GSDMs家族蛋白介导细胞焦亡在抗肿瘤免疫中的作用*

季文博 李雲健 蔡和平 陈冠儒 田界勇 胡 磊戴海明* 刘海鹏***

（1）安徽省儿童医院临床药学部，合肥 230000；2）安徽医科大学基础医学院，合肥 230032；3）中国科学院合肥物质科学研究院健康与医学技术研究所，医学物理与技术安徽省重点实验室，合肥 230031；4）中国科学技术大学第一附属医院（安徽省立医院）胸外科，合肥 230001；5）皖南医学院基础医学院，芜湖 241002）

依据细胞形态、导致细胞死亡的生化反应和功能等方面特征，细胞死亡可以分为多种方式：细胞凋亡（apoptosis）、坏死性凋亡（necroptosis）、铁死亡（ferroptosis）、细胞焦亡（pyroptosis）等［1］。细胞焦亡是一种调节性细胞死亡（regulated cell death，RCD）［2］，最终导致质膜穿孔，迅速释放白介 素-1β （interleukin-1β，ⅠL-1β）、三 磷 酸 腺 苷（adenosine triphosphate，ATP）和高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）等炎性物质［3-5］。

目前癌症免疫治疗主要包括肿瘤疫苗、细胞因子疗法、过继细胞转移疗法和免疫检查点抑制剂治疗等，癌症免疫治疗的主要目标之一是重新激活抗原特异性T细胞，以促进其抗肿瘤活性［6］。这些治疗在一些患者中取得了成功，但在大多数患者中缺乏有效性，因此需要更多的方法策略来促进抗肿瘤免疫。最近的几项研究发现，通过介导细胞焦亡对肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）和抗肿瘤免疫产生影响，使TME处于免疫刺激状态，显著增加了肿瘤内抗原特异性CD8+T细胞和NK细胞（natural killer cell）的数量，并促进了肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TⅠL）中颗粒酶B（granzyme B，GzmB）、肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 和γ 干 扰 素（interferon γ，ⅠFN-γ）的表达，以及肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬［7-8］。本文将介绍细胞焦亡和它所触发的免疫反应，并讨论其在癌症治疗中的促免疫效应和影响。

1 细胞焦亡是由GSDMs家族蛋白介导的

细胞焦亡最初发现于受病原体感染的依赖于胱天蛋白酶1（Caspase-1）的巨噬细胞死亡［9-10］。后来的研究表明了Caspase-4 和Caspase-5 （人）/Caspase-11（鼠）也可以诱导细胞焦亡，并发现胞质蛋白Gasdermine D（GSDMD）是炎性Caspase（Caspase-1、4、5 和11） 引 起 焦 亡 的 关 键 介质［11-12］。这些炎性Caspase 识别并切割GSDMD 蛋白于Asp275（人）或Asp276（鼠）位残基，将具有成孔活性的N 端结构域（GSDMD-N）从抑制性结构域C 端（GSDMD-C）中解离出来［13-14］。游离的GSDMD-N可以与质膜内叶和线粒体中的磷脂结合，在膜上寡聚化，形成内径为10～15 nm的跨膜β桶状孔道。该孔道不具有选择性，小于孔道直径的小分子物质均可自由穿过［15-16］。焦亡的细胞会表现出特定的形态特征，在细胞膜破裂之前会形成气泡样囊泡，细胞体积增大，细胞器变形，细胞核变小［17-19］，失去细胞膜的完整性，细胞内的促炎分子能迅速有效地从细胞中释放出来，从而引发炎症。有研究表明，炎性小体激活GSDMD通过形成膜孔并从中释放大分子和细胞器促进细胞焦亡［20］。

细胞外环境中的钙离子通过GSDMD孔内流作为细胞启动膜修复的信号。钙离子内流可以招募转运必需内体分选复合体（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT） 到 质 膜，促进受损膜囊泡的脱落和释放，从而介导质膜的修复［21］。因此，GSDMD 孔介导的钙离子内流同时对焦亡有负调节作用，其作用可能与细胞死亡过程的阶段有关。综上所述，GSDMD 孔不仅执行焦亡，而且还对其进行正负调节，GSDMD被激活的细胞的命运可能至少部分取决于GSDMD孔数量和钙依赖的膜修复调节机制之间的平衡［22］。

在发现GSDMD蛋白通过Caspase-1/4/5/11的切割来介导细胞焦亡之后，后续的研究又发现其他GSDM家族成员也可以介导细胞膜破裂及细胞焦亡发生。邵峰等［23］发现，化疗药物诱导的Caspase-3激活可以切割GSDME引起细胞焦亡。该细胞焦亡也发生于抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞中［24］。目前发现的GSDMs 家族有6 个成员（GSDMA、GSDMB、 GSDMC、 GSDMD、 GSDME、DFNB59）［25］。除DFNB59外，GSDMs家族的其他成员都由类似于GSDMD的两个结构域组成。GSDMs蛋白的N端同GSDMD的GSDMD-N具有相同的质膜成 孔 能 力［14，25］，因 此，与GSDMD 类 似，其 他GSDMs成员被蛋白酶切割活化后同样会介导细胞焦亡。不同的蛋白酶可以切割激活不同GSDMs，除Caspase-1/3/4/5/8/9 可以激活GSDMs 蛋白外，颗粒酶A（granzyme A，GzmA）和GzmB可以分别切割并激活GSDMB和GSDME，中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase）和组织蛋白酶G（cathepsin G）可以切割GSDMD［8，23，26-27］（图1）。

2 细胞焦亡是免疫原性细胞死亡

能够诱导机体发生免疫反应的细胞死亡方式称为免疫原性死亡（immunogenic cell death，ⅠCD）［1］。ⅠCD 是一种受调节的细胞死亡形式，可以在具有免疫活性的宿主中激活适应性免疫反应。某些化疗药物、放疗、光动力疗法和一些新型ⅠCD诱导剂等可以诱发肿瘤细胞的ⅠCD［28-29］。炎症、佐剂性和抗原性是ⅠCD 的三个关键因素［30］。ⅠCD 导致的特定的损伤相关分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs）的释放以及暴露是产生佐剂性的主要机制，而抗原性主要是细胞死亡过程中抗原（对于肿瘤则是肿瘤相关抗原）的暴露［31］。被ⅠCD 诱导剂杀死的癌细胞可以在没有任何外来佐剂的情况下诱导针对癌细胞的抗原特异性免疫并抑制肿瘤生长。肿瘤相关抗原可能包括低亲和力T细胞抗原受体（TCR）识别的抗原，也可能来自具有癌细胞特异性翻译后修饰的蛋白质、病毒蛋白和非常规翻译产生的多肽。具有点突变和移码突变的蛋白质能提供新的抗原，赋予癌细胞特有的抗原性［22］。

肿瘤细胞发生ⅠCD 时释放的DAMPs，可以促进抗原递呈细胞的成熟、抗原处理和抗原呈递［23，28］。与ⅠCD 研究相关的DAMPs 有钙网蛋白（calreticulin，CRT）［32］、ATP、HMGB1、膜联蛋白1（Annexin-1）和Ⅰ型ⅠFN 等［33］。CRT 是一种内质网驻留蛋白，在ⅠCD前期，CRT从内质网管腔转移到质膜外表面，细胞表面暴露的CRT 作为一种“eat me”信号，促进巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）的吞噬作用［34］。CRT 还通过与抗原递呈细胞上的CD91结合，触发信号级联激活核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB），诱导促炎细胞因子的产生和Th17细胞的启动［35］。ATP是一种“find me（找到我）”信号，招募单核细胞、巨噬细胞和DC。胞外的ATP 与P2X 和P2Y 嘌呤受体结合，发挥免疫刺激作用［36］。HMGB1 是一个约25 ku 的核蛋白，在受炎症刺激和细胞死亡时从细胞中释放出来。细胞外HMGB1 可以与包括Toll 样受体（Tolllike receptors，TLRs）等10 多种不同的受体相结合，激活DC 并促进DC 向T 细胞递呈抗原［37］。Annexin-1 被认为可以增强正在死亡的癌细胞和表达甲酰肽受体1 的肿瘤浸润性DC 之间的相互作用［38］。

相对于坏死类的细胞死亡，细胞凋亡通常被认为是一种炎症较少、免疫原性较低的细胞死亡过程［7］。凋亡细胞的低免疫原性可能与其释放很少的DAMPs 和激活与凋亡相关的Caspase 有关，尤其是Caspase-3 和Caspase-7。在细胞凋亡过程中，Caspase-3/7 对翻转酶和拼接酶的切割导致磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）的外化，PS作为一个信号，在不引起炎症的情况下介导吞噬细胞清除凋亡细胞［35］。Caspase-3 还降解凋亡细胞中的环状GMP-AMP合成酶（cGAS）及其下游信号分子，从而抑制由于线粒体外膜通透性而释放的线粒体DNA 诱导的Ⅰ型ⅠFN 的产生［36］。此外，Caspase-3蛋白激活胞浆内钙非依赖性磷脂酶A2，从而导致花生四烯酸的免疫抑制脂质产物PGE2的产生［37］。研究还表明，凋亡细胞释放的是AMP，而不是ATP。细胞外的AMP 被代谢成腺苷，然后腺苷通过A2a 腺苷受体刺激巨噬细胞，诱导抗炎基因的表达［38］。

与细胞凋亡不同（表1），细胞焦亡被认为是一种新型的ⅠCD，并逐渐成为提高癌症免疫治疗效果的一个新策略。多项研究表明，细胞焦亡具有促进抗肿瘤免疫作用。即便是只有很少量的肿瘤细胞焦亡，GSDMA介导的细胞焦亡也可以促进抗肿瘤免疫的发生［7］。除了GSDME介导的细胞焦亡，杀伤性T 淋巴细胞（CTLs）通过颗粒酶B 诱导靶细胞发生焦亡；颗粒酶B介导的GSDMB激活所介导的细胞焦亡同时促进抗肿瘤免疫的发生［28］。在另一项研究中，Deets等［39-40］发现，焦亡的细胞肿胀和质膜破裂，导致促炎细胞因子ⅠL-1β、ⅠL-18和细胞内容物释放到细胞外间隙，促进DC成熟，激活炎症反应。Zhang 等［8］研究发现，细胞焦亡促进抗肿瘤免疫依赖于保护的杀伤性淋巴细胞，如NK细胞。这些研究都表明，细胞焦亡释放炎症介质，刺激DC成熟并激活CD8+T细胞，从而导致强烈的免疫反应，说明细胞焦亡是一种ⅠCD。

Table 1 Comparison between characteristics of apoptosis and pyroptosis表1 细胞凋亡与焦亡的常见特征比较

作为一种高免疫原性的细胞死亡形式，焦亡引起局部炎症并吸引炎性细胞浸润，为缓解TME 的免疫抑制和诱导全身免疫反应治疗实体瘤提供了极好的机会［41］。在最近的一项研究中，乳腺癌细胞在接受化疗药物多柔比星处理后，癌细胞会出现GSDME 依赖性的焦亡［42］。化疗药物同时诱导GSDME 的 表 达 和Caspase-3、Caspase-8 的 切 割，导致细胞焦亡， 并迅速释放 ATP 和HMGB1［4-5，16，42］。还有研究发现，专业吞噬细胞和非专业吞噬细胞都可以有效地吞噬焦亡的细胞。PS 在细胞焦亡时是外化的，但它是否参与了焦亡细胞的吞噬尚不完全清楚［5，43-44］。

3 细胞焦亡通过GSDMs孔道释放促炎分子及DAMP

炎症和佐剂性是ⅠCD的重要因素。细胞焦亡是促炎性及免疫原性细胞死亡，是因为焦亡细胞释放大量促炎分子和细胞器，如核苷酸、ⅠL-1家族细胞因子、HMGB1、核酸、线粒体等［16］，这些分子有些具有促炎性作用，有些则是诱导ⅠCD发生的重要DAMP。质膜中GSDMs 孔的形成首先导致离子梯度的消失和可通过孔的小胞质分子的释放。此后，由于渗透压变化和水流入导致细胞裂解，并释放更多的胞内物质。因此，不同大小的DAMPs 从焦亡细胞中释放出来的时间不同。

ATP 分子非常小，可以通过GSDMs 形成的小孔释放［4，16］。在细胞凋亡早期，ATP也会通过膜联蛋 白1 （pannexin-1，PANX1） 释 放［45］。然 而，Caspase-1 激活导致的焦亡细胞似乎比凋亡细胞更有效地释放ATP［4，38］。在有GSDMs 成孔的焦亡细胞中，核苷酸的快速外流可能导致细胞ATP/dATP的耗尽，从而抑制线粒体的凋亡途径。细胞外的ATP被P2X和P2Y嘌呤能受体感知，并发挥免疫刺激作用［46］。ATP 作为一个“find me”的信号，招募单核细胞、巨噬细胞和DC［4，45］。ATP 还激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体，并以依赖于嘌呤能受体（P2X7）的方式诱导ⅠL-1β的产生［47］。

ⅠL-1β 缺乏分泌信号，可以通过非常规机制从细胞中释放出来。在细胞焦亡时，成熟的ⅠL-1β 可以穿过GSDMs 孔被释放出来，而不需要细胞膜破裂［48］。也 有 一 些 情 况 下，成 熟 的ⅠL-1β 通 过GSDMD孔从活细胞中释放出来，称为吞噬细胞的过度激活［49-51］。例如，在肽聚糖诱导的非典型NLRP3 炎症小体激活之后，ⅠL-1β 通过GSDMD 形成的小孔释放，但细胞不发生死亡［51-52］。过度激活导致吞噬细胞数天的ⅠL-1β 的持续释放，这可能会增强适应性免疫反应［49］。最近的一项研究表明，DC能刺激长久保护性T细胞反应，过度激活的DC能增强这种刺激，而DC的过度激活依赖于炎性体依赖性细胞因子ⅠL-1β 的释放，从而诱导了更为持久的抗肿瘤免疫反应，对抗对程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）抑制敏感或抵抗的肿瘤［53］。在支原体脂蛋白/脂多肽刺激的巨噬细胞中，也观察到ⅠL-1β 的释放而没有细胞死亡［54］。

HMGB1 在炎症刺激和细胞死亡时从细胞中释放出来。在体外炎性小体激活后，HMGB1 以GSDMs 依赖的方式释放，并且需要细胞裂解后才能从焦亡的细胞中释放出来［55］。释放后HMGB1已被发现与10 多种不同的受体结合，包括Toll 样受体和晚期糖基化终末产物受体（the receptor of advanced glycation endproducts，RAGE），以发挥趋化和细胞因子样活性［56-57］。HMGB1的翻译后修饰决定了它的亚细胞定位和促炎活性，HMGB1在第23、45和106位有3个半胱氨酸残基，它们的氧化还原状态对它们的免疫活性至关重要［58-60］。诱导细胞焦亡可引起完全还原的HMGB1释放，完全还原的HMGB1具有很强的趋化活性［5］。另一项研究表明，完全氧化的HMGB1在凋亡细胞诱导的免疫耐受中起着核心作用［37］。因此，焦亡细胞比凋亡细胞更有效地释放免疫刺激形式的HMGB1。

由此可见，通过治疗或其他方法诱导与肿瘤相关的急性炎症能通过促进成熟的树突状细胞和巨噬细胞的抗原提呈、免疫细胞TME 中的募集、效应性和记忆性淋巴细胞的扩增和发育来增强宿主的抗肿瘤免疫。除了上述的ATP、ⅠL-1 家族细胞因子、HMGB1，细胞焦亡诱导的其他内容物或炎性因子、炎症小体的释放也具有促进免疫的作用［20，61-62］。

4 细胞焦亡促进抗肿瘤免疫及免疫检查点抑制剂疗效

最近的几项研究进一步阐明了细胞焦亡对肿瘤微环境和抗肿瘤免疫的影响。颗粒酶A 激活GSDMB，颗粒酶B 和Caspase-3 激活GSDME 介导细胞焦亡，焦亡可能会增强细胞毒性淋巴细胞对癌细胞的杀伤力［8，28］。研究发现，GSDME在黑色素瘤和乳腺癌细胞中的过表达显著抑制了免疫活性小鼠肿瘤的生长，而GSDME的缺失则不会有抑制作用［8］。GSDME 的抑瘤作用依赖于小鼠CD8+T 细胞、NK细胞和穿孔素（PFN），进一步说明了焦亡在淋巴细胞杀伤肿瘤细胞中的重要性。值得注意的是，肿瘤细胞焦亡可激活TME，使其处于免疫刺激状态。在肿瘤细胞中过表达GSDME显著增加了肿瘤浸润NK 细胞和抗原特异性CD8+T 细胞的数量，促进肿瘤浸润性淋巴细胞中颗粒酶B、PFN、ⅠFN-γ 和TNF-α 的表达，以及肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。此外，刘志博和邵峰团队［7］通过肿瘤原位可控激活细胞焦亡技术，在部分肿瘤细胞中诱导焦亡导致T细胞依赖性肿瘤消退，同时伴随着T细胞、NK细胞、M1巨噬细胞群的增加以及调节性T 细胞、M2 巨噬细胞、中性粒细胞和髓系衍生抑制细胞群的减少，提示焦亡与细胞毒性淋巴细胞可相互促进，通过正反馈环路促进抗肿瘤免疫作用。ⅠL-1β 可能在焦亡诱导的微环境激活中也发挥关键作用，但这可能取决于具体情况［7-8］。癌细胞通常表达免疫检查点分子，这会抑制肿瘤中T细胞的功能，程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）与T 细胞上的PD-1 相互作用，抑制靶标识别。阻断PD-1-PD-L1 途径与诱导肿瘤细胞焦亡的联合使用强烈地抑制了肿瘤的生长［7］。此外，NK 细胞和细胞毒性T 淋巴细胞通过焦亡杀死表达GSDMB的细胞。杀伤是由细胞毒性淋巴细胞释放颗粒酶A 选择性切割靶细胞GSDMB，释放了其N端成孔活性片段而诱导细胞发生焦亡（图2）。在一些肿瘤中，Ⅰ型ⅠFN、ⅠFN-γ 和TNF-α 可以上调GSDMB 的表达，促进细胞焦亡。诱导表达GSDMB 的结肠癌和黑色素瘤细胞焦亡，不影响免疫活性小鼠的肿瘤生长，然而，它显著增强了联合使用抗PD-1 抗体的抗肿瘤效果［28］。因此，焦亡可以作为ⅠCD的一种形式，与免疫检查点抑制剂协同作用，诱导抗肿瘤免疫作用。

Fig.2 Molecular mechanism of antitumor immunity and CRS induced by pyroptosis图2 细胞焦亡诱导的抗肿瘤免疫和细胞因子释放综合征分子机制

5 细胞焦亡对肿瘤治疗的不利因素

肿瘤细胞焦亡诱导的炎症作用并不总是对肿瘤治疗有利。最近的一项研究表明，GSDME介导的癌细胞焦亡可导致细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS），这是在CAR-T 细胞治疗常见的并发症［63］。在小鼠CAR-T 治疗模型中，CD19识别CAR-T细胞引起的大量B白血病细胞恶性焦亡导致ATP 的显著释放，ATP 作为一种警报素，被宿主巨噬细胞的P2X7 受体识别，激活巨噬细胞中NLRP3 炎性小体，从而触发CRS（图2）。抑制ATP-P2X7通路和Caspase-1 活性可改善CAR-T诱导的CRS。CAR-T 治疗也会引起神经毒性，这种毒性可能很严重，血脑屏障会被破坏，对阻断ⅠL-6没有反应，人们对其机制知之甚少。但由于神经元高表达GSDME，小胶质细胞高表达GSDMD，因此CAR-T 治疗引起的神经毒性可能与此有关［64］。

同时，细胞焦亡也增加了各种肿瘤治疗的毒副作用。GSDMs 在胃肠道和造血细胞中高表达，因此胃肠道和造血系统是化疗毒副作用发生的重要部位。Gsdme-/-小鼠对化疗药物如顺铂、5-FU和博莱霉素的耐受性，比Gsdme+/+WT 小鼠好得多；毒副作用明显减少，包括体重减轻、胃肠道毒性、造血毒性和肺部毒性显著降低，脾淋巴细胞耗竭减轻［23］。GSDME在心肌中也高度表达，可能会加剧蒽环类药物的心脏毒性。CD34+造血干细胞也表达Caspase-1 和GSDMD。虽然Val-boroPro 能诱导急性髓系白血病细胞发生焦亡，但它也能激活正常B细胞和CD34+造血干细胞中的焦亡［65］。如果GSDMs的激活仅限于肿瘤，那么触发GSDMs激活的抗肿瘤作用将是最有效的。一种诱导肿瘤细胞焦亡而不会对正常组织细胞杀伤的策略是将活性GSDMs 蛋白输送到细胞内。为了达到这个目的，邵峰院士课题组［7］建立了一种生物正交化学体系，其中活性GSDMA3 蛋白通过硅基醚连接物连接到金纳米颗粒上，该连接物可被癌症成像探针苯丙氨酸三氟硼酸盐（Phe-BF3）催化的脱硅反应所切割。纳米粒和Phe-BF3 都选择性地在肿瘤中积聚，使活性GSDMA3能够在肿瘤细胞中得到控制释放。此外，病毒载体也可用于在肿瘤细胞中选择性地诱导焦亡。

6 总结和展望

细胞焦亡是由GSDMs 家族介导的一种促炎性细胞死亡方式。最近对细胞焦亡的研究大大提高了人们对其引发炎症和免疫反应发生的机制和作用的认识。GSDMs 被Caspases 和颗粒酶激活，可能使肿瘤微环境由“冷”变“热”，增强抗肿瘤免疫，特别是与免疫治疗相结合，在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景。尤其是通过药物或者其他物理治疗方法诱导肿瘤细胞发生焦亡，可能能有效促进免疫检查点抑制剂疗效，部分解决目前免疫检查点抑制剂受益患者比例较低的问题。不同肿瘤中表达有不同的GSDMs，这可能会导致个性化的诱导细胞焦亡方式从而促进抗肿瘤免疫，或者涉及针对特异肿瘤中GSDMs 表达的组合疗法。同时，通过特异性地在肿瘤组织中诱导GSDMs 表达或者将GSDMs靶向导入至特定肿瘤细胞中，因为即便少量肿瘤细胞发生焦亡也会促进抗肿瘤免疫，将会避免由于肿瘤靶向过程的效率低而导致的抗肿瘤疗效偏低。

但是，也应注意到肿瘤细胞焦亡过程中产生的副作用问题。在肿瘤浸润性巨噬细胞和正常黏膜细胞或血细胞中，它可以加重CAR-T 细胞治疗导致的化疗毒性或细胞因子释放综合征。因此，在相应的治疗过程中需要有效监测细胞焦亡导致的副作用，将毒副作用降低。另外，在特定肿瘤治疗中通过特异性GSDMs 抑制剂去抑制细胞焦亡发生也是一种可能的手段。