辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

邵煜尊 张万红 王 惠 王玉洁 苗 圃 申莉莉 李 莹 焦裕冰 杨金广*

（1 中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草病虫害监测与综合治理重点实验室，山东青岛 266101；2 河南省烟草公司洛阳市公司，河南洛阳 471000）

辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），是正单链RNA 病毒，病毒粒子呈直杆状（Adams et al.，2009），其基因组RNA 约含有6 357 个核苷酸，编码126 kDa蛋白（P126）、183 kDa蛋白（P183）、运动蛋白（movement protein，MP）、外壳蛋白（coat protein，CP）。P126 蛋白具有甲基转移酶和解旋酶活性以及RNA 沉默抑制子功能；MP 蛋白通过调节胞间连丝的通透性帮助病毒粒子在细胞间进行移动；CP 蛋白主要与病毒粒子的形成相关，并参与病毒在维管束系统中的长距离传播（Nakazono-Nagaoka et al.，2011；Han et al.，2017）。

PMMoV 主要通过汁液摩擦、种子、病株残体等方式传播（Secrist & Ali，2018），主要侵染辣椒、甜椒和观赏性辣椒等多数辣椒品种，病害症状主要表现为病叶轻度褪绿、皱缩，在发病前期不易发现；果实发病往往呈现扁平、畸形特点，导致其商品价值和食用价值降低（Jiao et al.，2020）。另外，PMMoV 可自然侵染葫芦科蔬菜作物南瓜、黄瓜、甜瓜和豆科蔬菜作物豇豆（吴贺 等，2021），茄科作物番茄（Zhou et al.，2020）、茄子（刘雪建，2015）；笔者通过人工汁液摩擦发现，PMMoV可系统性侵染烟草，引起叶片皱缩，轻度褪绿。PMMoV 的大面积流行发生曾对意大利（Wetter et al.，1984）、日本（Kirit et al.，1997）等国家的辣椒生产造成严重经济损失；1994年，PMMoV 在中国新疆首次报道（向本春 等，1994）。研究表明，PMMoV 具有较强的遗传稳定性，能在辣椒制品和人类粪便中长期稳定存在，已经作为水资源中人类粪便污染的潜在指标（张昕喆 等，2020）。

目前已经报道应用较广泛的PMMoV 检测方法包括酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、 反转录PCR 法（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）以及核酸杂交法（王亚南和王锡锋，2008）。ELISA 作为最常用的传统病毒检测方法，易出现假阳性；RT-PCR 方法需要具有精准温控设备的PCR 仪，价格昂贵，耗时较长，操作略繁琐，且无法实现田间快速检测；核酸杂交法具有较好的特异性和灵敏度，但杂交时间长，杂交效率低（焦裕冰，2020）。因此，建立一种简便有效、可在田间应用的病毒检测方法对于防止因植物病毒传播造成生产上的损失极为重要。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由Notomi等（2000）建立，可以识别目标DNA 上4 种或者6 种不同的DNA 序列，依赖一个包含目标DNA 正义链和反义链序列的内部引物启动LAMP 扩增反应，在恒温条件下就可以高特异性、高效率的快速扩增出目标DNA。该技术目前已经应用在疫霉菌（Phytophthora ramorum）（Sondreli et al.，2023）、大豆花叶病毒（bean common mosaic virus，BCMV）（Çeli̇k et al.，2023）、玉米晚枯病菌（Cephalosporiummaydis）（何瑞玒 等，2023）、辣椒番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）（韦建明 等，2023）、草莓枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.fragariae）（侯圣凡 等，2022）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）（陈涛 等，2012）等植物病原检测以及人类相关疾病检测方面。逆转录LAMP（reverse transcription LAMP，RT-LAMP）方法是在LAMP反应体系中加入RNA 酶抑制剂和RNA 逆转录酶（孟若雪，2022），从而省略反转录步骤，该技术首次应用于日本感染山药花叶病毒（japanese yam mosaic virus，JYMV）的山药根、叶和繁殖体中（Fukuta et al.，2003）。

本试验以PMMoV 的CP 序列为靶标基因，F3/B3、FIP/BIP 为引物建立RT-LAMP 检测方法，筛选最佳反应条件并进行特异性检测、灵敏度验证，期望对PMMoV 的田间快速检测鉴定提供一条新路径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病毒 辣椒轻斑驳花叶病毒葫芦岛分离物（PMMoV-HLD，登录号：MG515725.1）、马铃薯Y 病毒（potato virus Y，PVY，登录号：NC_001616.1）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV，登录号：NC_001367.1）、 黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV，登录号：MN481937.1）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV，登录号：OL471718.1）均由烟草行业烟草病虫害监测与综合治理重点实验室保存，摩擦接种辣椒和本氏烟，发病后取发病叶片于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 试剂：RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）、HiScript® Ⅲ RT SuperMix for qPCR（ + gDNA wiper）试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）、三氯甲烷（天津市富宇精细化工有限公司）、无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）、异丙醇（天津市富宇精细化工有限公司）、RNA-free Water（北京索莱宝科技有限公司）、Colorimetric pH Sensitive LAMP Kit（DNA/RNA）试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）。

仪器：低温高速离心机（型号：1-14 k，德国SIGMA）、水浴锅（型号：DK-320，上海精宏实验设备有限公司）、PCR 仪（型号：CWE811，康为世纪生物科技股份有限公司）、电泳仪（型号：1645070，美国BIO-RAD）、紫外凝胶成像仪（北京赛智创业科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-LAMP 引物设计 从GeneBank 中下载PMMoV-HLD 外壳蛋白CP 的CDS 序列（登录号：MG515725.1）。利用LAMP 在线引物设计网站（https：//lamp.neb.com/#!/）设计RT-LAMP 引物序列：外部引物对F3 和B3，内部引物对FIP 和BIP；PCR 引物利用Primer5 软件设计，特异引物序列命名为PMMoV-F 和PMMoV-R，目的片段长度为474 bp。所有引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列见表1。

表1 RT-LAMP 引物信息

1.2.2 总RNA 提取 根据RNA isolater Total RNA Extraction Reagent 说明书提取叶片总RNA。

1.2.3 RT-LAMP 反应最佳温度和时间的筛选 根据LAMP 反应试剂盒（Colorimetric pH Sensitive LAMP Kit）说明书配制反应体系：RNA 模板1 μL，FIP/BIP Primer（10 μmol·L-1）各4 μL，F3/B3（10 μmol·L-1）各1 μL，2.5×pH Sensitive LAMP Reaction Mix 10 μL，N-Red stain（可视化pH 指示剂）1.5 μL，BstⅡ DNA polymrase（BstⅡ DNA聚 合 酶 ）1 μL，Reverse Transcriptase（High temperature 反转录酶）1 μL，RNA-free Water 补足25 μL。

反应温度分别设置为55、57、59、61、63、65 ℃，各温度下反应时间分别为20、30、40、50、60 min，整个反应过程于恒温水浴锅中进行。反应结束后，85 ℃孵育10 min，使BstⅡ DNA 聚合酶完全失活。肉眼观察反应液中颜色变化，洋红色为阳性，橙黄色为阴性；吸取8 μL 反应产物，在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设置为150 V，时间为30 min。电泳结束后在紫外凝胶成像仪上观察目的条带。根据RT-LAMP 反应液颜色变化的深浅程度、电泳条带的明暗程度确定最佳反应时间和温度。

1.2.4 RT-LAMP 特异性检测 以F3/B3、FIP/BIP为引物序列，PMMoV 同属病毒TMV 和不同属病毒PVY、CMV、TSWV 为模板，评估基于RTLAMP 的PMMoV 检测方法的特异性，以RNAfree Water 作为阴性对照。根据1.2.2 的方法分别提取5 种供试病毒的总RNA，利用1.2.3 确定的最佳反应温度和时间，在同一条件下进行RT-LAMP 反应，反应体系和反应条件参照1.2.3，反应结束后观察不同病毒之间反应液颜色变化，并进行琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 RT-LAMP 灵敏度检测 测定PMMoV 侵染辣椒叶片的总RNA 浓度，按照1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8稀释倍数进行梯度稀释，以RNA-free Water 作为阴性对照，分别进行RT-LAMP 检测和RT-PCR检测。观察两种检测方法在同一稀释梯度下琼脂糖凝胶电泳条带是否出现以及明暗程度。

1.2.6 田间PMMoV 植株样品检测 在田间采集疑似PMMoV 症状的辣椒叶片样本13 份，提取总RNA，分别进行RT-LAMP 检测以及常规RT-PCR检测，评价RT-LAMP 方法在田间检测PMMoV 的可行性。

根据HiScript® Ⅲ RT SuperMix for qPCR（ +gDNA wiper）说明书将提取的病叶总RNA 反转录为cDNA，总反应体系20 μL，具体反应步骤：4×gDNA wiper Mix 4 μL，RNA 模板1 μL，RNA-free Water 11 μL，金属浴42 ℃，2 min；在第一步反应产物中加入4 μL 5×HiScript III qRT SuperMix；反应条件为37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。以cDNA 为模板，PCR 反应体系：cDNA 模板1 μL，2×TaqMaster Mix（Dye Plus）12.5 μL，PMMoV-F/R（10μmol·L-1）各1 μL，RNA-free Water 补足25 μL。反应条件为：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35 个循环；72 ℃，5 min。PCR 终产物在质量分数为1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压设置为180 V，时间为15 min。电泳结束后在紫外凝胶成像仪上观察是否出现目的条带。

2 结果与分析

2.1 RT-LAMP反应的最佳温度和时间

以PMMoV 侵染的辣椒叶片总RNA 为RTLAMP 反应模板，按照1.2.3 的方法配制体系进行RT-LAMP 反应。结果如图1所示，所有RTLAMP 反应体系在55、57、59、61、63、65 ℃6 个反应温度下均有扩增，各反应体系中均含有N-Red pH 敏感型酸碱指示剂，RT-LAMP 反应的扩增产物导致反应液pH 发生变化，反应液颜色由橙黄色变化为洋红色，且随着反应时间的延长反应液颜色发生不同程度加深。在温度为55 ℃、反应时间为20、30、40 min 时，RT-LAMP 反应液仍为橙黄色，琼脂糖凝胶电泳无梯形条带出现；反应时间延长至50 min 时，反应液颜色微红，琼脂糖凝胶电泳呈现微弱的梯形条带。与55 ℃相比，57、59、61、63、65 ℃ 5 个反应温度下，反应时间30 min 时琼脂糖凝胶电泳便可观察到微弱梯形条带；温度为57 ℃，水浴反应时间为40 min 便能较好的完成检测；温度为65 ℃，水浴反应时间60 min，梯形条带最为清晰明亮，检测效果最好。综上，建立的PMMoV 的RT-LAMP 检测方法最佳反应温度和时间为65 ℃、60 min。

图1 RT-LAMP 在不同反应温度和时间下的扩增结果

2.2 RT-LAMP 特异性检测结果

通过RT-LAMP 方法对PMMoV、TMV、CMV、PVY、TSWV 5 种供试病毒的分析结果表明，以PMMoV 为模板的反应液在65 ℃水浴锅中反应60 min 后，颜色由原先的橙黄色变为洋红色，以另外4 种病毒以及RNA-free Water 作为模板的对照组反应液颜色未发生变化，仍然为橙黄色（图2-A）。取8 μL 上述恒温水浴反应得到的RT-LAMP 扩增产物进行电泳分析，结果显示（图2-B），仅有阳性对照PMMoV 出现RT-LAMP 特有的梯形条带，对照组TMV、CMV、TSWV、PVY 和RNA-free Water 均无特异性条带，进一步说明本试验建立的PMMoV 的RT-LAMP 检测方法具有较为可靠的特异性。

图2 RT-LAMP 特异性检测结果

2.3 RT-LAMP 灵敏度检测结果

测得PMMoV 侵染辣椒叶片的总RNA 浓度为630 ng·μL-1，经梯度稀释后，浓度分别为63、6.3、0.63、0.063 ng·μL-1及6.3、0.63、0.063、0.006 3 pg·μL-1。将稀释后的RNA 作为模板，分别进行RT-LAMP 和RT-PCR 检测，RT-LAMP 的反应条件为65 ℃，恒温水浴60 min。在RT-LAMP 反应中，随着RNA 稀释倍数的增加，电泳呈现的梯形条带清晰程度以及明亮程度依次减弱，在稀释倍数为1×10-8时，反应液颜色完全变为橙黄色，且琼脂糖凝胶电泳呈现极其微弱的梯形条带，基本不明显（图3-A、B）；在RT-PCR 反应中，稀释倍数为1×10-5时，琼脂糖凝胶电泳条带的明亮程度明显减弱，稀释倍数为1×10-6时，电泳条带非常微弱，稀释倍数为1×10-7时，基本看不到电泳条带（图3-C）。表明本试验建立的RT-LAMP 方法灵敏度比传统的RT-PCR 技术高10 倍，具有良好的灵敏度。

图3 RT-LAMP 和RT-PCR 灵敏度检测结果

2.4 PMMoV 田间样品检测

利用RT-LAMP 检测方法对13 份疑似PMMoV 症状的田间辣椒样品进行分析，结果如图4-A、B所示，样品3、4、5、7、9、10、11 和12颜色变化与阳性对照相同，并且电泳呈现正常的梯形条带，可确定为PMMoV 侵染的植株；样品2、6、8、13、14 和15 反应液颜色未发生变化，且电泳未出现任何条带，明确为非PMMoV 侵染的植株。利用RT-PCR 反应进行辅助检测，PCR 产物分别在1、3、4、5、7、9、10、11 和12号位置出现正常单一电泳条带（图4-C），与RT-LAMP 反应的检测结果一致，表明本试验所建立的RT-LAMP 检测技术具有较好的准确性与可行性。

图4 疑似PMMoV 田间辣椒样品的RT-LAMP 和RT-PCR 检测结果

3 结论与讨论

PMMoV 作为侵染辣椒的主要病毒之一，防治极为困难，对我国辣椒生产造成严重威胁（于海龙等，2021）。本试验建立PMMoV 的RT-LAMP快速检测方法，可在60 min 内完成对该病毒的准确鉴定，并且灵敏度比RT-PCR 技术高10 倍。与传统的PCR 检测方法相比具有以下特点：第一，RTLAMP 反应结果直观，可省略反转录的过程，并且扩增反应结束后不需要进行琼脂糖凝胶电泳，肉眼便可以直接观察结果进行判定，大大缩短了时间；第二，RT-LAMP 反应不需要精确且昂贵的PCR 仪器，在恒温水浴锅中就能完成所有反应步骤；第三，RT-LAMP 反应比传统PCR 的灵敏度高，有利于病毒侵染前期的准确检测；第四，RT-LAMP 反应的特异性更强，主要表现在LAMP 设计的引物需要识别靶标序列上面的4～6 条特异性区域，传统PCR 检测仅需要2 条（汤亚飞 等，2016）。但在RT-LAMP 配制反应体系的过程中极易受到空气中CO2的影响，引起可视化pH 指示剂的酸碱性变化，因此整个操作过程尽量迅速，且避免长时间频繁打开相关试剂。

综上，以PMMoV 外壳蛋白CP 序列为靶标基因，F3/B3、FIP/BIP 为引物构建的基于RT-LAMP技术的PMMoV 快速检测方法，具有特异性强、反应灵敏、操作简便、用时较短等优点。该方法的建立为PMMoV 的快速鉴定提供了一个新思路，在检测时间尽量短的前提下可以优先考虑采用此方法。另外，对于不具备其他检测方法所需条件的实验室，该方法可实现对PMMoV 病毒的准确鉴定；还可以直接应用于田间，对PMMoV 进行即时、简易、快速鉴定，在生产实践中具有一定的应用前景。