基于SSR标记的芡实遗传多样性分析及指纹图谱构建

徐 君 尹渝来 薛博文 周荣华 孙芳芳

（苏州市农业科学院，江苏苏州 215000）

芡实（EuryaleferoxSalish.）是一年生大型草本水生蔬菜，属睡莲科芡属（赵有为，1999）。我国的芡实可分为两大类：一类是刺芡，全身密生刺，不适合人工栽培，籽粒壳薄、粒小、粳性；另一类是苏芡，除叶背外全身无刺，适于人工栽培，籽粒壳厚、粒大、糯性（鲍忠洲，2010）。为发挥不同类型芡实的优势，研究人员开展了芡实的杂交育种工作（鲍忠洲 等，2010），通过系统选育获得了优质高产芡实新品种（尹渝来 等，2015）。为不断优化和创新芡实种质资源，需对现有芡实材料的遗传多样性进行进一步的明确。

与形态学鉴定相比，分子标记是一种快速、简便、经济的遗传多样性分析方法。目前，国内外对芡实资源的分子标记研究报道不多。国内学者通过扩增片段长度多态性（AFLP）和相关序列扩增多态性（SRAP）两种分子标记对芡实和王莲的杂交后代进行了分析研究（游永宁 等，2012），日本（Ayumi et al.，2011）和印度（Nitish et al.，2018）的学者分别采用简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）分子标记对本国的芡实资源做了遗传多样性分析。SSR 分子标记技术是以PCR为基础的DNA 多态性检测技术，具有共显性、稳定性好、多态性高和遗传信息量大的特点，被国际植物新品种保护联合会认定为鉴定植物品种的重要工具（Bachmann et al.，1990；张海雯 等，2020），已经成功应用于马铃薯（安苗 等，2023）、萝卜（王庆彪 等，2021）、青花菜（管俊娇 等，2021）、甜瓜（李超 等，2022）、苦瓜（崔俊杰 等，2022）和荷花（杜凤凤 等，2016；刘艺平 等，2023）等作物。本研究对包括苏芡和刺芡在内的10 份芡实材料进行SSR 扩增，并对芡实籽粒品质性状进行了检测和分析，以期明确国内芡实种质资源间的遗传距离，为芡实育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试10 份芡实材料取自苏州市水生蔬菜资源保存圃，包括有刺芡实2 份和无刺芡实8 份，无刺芡实中包括4 份地方栽培种和4 份杂交中间材料，具体信息见表1。采用池栽方式，每份材料一池，每池3 株，于2020年4月清明前播种，6月定植，定植后10 d 每株选1 片健康叶片打孔取样，样本洗净混合后用液氮处理并于-20 ℃保存。

表1 供试10 份芡实材料主要信息

1.2 DNA 提取和验证

使用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup 柱式植物基因组DNA 抽提试剂盒（B518261）提取全基因组DNA，使用Nano drop2000 检测DNA 的纯度和浓度，将提取DNA 浓度稀释至20 ng·μL-1，4 ℃保存备用。

1.3 SSR 分子标记检测

选用已报道的10 对微卫星引物Efer004、Efer008、Efer013、Efer015、Efer023、Efer032、Efer037、Efer045、Efer047 和Efer136（表2）进行扩增（Ayumi et al.，2011）。根据SSR 标记扩增结果，构建芡实指纹图谱并进行亲缘关系鉴定。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应的总体积为20.0 μL：2.5 μL DNA 模板，10 μL 2×PCR mix 和10 nmol·L-1正、反向引物各2 μL，不足体积用ddH2O 补足。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共计35 个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物的检测使用Qsep100 核酸蛋白检测仪（台湾），并进行标准化分析。内参大小依次为20、26、34、67、76、90、110、123、147、160、180、190、201、217、238、242、307、404、527、622、1 000 bp。

表2 10 对SSR 引物信息

1.4 品质性状测定

每品种取大旦期芡实去壳籽粒（鸡头米仁），测定水分含量及干燥籽粒的总淀粉、直链淀粉、粗脂肪、蛋白质、磷、钾、多酚及总黄酮含量。水分含量的测定采用直接干燥法（GB 5009.3-2016），总淀粉含量的测定采用酶水解法（GB 5009.9-2016），直链淀粉含量的测定采用单波长比色法（吴远琴 等，2014），粗脂肪含量的测定采用索氏抽提法（GB 5009.6-2016），蛋白质含量的测定采用分光光度法（GB 5009.5-2016），磷含量的测定采用分光光度法（GB 5009.87-2016），钾含量的测定采用火焰原子吸收光谱法（GB 5009.91-2017），多酚含量的测定采用福林-酚法（GB/T 8313-2018），黄酮含量的测定采用NaNO2-Al（NO3）-NaOH 比色法（胡晓潇，2022）。以上检测委托苏州市农产品质量安全检测中心进行。

1.5 数据统计分析

根据Qsep100 核酸蛋白检测仪检测结果，统计终浓度大于0.3 ng·L-1的扩增峰数量，位点有峰计为1，无峰计为0，每个峰相当于1 个等位基因位点。建立供试芡实材料与等位基因位点之间的0/1矩阵图，统计每对引物扩增出的总位点数（T）、多态性位点数（N）及每个位点扩增片段的长度，计算每对引物扩增的多态性位点百分率（PPL）：PPL=（N/T）×100%。利用Cervus 3.0.7 软件计算10 对SSR 引物的多态性信息含量（PIC），利用DPS 7.05 软件计算供试材料间的Nei & Li 相似系数，并构建UPGMA 聚类图。将10 份芡实材料按照扩增片段长度从小到大的顺序依次用阿拉伯数字编码，构建芡实指纹图谱（薛建华 等，2016）。品质性状测定数据利用DPS 7.05 软件计算供试材料间的欧式遗传距离并进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 芡实SSR 标记扩增结果多态性分析

Qsep100 核酸蛋白检测仪扩增结果如图1所示。统计10 份芡实材料SSR 扩增结果（表3），共获得29 个扩增位点，其中28 个为多态性位点，PPL 为96.6%。SSR 引物的PIC 值介于0.164～0.640，平均值为0.463，4 对SSR 引物的PIC 值大于0.500，表明供试芡实材料遗传多样性丰富，且所选10 对SSR 引物在10 份芡实材料中具有多态性，可用于芡实亲缘关系鉴定和构建指纹图谱。SSR 引物的扩增片段长度存在差异，扩增最短片段为102 bp（引物Efer047 扩增获得），扩增最长片段为238 bp（引物Efer045 扩增获得）。

图1 10 对SSR 引物对红花苏芡的扩增结果

表3 10 份芡实材料SSR 标记的多态性

2.2 芡实指纹图谱的构建

对10 份芡实材料扩增获得的所有位点按片段大小从小到大编码，建立编码标准（表4）。根据该标准，对10份芡实材料的扩增结果进行编码（表5），编码结果可以将10 份芡实材料完全区分。因此，构建的DNA 指纹图谱可作为芡实品系鉴定的重要依据。

表4 10 对SSR 核心引物扩增产物编码标准

表5 10 份芡实材料的SSR 指纹图谱

2.3 芡实籽粒品质性状多态性分析

对10 份芡实材料进行籽粒品质性状检测（表6），10 份芡实材料薄壳籽粒均含有丰富的蛋白质、磷、钾等矿质元素，以及高含量的多酚和黄酮等功能物质。这些结果表明，芡实有很高的营养价值。

表6 10 份芡实材料籽粒品质性状

水分含量是反应芡实籽粒成熟度（老嫩）的一个重要的指标，芡实淀粉由直链淀粉和支链淀粉构成，其中直链淀粉含量高低是决定芡实口感好坏的主要因素，脂肪含量也是鉴别植物种子和果实品质优劣的一个重要指标。试验结果显示，供试芡实去壳籽粒水分含量在40.7%～68.8%之间，两个刺芡（余干刺芡、白花刺芡）材料水分含量较低，分别为40.7%和46.9%，余干刺芡、白花刺芡的直链淀粉含量低于大多数无刺芡实，直链淀粉含量最低的是余干刺芡，仅为5.76%，而直链淀粉含量最高的无刺芡实（合肥芡实）为11.84%。此外，刺芡的粗脂肪含量也明显低于无刺芡实，说明无刺芡实材料的品质要优于有刺芡实材料。

2.4 芡实材料的聚类分析

依据10 份芡实材料的SSR 标记扩增结果分析及籽粒品质性状检测结果，分别对10 份芡实材料进行聚类分析。

根据SSR 标记扩增结果，10 份芡实材料间Nei & Li 相似系数如表7所示，介于0.100 0～0.894 7之间，平均值为0.580 3。通过UPGMA 聚类分析，以相异系数0.57 为阈值可将10 份芡实材料分为4个组，组Ⅰ包括地方栽培种红花苏芡、紫花苏芡和杂交品系6、杂交品系40，组Ⅱ包括白花苏芡和杂交品系7，刺芡品种余干刺芡和白花刺芡属于组Ⅲ，组Ⅳ包括杂交品系45 和合肥芡实。说明SSR 标记可区分不同类型的芡实资源（图2-A）。

图2 基于SSR 标记和芡实籽粒品质性状的聚类分析及分组情况

表7 10 份芡实材料间Nei & Li 相似系数

根据籽粒品质性状检测结果，10 份芡实材料间欧式遗传距离如表8所示，介于1.878 2～7.194 6之间，平均值为4.057 5。以欧式遗传距离3.50 为阈值可将10 份芡实材料分为3 类，其中4 个杂交品系和紫花苏芡属于组Ⅰ，白花苏芡、红花苏芡和合肥芡实属于组Ⅱ，2 份刺芡材料余干刺芡和白花刺芡属于组Ⅲ。即组Ⅰ主要为芡实杂交材料，组Ⅱ主要为苏芡的地方栽培种，组Ⅲ主要为刺芡品种（图2-B）。

表8 10 份芡实材料间欧式遗传距离

3 结论与讨论

本研究开展了基于籽粒品质性状的芡实遗传分析，该方法虽然不能完全区分芡实材料，但聚类结果能够将芡实杂交材料与苏芡、刺芡等栽培种区分，表明芡实杂交后代在关键性状，如籽粒品质等方面存在变异，因此采用杂交育种手段改善芡实籽粒品质是可行的。这些结果对于指导芡实的杂交育种工作具有重要意义。

芡实植株表型性状的差异主要表现在花色、籽粒色和有刺无刺等方面（鲍忠洲 等，2010），单独采用表型鉴定的方法区分大量芡实杂交材料相对较困难，这也导致了研究人员易混杂芡实材料，增加了育种难度。相较于籽粒品质性状的聚类结果，SSR 分析结果更为精确。本试验所用的10 对SSR引物，共获得29 个位点信息，其中28 个为多态性位点，具有较多的遗传信息，有利于实现鉴定不同类型芡实的目标。因此本试验采用的芡实SSR 扩增技术体系，可有效应用于芡实种质资源的遗传多样性、遗传结构和遗传距离分析。本试验还通过SSR 标记构建一套用于鉴定芡实材料的DNA 指纹编码系统，10 份芡实材料都有独特的DNA 指纹编码。该方法为芡实种质资源的保护、开发和利用提供了科学依据，同时也为其他作物的遗传多样性分析和指纹图谱构建提供参考。