量，M 菌剂处理显著提高了土壤有效钾含量。

表2 不同菌剂处理对不同甘蓝品种春、秋茬根际土壤养分含量的影响

满月56 对照的春茬根际土壤有机质含量显著高于秋茬；3 种微生物菌剂处理及对照的春茬根际土壤有效钾含量均显著低于秋茬；F.p 菌剂处理及对照的春茬根际土壤有效磷含量均显著高于秋茬，而M 菌剂处理的春茬土壤有效磷含量则显著低于秋茬。春茬生产中，与对照相比，3 种微生物菌剂处理对根际土壤有机质、总氮、有效钾、有效磷含量均无显著影响。秋茬生产中，与对照相比，3 种微生物菌剂处理均显著提高了根际土壤有效钾含量，F.c 菌剂处理还显著提高了土壤有机质、有效磷含量，M 菌剂处理亦显著提高了土壤有效磷含量。

喜美3 种微生物菌剂处理及对照的春茬根际土壤总氮含量均显著高于秋茬，而有效钾含量均显著低于秋茬；F.c、M 菌剂处理及对照的春茬根际土壤有效磷含量均显著高于秋茬。春茬生产中，与对照相比，3 种微生物菌剂处理均显著提高了根际土壤有效钾、有效磷含量。秋茬生产中，与对照相比，F.c、F.p 菌剂处理均显著提高了根际土壤有效磷含量，而F.c 菌剂处理土壤有机质含量显著降低，M菌剂处理土壤有效钾含量显著降低。

2.3 两株内生镰刀菌对不同甘蓝品种根际土壤可培养微生物类群的影响

由图1 可见，除中甘21、满月56 和喜美根际土壤真菌数量外，不同甘蓝品种根际土壤可培养微生物类群数量存在显著差异。抗病品种满月56 和喜美对照的根际土壤4 类可培养微生物（细菌、放线菌、氨化细菌、固氮菌）数量均显著高于不抗病品种中甘21，且喜美（抗黄萎病和黑腐病）放线菌、氨化细菌和固氮菌数量高于满月56（抗枯萎病）。

图1 不同菌剂处理对不同品种甘蓝幼苗根际5 类可培养微生物类群的影响

大部分微生物菌剂处理都可以提高甘蓝根际土壤可培养微生物类群数量。与对照相比，F.c、F.p、M 菌剂处理均显著提高了3 个甘蓝品种根际土壤氨化细菌数量；显著提高了中甘21 根际土壤细菌、放线菌、固氮菌数量和满月56 根际土壤细菌、固氮菌数量，但降低了喜美根际土壤细菌数量；F.c、M 菌剂处理显著提高了满月56 根际土壤放线菌数量，但M 菌剂处理显著降低了喜美根际土壤放线菌数量。不同微生物菌剂处理对3 个甘蓝品种根际土壤真菌数量均无显著影响。表明，添加外源微生物菌剂可以改变甘蓝根际土壤可培养微生物类群数量，但受甘蓝品种差异性的调控。

2.4 两株内生镰刀菌对秋茬中甘21 根际土壤细菌和真菌群落结构的影响

2.4.1 对根际土壤细菌多样性的影响 由图2可见，F.c、F.p、M 菌剂处理均降低了GP6、Nitrososphaera和Gemmatimonas的丰度，提高了植物根际潜在有益细菌Ramlibacter、Pseudomonas、Flavisolibacter、Pseudoxanthom和Rhizobium的丰度。表明微生物菌剂处理可以改善甘蓝根际土壤细菌群落结构。

图2 两株内生镰刀菌对秋茬中甘21 根际土壤细菌群落属水平相对丰度的影响

2.4.2 对根际土壤真菌多样性的影响 由图3 可见，F.c、F.p、M 菌剂处理均明显降低了Cladorrhinum的丰度，提高了植物根际潜在有益真菌Humicola、Mortierella、Cephaliophora的丰度；此外，F.p 菌剂处理还提高了Heydenia、Rhizophlyctis丰度。表明两种内生镰刀菌可在甘蓝根际土壤成功定殖，明显影响了根际土壤真菌群落结构。

图3 两株内生镰刀菌对秋茬中甘21 根际土壤真菌群落属水平相对丰度的影响

2.5 主成分分析和菌剂调控效应分析

由图4-A 可见，主成分1（PC1）载荷为45.34%，主成分2（PC2）载荷为29.76%，这两个主成分解释了总变异的75.10%，能较好地反映原始变量的信息。2 个茬口的3 个甘蓝品种均沿X 轴分散，其中不抗病品种中甘21 均在X 负半轴，抗病品种满月56 和喜美均在X 正半轴，表明品种是影响甘蓝产量和根际土壤微环境的主因素。春茬3个甘蓝品种均分布在Y 正半轴，而秋茬均分布在Y 负半轴，表明重茬是影响甘蓝产量和根际土壤微环境的另一关键因素，即甘蓝品种和重茬栽种方式是影响甘蓝产量和根际土壤养分及微生物类群的主因素。

图4 甘蓝品种、菌剂处理与相关因素主成分分析和菌剂对根际土壤优势菌调控效应分析结果

由图4-B 可见，主成分1 载荷为31.23%，主成分2 载荷为26.09%，这两个主成分解释了总变异的57.32%，总变异量不太高的原因可能是由于整合了3 个甘蓝品种，但整合3 个甘蓝品种能更充分地体现菌剂处理因素的普适性。2 个茬口不同菌剂处理均沿X 轴分散，其中对照均在X 负半轴，而春、秋两茬所有菌剂处理均向X 正半轴迁徙，表明施用微生物菌剂是提高甘蓝产量和改善土壤根际微环境的重要因素之一。春茬3 个菌剂处理及对照均分布在Y 负半轴，而秋茬均分布在Y 正半轴，表明微生物菌剂对甘蓝产量和根际土壤微环境的调控同样受重茬栽种方式的影响。

由图4-C 可见，主成分1 载荷为51.81%，主成分2 载荷为21.64%，这两个主成分解释了总变异的73.45%，能较好地反映原始变量的信息。与对照相比，M 菌剂和两个内生镰刀菌依次沿X 正方向分散，表明微生物菌剂处理对根际养分及细菌多样性均有显著的改善。特别是F.c 在沿X 轴正方向分散的同时，还向Y 轴正方向偏移，表明F.c 菌剂处理对中甘21 产量和根际细菌多样性的综合调控效果最佳。

图4-B、C 主成分分析结果显示，M、F.c、F.p菌剂处理对根际微生物均有正向调控效果，分析3种菌剂处理对秋茬中甘21 根际土壤细菌和真菌属水平优势菌的调控效应，结果显示（图4-D），与对照相比，F.c、F.p 和M 菌剂处理均对甘蓝根际土壤细菌和真菌属水平优势菌的调控效应明显，均正向调控了Botryotrichum、Humicola、Mortierella、Cephaliophora、Arthrobacter、Streptophyta、Pseudomonas，均负向调控了Nitrososphaera的种群丰度。其中，F.c 菌剂对Cephaliophora的正调控效应达1 408.23%，F.p 菌剂对Rhizophlyctis的正调控效应高达1 835.70%，表明F.c 和F.p 菌剂调控了甘蓝根际土壤微生物的物种组成，虽然不同菌剂对根际土壤细菌和真菌的物种调控不同，但调控后的微生物物种组成对根际土壤养分驱动和根际健康发挥重要的作用。

3 讨论与结论

随着微生物肥料在蔬菜生产上的应用，微生物菌剂新型功能菌株研发及其对蔬菜品种间的应用和促生、生防机制是重点关注的问题（仝倩倩 等，2022；程国亭 等，2023）。本试验结果表明，不同甘蓝品种对重茬响应存在明显差异，抗病品种满月56 和喜美的产量变化不大，但不抗病品种中甘21的产量明显降低，表明选育抗病品种是缓解连作障碍的重要措施之一。抗病品种满月56 和喜美对照的根际土壤4 类可培养微生物（细菌、放线菌、氨化细菌、固氮菌）数量均显著高于不抗病品种中甘21，表明品种是影响根际土壤微生物类群的主要因素，根际土壤微生物类群和多样性的增加是抗病品种重塑根际健康的根源，可能也是缓解重茬造成产量损失的关键所在。

施用外源微生物菌剂是缓解连作障碍的关键技术措施之一。研究表明，接种放线菌菌剂对连作8年的温室甜瓜生长、产量和品质均有显著改善（王迪 等，2015）；胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌制备的复合菌剂通过增加细菌数量，防止土壤微生物由细菌型向真菌型转变，有效减缓连作8年辣椒的土壤障碍（高晶霞 等，2020）；枯草芽孢杆菌与酵母菌复合菌剂能够改善连作西瓜根际土壤微环境，降低连作障碍病害发生率，并提高产量和果实品质（于会丽 等，2020）；木霉制备的生物有机肥通过调控根区微生物群落，缓解连作障碍，有效提高了白菜-甘蓝连作体系下的蔬菜产量（刘正洋 等，2020）。大量研究证实了微生物肥料应用具有缓解蔬菜连作障碍、稳产保收的功效，而安全、高效、广谱功能微生物菌株的研发是微生物肥料功效发挥的关键。镰刀菌不仅是常见的植物病原菌，也是植物的主要内生真菌，已经从滨麦（潘雪玉 等，2018）、银杏（鞠秀云 等，2006）、红树林（游剑岚 等，2006）、丹参（王玉婷 等，2018）等植物分离得到内生镰刀菌功能菌株。内生镰刀菌具有弱致病性或非致病性，不但具有促生、生防和增强植物抗逆性的作用，还能降解酚类环境污染物，是极具开发潜力的微生物菌种资源（孙勇 等，2010）。本试验采用的2 株内生镰刀菌是从健康滨麦植株分离的内生真菌，经鉴定为黄色镰刀菌（F.culmorum）和假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum），分别属于Class2-1B 和Class-1C 产毒素类型，毒素产量极少，对北美枫香实生幼苗有显著的促生和抗盐胁迫功效（潘雪玉等，2018）；本试验结果表明，这2 株内生镰刀菌均能提高不抗病甘蓝中甘21 的春、秋茬产量。此外，这2 株内生镰刀菌已有明确的全基因信息（Shan et al.，2021），具有明显地开发应用潜力。

大量研究表明，微生物菌剂通过活化土壤微生物、改变土壤中微生物群落结构，减少有害菌群或增加有益菌群，为植物提供良好的生存环境，从而提高有效营养元素周转效率，促进植物生长，是重塑根际健康的有效驱动因素（Zhang et al.，2017）。本试验结果表明，施用微生物菌剂显著提高了不抗病品种中甘21 根际土壤细菌、放线菌、固氮菌和氨化细菌的数量，对维持根际健康、促进养分的活化和周转等发挥作用。主成分分析结果表明根际土壤养分和微生物类群均受微生物菌剂的正向调控：F.c、F.p 和M 菌剂处理对甘蓝根际土壤优势有益物种有明显的调控效应，F.c 和F.p 处理均正向调控了Ramlibacter、Pseudomonas、Flavisolibacter、Pseudoxanthom、Rhizobium、Botryotrichum、Humicola、Mortierella和Cephaliophora，而负向调控了与土壤氮循环有关的Nitrososphaera，研究表明该菌是硝化作用的重要驱动者（李文兴等，2021）。本试验中3 种真菌菌剂均明显降低了Nitrososphaera属的物种组成，与菌剂处理均显著提高中甘21 根际土壤氨化细菌和固氮菌数量的结果一致，表明在相同水肥条件下施用3 种真菌菌剂对不抗病品种中甘21 秋茬根际土壤氮循化的调控趋势一致。3 种菌剂处理均提高了Ramlibacter、Pseudomonas、Flavisolibacter、Pseudoxanthom、Rhizobium、Botryotrichum、Humicola、Mortierella和Cephaliophora属的丰度。研究表明，Ramlibacter（Lee et al.，2014）、Pseudoxanthom（Talwar &Ninnekar，2015）、Humicola（Tripathi et al.，2020）、Cephaliophora（Zlotnikov et al.，2007） 和Botryotrichum（Mocek et al.，1996）属的一些菌株不但通过分泌抗菌素能有效抑制病原菌，还具有降解农药和有毒有害金属污染物的功能，是生物防治和土壤修复功能菌的重要来源；Pseudomonas（Yasmin et al.，2022）、Mortierella（Ozimek &Hanaka，2021）、Flavisolibacter（Lee et al.，2016）和Rhizobium（Andrews & Andrews，2017）属的很多菌株不但具有固氮、解磷、解钾等促进养分周转和培肥土壤的功能，还在提高作物对环境抗逆性、促进作物生长等方面发挥重要的调控作用，是微生物肥料菌株资源挖掘与开发的重要来源。F.c、F.p处理与M 处理效果一致，对土壤典型有益微生物属水平的种群丰度发挥了正向调控效应，有利于维护根际健康。综上，这两株内生镰刀菌对甘蓝及根际土壤具有显著的益生效应，是农业绿色生产中极具潜力的菌种资源。