SBA-15固定化黑曲霉脂肪酶对柚皮苷的区域选择性酰化

姜丽艳, 董洪举, 杜映达

(吉林大学 生命科学学院,吉林 长春 130012)

柚皮苷又名柚皮素-7-O-新橙皮糖苷,是一种重要的天然类黄酮,具有显著的抗氧化和抗癌活性[1-5],例如,柚皮苷可以减轻红细胞膜脂质过氧化和辐射损伤[6-7],还能抑制人膀胱癌细胞和乳腺癌细胞的活力和增殖等[8-9]。另外,最新研究还发现柚皮苷能预防和治疗帕金森综合症等神经退行性疾病,对神经系统具有较好的保护作用[10]。但由于柚皮苷的溶解性和稳定性较差,严重限制了其在精细化工、食品和医药等行业的广泛应用[11-12]。目前,对柚皮苷进行结构修饰,改善其生物利用度,提高其生理活性或增加新的功能,成为新药研制的有效途径之一。但是由于黄酮结构中羟基较多,容易形成副产物,影响其反应的产率和选择性。因此,寻找低毒、少污染、高选择性以及高效的柚皮苷结构修饰方法显得尤为重要。

据文献报道,利用催化效率高、反应条件温和及环境友好的生物催化方法对黄酮类化合物进行结构修饰[13],以提高其溶解性,改善生物利用度,赋予其特殊的生物功能一直是酶催化领域的研究热点[14-15]。 KONTOGIANNI等[11]研究了Novozyme 435催化柚皮苷与中碳链脂肪酸酯化反应,表明了该酶的酯化反应具有区域选择性,并遵循了Michaelis-Menten动力学。MELLOU等[16]也采用不饱和脂肪酸对柚皮苷进行了酯化反应,发现合成的酯具有更好的抗血管生成和抗肿瘤性能。此外,HATTORI等[17]的研究显示,柚皮苷烷基酯具有较强的抗炎作用。然而酶的低稳定性、难以回收和重复利用等缺点阻碍了柚皮苷的工业化生产。因此,把酶固定于载体上的固定化酶,不仅能够克服游离酶的缺点,而且具有良好的稳定性、易分离回收且能够重复使用,同时酶的固定化也是酶催化研究的必要手段。

介孔材料SBA-15具有高度有序的孔道结构、较大的孔径以及表面富含活性羟基等一系列优势,在脂肪酶固定化的应用方面受到越来越广泛的关注。为了加快柚皮苷的医药转化进程,本研究聚焦领域热点,采用介孔材料SBA-15将黑曲霉脂肪酶进行固定化处理,并用于柚皮苷的区域选择性酰化反应(图1)。同时,考察了反应溶剂、酰基供体、水活度及反应温度对柚皮苷酰化反应的影响。在最佳的催化条件下,酶活最高(153±5 μmol·h-1·g-1),酶转化率可达92.00%±2.43%,且该酶对柚皮苷的C-6′位置具有区域选择性(>99%)。

图1 固定化ANL催化柚皮苷的区域选择性酰化反应Figure 1 Regioselective acylation of naringin catalyzed by immobilized ANL

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ZJQ254型紫外检测仪;BSA224S-CW型电子天平;Aqualab4 TE/TEV型水活度测定仪;AC500型核磁共振波谱仪;SKY-100C/100B型恒温摇床;Agilent 1100型高效液相色谱仪;RE-501型旋转蒸发仪;AB5800型质谱仪;Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪。

脂肪酶(Aspergillusnigerlipse, ANL)购自科创生物科技公司;SBA-15由吉林大学生命科学学院吴卓夫博士提供;柚皮苷购自Sigma公司。其余所用试剂均为分析级试剂,购自四平化学试剂有限公司。

1.2 固定化黑曲霉脂肪酶

介孔材料SBA-15是一种新型的酶固定化载体,具有高比表面积、均一的大孔径分布和良好的水热稳定性,且孔内表面的羟基对酶分子有较强的吸附能力,因此适合作为酶的固定化载体。用磷酸缓冲溶液将ANL预先配置为10 mg/mL, 60 mL的酶液,再与2 g孔径为7.57 nm的SBA-15在烧瓶中混合,在pH=7.0、 30 ℃条件下机械搅拌24 h(8000 rpm, 5 min)。收集沉淀物,并采用磷酸缓冲溶液(3×60 mL)和相同的离心条件洗涤沉淀物,晾干过夜,得到固定化ANL。采用Bradford蛋白测定法测定固定化效率,测得SBA-15对ANL酶的吸附量为182 mg/g[18]。

1.3 酶促反应

柚皮苷的酶促乙酰化反应体系为:柚皮苷0.20 mmol,酰基供体4.00 mmol,有机溶剂20 mL,混合在密封瓶中,0.4 nm分子筛干燥过夜。在混合物中加入适量的水,测定水活度。通过加入550 mg的固定化ANL开始反应。以不加酶的反应体系为空白试验。反应结束时,将酶过滤即终止反应并将溶剂旋转蒸干,0.22 μm微孔滤膜过滤。反应进程通过HPLC检测。所有的实验重复3次。值得注意地是,为了保持不同的水活度,每次水的加量不同,且此处的水不能定量。

1.4 水活度的测定

所有的反应试剂在133 Pa真空条件下预干燥12 h,在反应混合物中加入适量水维持一定的水活度。实验中水活度通过水活度测定仪进行实时测量。

1.5 分析与结构鉴定

该反应由高效液相色谱仪在330 nm波长下进行监测。采用色谱柱(4.6 mm×250.0 mm×5.0 μm)进行分析。流动相为梯度甲醇水溶液(表1),流速为1.0 mL/min,柱温为30 ℃,进样量为10 μL,柚皮苷和其乙酰化产物的保留时间分别为8.88 min和10.49 min。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Details of the gradient programme

利用核磁共振波谱仪测1H和13C谱图,内标为四甲基硅烷,溶剂为氘代-DMSO,对柚皮苷衍生物进行结构分析鉴定。实验数据分析表明,柚皮苷非水相乙酰化反应的衍生物为6′-乙酰化柚皮苷;1H NMRδ: 12.06(d, 1H), 9.64(s, 1H), 7.33(d, 2H), 6.81(s, 2H), 6.12(d, 1H), 6.07(d, 1H), 5.55～5.41(m, 3H), 5.18(dd, 1H), 5.10(d, 1H), 4.74(d, 2H), 4.27(d, 1H), 4.04(dd, 1H), 3.76～3.67(m, 3H), 3.49(d, 2H), 3.36(s, 3H), 3.23～3.15(m, 2H), 2.72(dd, 1H), 1.92(s, 3H), 1.24(s, 3H);13C NMRδ: 18.5, 42.6, 63.7, 68.8, 70.4, 70.8, 70.9, 72.3, 74.1, 77.4, 79.3, 95.7, 96.8, 97.7, 101.0, 103.8, 115.6(2C), 128.9, 129.0, 129.1, 158.3, 163.3, 165.0, 170.6, 197.8。

2 结果与讨论

2.1 ANL的固定化分析

傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析是利用骨架振动吸收谱带的强度与吸收峰的位置来反应化合物的结构,根据振动峰所在的峰值位置来鉴定介孔材料骨架原子的类型以及基团变化等结构信息。本实验取适量的SBA-15、 ANL和固定化ANL样品,采用溴化钾压片法,扫描范围为400 cm-1～2000 cm-1。图2为负载ANL前后的SBA-15样品FT-IR谱图。如图2所示,在804 cm-1出现强烈的Si—O—Si对称伸缩振动峰,1546 cm-1处的吸收峰可能是吸附水或是硅羟基的伸缩振动引起的吸收峰。通过比较SBA-15、游离的ANL和固定化ANL的FT-IR谱图可以发现,ANL吸附SBA-15后,吸收峰强度明显下降,表明SBA-15表面的硅羟基与酶分子表面的氨基通过氢键进行吸附,ANL成功地负载于SBA-15上。

ν/cm-1

2.2 酰基供体对柚皮苷区域选择性酰基化的分析

酰基供体对柚皮苷酰基化的影响,如表2所示。由表2可见,对所选用的酰基供体,固定化ANL对柚皮苷C-6′位点均表现出较好的区域选择性(>99%),以乙酸乙烯酯为酰基供体时酶活最高(153±5 μmol·h-1·g-1)。但长链酰基供体在空间上阻碍了反应,降低了酶活,该现象与JIANG[19]和WANG等[20]的发现是一致的。因此,以下实验均选用乙酸乙烯酯作为柚皮苷非水相酶促乙酰化反应的最佳酰基供体。

表2 酰基供体对柚皮苷区域选择性酰基化的影响*Table 2 Effect of acyl donor on the regioselective acylation of naringin

2.3 反应介质对柚皮苷区域选择性酰基化的分析

有机溶剂作为反应介质对非水相酶催化有着重要的影响,这不仅是由于有机溶剂决定了反应物在其中的溶解度及扩散限制,而且在一定程度上有机溶剂也会影响脂肪酶的催化活性。大量研究表明,有机溶剂对脂肪酶催化活性及选择性的影响主要与有机溶剂的极性有关[21-22]。溶剂疏水性参数logP值,即分配系数的对数,为某一溶剂在正辛醇与水相中的分配比例。

本实验选择了7种不同极性的有机溶剂来探究反应介质对柚皮苷乙酰化反应的影响。由表3的结果可知,固定化ANL在反应介质为丙酮时催化柚皮苷的乙酰化反应活性最高(153±5 μmol·h-1·g-1)。而固定化ANL在极性较强的二甲基亚砜中,几乎不发生柚皮苷的酶促反应,可能是由于强极性的有机溶剂具有很强的亲水性,使它们具有很强的剥夺酶表面必需水的能力,酶表面的必需水可以保持酶分子构象的灵活性,而这种构象的灵活性对于酶的催化活性是至关重要的。环己烷的极性过弱,导致底物不易进入酶分子的必须水层,从而影响酶的催化活性,由此可见,只有当反应溶剂的logP值在适宜的范围内,ANL才能呈现最高的酶活。

表3 反应介质对柚皮苷区域选择性酰基化的影响*Table 3 Effect of reaction medium on the regioselective acylation of naringin

2.4 水活度对柚皮苷区域选择性酰基化的分析

非水相酶催化反应体系中需要1个最适合的含水量,用以维持酶分子完整的空间构象结构。水活度(aw)即反应体系中水的蒸气压与纯水的蒸气压之比,用以表示酶分子结合水量的多少[23]。实验进一步研究了aw对柚皮苷区域选择性酰基化的影响,反应条件为:丙酮20 mL,柚皮苷0.2 mmol,乙酸乙烯酯4 mmol,固定化ANL550 mg,反应温度为40 ℃,aw的实验范围为0.05～1.00,结果如图3所示。由图3可知,当aw的值为0.60时,固定化ANL催化柚皮苷的酶活达到峰值(153±5 μmol·h-1·g-1),而进一步提高或降低水活度会明显降低酶活。aw过低时酶的催化活性差,可能是由于在非水相酶催化的反应中,需要一定的必需水来使酶维持适当的构象以保持其催化活性,而过低的水活度会使固定化ANL处在过于“刚化”的构象,抑制了酶与柚皮苷及乙酸乙烯酯“诱导契合”的过程,所以酶活较低。当aw的值大于0.60时,可能会由于水活度的增加导致酶分子的聚合,限制底物到达酶的活性部位;或在过高的水活度下,固定化ANL会展现出过度“柔性”的构象,而酶可能过于灵活而无法保持其合适的构象,导致酶活降低[24-25]。因此,本实验选择aw=0.60作为固定化ANL催化柚皮苷乙酰化反应的最适水活度。

水活度图3 水活度对柚皮苷区域选择性酰化的影响Figure 3 Effect of water activity on the the regioselective acylation of naringin

2.5 温度对柚皮苷区域选择性酰基化的分析

温度也是影响酶性能的重要因素[26],因此本文在丙酮为20 mL,柚皮苷为0.2 mmol,乙酸乙烯酯为4 mmol,固定化ANL为550 mg,aw=0.60的条件下,研究了温度对柚皮苷区域选择性酰基化的影响,结果如图4所示。由图4可知,固定化ANL酶活在40 ℃时最高(153±5 μmol·h-1·g-1),而随着反应温度的进一步增加,酶催化活性则有明显降低。催化温度低于40 ℃时,随着反应温度的升高,一方面反应体系内的底物和酶分子运动速度加快,增加了酶和底物分子碰撞机率,有助于形成“酶-底物”复合物,从而提高了反应速率;另一方面,随着温度的增加,固定化ANL会产生波动来缓解反应的空间斥力,在高温下这种波动也可能会导致反应速度的增加[19, 27-28]。然而,当温度大于40 ℃时,温度进一步增加可能会破坏脂肪酶分子的构象,因为高温可能会引起非共价键的破坏,从而导致酶活的显著降低[29]。因此,本文选择40 ℃作为固定化ANL酶催化柚皮苷乙酰化反应的最适反应温度。

温度/℃图4 温度对柚皮苷区域选择性酰基化反应的影响Figure 4 Effect of temperature on the regioselective acylation of naringin

2.6 反应的时间过程

为了检测在丙酮为20 mL,柚皮苷为0.2 mmol,乙酸乙烯酯为4 mmol,固定化ANL为550 mg,aw=0.60,反应温度为40 ℃的最优催化条件下,柚皮苷非水相酶促乙酰化反应的时间进程,在催化反应的过程中间隔取样,进行反应产物实时分析。柚皮苷非水相酶促乙酰化反应的时间进程如图5所示。从图5可以看出,在最优催化条件下,在起始反应时间为0～4 h内,柚皮苷乙酰化衍生物的合成速度很快,随着催化反应时间的延长,柚皮苷乙酰化衍生物急剧增加,在反应时间为12～24 h内,柚皮苷乙酰化衍生物呈缓慢增加的趋势。在催化反应延长至32 h时,柚皮苷乙酰化衍生物的转化率达到最大92.00%±2.43%。值得注意地是,整个反应过程中只检测到1种柚皮苷乙酰化衍生物。由此可见,固定化ANL催化柚皮苷乙酰化反应具有高度的位置选择特异性。

时间/h图5 柚皮苷的区域选择性酰化反应进程Figure 5 Time course of the regioselective acylation of naringin

2.7 固定化ANL的重复利用性分析

固定化酶的重复利用可以在工业生产中节约成本。本实验于最优反应条件下,在每个周期反应结束后离心回收固定化ANL(10000 rpm, 5 min, 4 ℃),经洗涤后,20 ℃条件下晾干。然后在接下来的反应中反复应用回收酶。回收酶的活性与第1个周期的酶活(100%)进行对比。由表4所示结果表明,在重复利用5次以后,固定化酶的残留活力仍可保持最初酶活力的91.40%,表明固定化ANL有一定的操作稳定性。但由于物理吸附的作用力较弱,经过多次的反应、抽滤和洗涤后,一部分酶分子从孔道中脱落,因而酶活力有所下降。

表4 固定化ANL的可重复性Table 4 Reusability of the immobilized ANL

酶的固定化一直是酶工程领域的研究热点。本研究采用SBA-15固定化ANL实现了柚皮苷的区域选择性酰化反应。研究表明:固定化ANL催化柚皮苷的特异性乙酰化反应受酰基供体、反应溶剂、水活度和反应温度的影响。固定化ANL酶促柚皮苷的非水相乙酰化反应的最佳工艺条件为:反应溶剂为丙酮(20 mL),酰基供体为乙酸乙烯酯(4 mmol),水活度为0.60,反应温度为40 ℃。在此最佳反应条件下,固定化ANL的最高酶活为153±5 μmol·h-1·g-1,最大转化率为92.00%±2.43%,且固定化ANL对柚皮苷的C-6′位置具有区域选择性(>99%)。可见,固定化ANL在柚皮苷非水相酶促乙酰化反应中表现了高催化活性、高区域选择性及较好的稳定性和重复使用性的特点。