外泌体非编码RNA调控骨折愈合机理的研究进展△

苏友祥，李志超，管华鹏，李念虎*

（1.山东中医药大学，山东济南 250014；2.山东中医药大学附属医院，山东济南 250014；3.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

骨折是由外力或累积应变引起的骨结构完全或部分断裂［1］。骨折愈合由数千个基因进行调控，并受到细胞因子、生长因子等分子的显著影响［2］。骨髓间充质干细胞成骨分化［3］，成骨细胞的分化、增殖和迁移［4］，破骨细胞的骨吸收及血管生成与骨折的愈合有着密切关系［5～7］。据统计，有5%～10%的患者会出现愈合困难［8，9］。因此，促进骨折的快速修复和愈合在临床中具有重要意义［10，11］。外泌体是直径为40～100 nm 的囊泡状体［12，13］，在组织稳态、细胞间通讯及组织和器官的再生修复过程中发挥重要作用［14～17］。外泌体中含有的非编码RNA （non- coding RNA,ncRNA）参与骨折的愈合过程，并对愈合过程中骨髓间充质干细胞成骨分化，成骨细胞的分化、增殖和迁移，破骨细胞的骨吸收及血管生成等方面起调控作用。本文旨在综述近年来外泌体ncRNA 在骨折愈合中的调控机理及外泌体ncRNA 在骨折愈合中的潜在应用。

1 外泌体ncRNA 调控骨髓间充质干细胞成骨分化

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是骨修复中的最佳祖细胞来源，其分化能力较强，可分化为成骨细胞、造血细胞、神经细胞等；近年来，许多研究者通过局部注射或血管介入BMSCs 的方法对骨折进行治疗并取得良好的实验结果［18］。郑光磊等［18］在兔的骨折不愈合模型中采用上述办法，并通过监测外周血中碱性磷酸酶、骨钙素水平的变化，骨折端影像学表现及病理组织学改变来评价效果，结果显示BMSCs 能够提高骨骼代谢水平，加快骨痂生成，促进BMSCs 的成骨分化，进而促进骨折愈合。

外泌体ncRNA 也可以有效调控BMSCs 的成骨分化，从而促进骨折愈合。Huang 等［19］在BMSCs 和小鼠的成骨细胞中通过模拟物/抑制剂调节miR-19b 的表达，研究这些变化对成骨因子、骨细胞矿化和骨折愈合的影响。他们通过功能得失分析，鉴定出了miR-19b 与含WW 域E3 泛素蛋白连接酶1/SMAD 特异E3 泛素蛋白连接酶2（WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1/SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 2,WWP1/SMURF2）的靶向关系，并发现miR-19b 通过靶向WWP1 和SMURF2 促进人BMSCs 向成骨细胞分化。WWP1 或SMURF2 的过表达降解了BMSCs 中的靶蛋白KRUPPEL 样因子5（Kruppel like factor 5,KLF5），抑制骨折愈合；KLF5 基因敲除通过调节Wnt/β-Catenin 信号通路延缓骨折愈合。此外，miR-19b 靶向WWP1 或SMURF2，通过KLF5/β-Catenin 信号通路可促进骨折愈合。综上，BMSCs 来源的外泌体miR-19b 通过Wnt/β-catenin 信号通路抑制WWP1 或SMURF2 的表达，上调KLF5的表达，从而促进骨折愈合。Xiong 等［20］发现从M2巨噬细胞分离的外泌体（M2 macrophagy-derived exosome,M2D-Exos）能够通过干扰BMSCs 的体外和体内分化而加速骨折愈合，其主要机制为M2D-Exos 携带的miR-5106 抑制盐诱导蛋白2 和3（salt inducible kinase 2 and 3,SIK2 和SIK3）的表达促进BMSCs的成骨分化。

人脂肪间充质干细胞（human adipose mesenchymal stem cells,hASCs）由于其快速增殖和在人体内广泛分布的优势，是产生大量外泌体的理想间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）类型。Chen 等［21］通过对hASC 进行遗传修饰，将miR-375 加载到hASC 衍生的外泌体中，miR-375 可以通过过度表达在hASC 衍生的外泌体中富集，其从亲代细胞中释放出来后转移到受体细胞中发挥相关作用。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor,IGF）信号通路是介导骨骼生长的重要途径，受IGF 结合蛋白1-6（IGF binding protein1- 6,IGFBP1-6）的调节，IGFBP1-6 可以局部激活或抑制IGF 的作用。Chen等［21］证明IGFBP3 是成骨分化的负调节因子，外泌体miR-375 可在递送至hBMSCs 后抑制IGFBP3 的表达以发挥成骨作用。调控机制见图1。

图1 外泌体ncRNA 在骨折愈合中的调控机制。

2 外泌体ncRNA 调控成骨细胞分化、增殖和迁移

成骨细胞是主要的骨形成细胞，是骨重塑和愈合不可缺少的细胞，成骨细胞活性的适当增强对于骨愈合起着良好的促进作用［22］。WNT/β-catenin 信号通路在骨发育的各种生理过程及在骨损伤后的愈合和再生过程中有重要作用［23］。脂蛋白相关蛋白4（lipoprotein receptor related protein 4,LRP4）可通过Wnt 信号通路在骨的生理学中发挥作用［24］。Yu 等［25］通过体内外实验发现，携带miR-136-5p 的BMSC 衍生的外泌体（BMSC-exosome,BMSC-Exo）能够抑制LRP4并激活Wnt/β-catenin 通路，增强成骨细胞的增殖和分化，从而促进骨折愈合。Hu 等［26］发现BMSC-Exo分泌的miR-335 进入成骨细胞样细胞上调miR-335的表达并抑制囊泡关联膜蛋白关联蛋白B（vesicle associated membrane protein associated protein B,VapB）的表达，VapB 的低表达促进Wnt/β-catenin 通路的激活，促进成骨细胞的分化、增殖，从而促进骨折愈合。

SMAD 泛素化调节因子-1 （SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1）是E3 泛素连接酶，位于其下游泛素化靶点Smad1/5 和Runt 相关转录因子 2 （runt- related transcription factor 2,Runx2）［27］，是骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein type 2,BMP2）［28］诱导成骨细胞分化的关键转录因子［29］，Runx 缺失会导致成骨细胞的缺失。Jiang 等［30］通过免疫沉淀和蛋白稳定性分析，分别检测Runx2 的泛素化和SMURF1 对Runx2 泛素化的影响，验证了SMURF1 通过促进泛素化来降解Runx2；同时，他们还通过免疫荧光验证了miR-25在外泌体中的转移，采用双荧光素酶报告基因法预测并验证miR-25 与SMURF1 的靶向关系，使用X 射线成像评估BMSC-Exo 中miR-25 对小鼠骨折愈合的影响，发现成骨细胞在接受BMSC-Exo 转移的miR-25 后，降低了SMURF1 的表达，增加了Runx2，导致其分化加速，增殖率增加，迁移增加；证实BMSC-Exo 分泌的miR-25 可通过SMURF1/Runx2 轴加速成骨细胞的成骨分化、增殖和迁移，促进小鼠骨折愈合。

外泌体ncRNA 不仅可以正向调控成骨细胞分化、增殖和迁移以促进骨折愈合，相反地，破骨细胞来源的外泌体ncRNA 能负向抑制成骨细胞活性，减少骨形成。据报道，miR-214-3p 可以通过靶向Pten/PI3k/Akt 通路促进破骨细胞分化；Li 等［31］通过体外实验发现破骨细胞中miR-214-3p 的升高会抑制成骨细胞的活性，与miR-214-3p 过表达的破骨细胞共培养的成骨细胞中成骨细胞活性相关标记基因的mRNA水平显著下调；他们还通过自主研发的破骨细胞靶向递送系统，提供的使用antagomiR-214-3p 评估破骨细胞靶向miR-214-3p 抑制的治疗效果，发现antagomiR-214-3p 治疗显著促进了去卵巢老龄小鼠的骨形成，而这种有益作用在破骨细胞靶向递送机制中断后被阻断，由此证实抑制破骨细胞miR-214-3p 可促进去卵巢老龄小鼠的骨形成，增加骨量。

3 外泌体ncRNA 调控破骨细胞介导的骨吸收

骨形成的过程是骨骼中成骨细胞和破骨细胞活动相平衡的过程。破骨细胞是由来自单核细胞／巨噬细胞的前体细胞融合而成的骨吸收细胞，它与成骨细胞、造血细胞、免疫细胞，甚至是肿瘤细胞都有着密切的联系，共同调控着骨微环境的稳态［32,33］。破骨细胞在骨折修复的炎症期和骨痂重塑期都通过适当的骨吸收对骨折的愈合修复发挥着作用。在炎症阶段，破骨细胞前体细胞首先从血液循环中被招募，并通过核因子κB 受体活化因子配体（NF- κB ligand,RANKL）的刺激及分化因子的诱导分化、增殖融合，形成破骨细胞，发挥骨吸收的作用。Cui 等［34］研究发现，miR-124 的过表达可以逆转由内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPC）衍生的外泌体诱导的骨髓巨噬细胞（bone marrow macrophages,BMMs）的迁移和破骨分化，LncRNA-MALAT1 可直接与miR-124 结合，负向控制miR-124 活性，EPC 衍生的外泌体可以通过LncRNA-MALAT1 增强破骨细胞前体的招募和分化，促进骨折的愈合修复。

4 外泌体ncRNA 调控血管生成

众多研究表明，良好的血运是骨折愈合的前提条件，血管的生成保证了骨折愈合所需要的营养供给和成骨前体细胞、成软骨细胞及破骨细胞的补充［5］；骨形成与血管形成在空间和时间上的紧密联系被称为“血管生成-成骨耦合”［35］。血管生成涉及包括内皮细胞的增殖和迁移［36］、毛细血管的形成和MSCs 的稳定等过程，还由一系列多种因子控制［37］，这些因子的平衡决定了血管的形成和稳定性［38］。外泌体ncRNA 也可以调控骨折愈合时的血管生成。Liu等［39］采用体内骨折模型和通过细胞增殖实验、细胞迁移实验等体外实验证实，低氧条件下的外泌体（hypoxic-exosome,Hypo-Exo）给药与常氧下的Exos相比更能促进血管生成、增殖和迁移。其主要机制为Hypo-Exo 携带的miR-126 通过抑制萌芽相关的含EVH1 结构域蛋白1（sprouty-related EVH1 domaincontaining protein 1,SPRED1）的表达，激活Ras/Erk通路并转移至内皮细胞，产生显著的促血管生成作用。

5 小结与展望

随着现在基因组测序技术的进步，越来越多的研究表明，外泌体ncRNA 能够调控骨折愈合过程中骨髓间充质干细胞成骨分化，成骨细胞的分化、增殖和迁移，破骨细胞的骨吸收及血管生成等；外泌体ncRNA 通过相关通路调控靶基因的表达和mRNA 的稳定，影响着骨代谢过程中关键基因表达，在骨折愈合过程中发挥着举足轻重的作用；随着不同来源的外泌体携带的ncRNA 不断被发现和研究［40］，已经有一部分外泌体ncRNA 作为治疗靶点在临床实验中用于骨折愈合的治疗并取得了良好的疗效，但由于技术的局限性和生物安全性，外泌体ncRNA 的应用和研究也不可避免地存在一些不足，主要有：（1）在外泌体ncRNA 调控骨折愈合的研究主要集中在miRNA 上，而对于lncRNA、circRNA 的研究少之又少，尤其是对于circRNA 的研究需要新的突破，这也是未来研究的热点；（2）目前的研究缺乏骨痂重塑期外泌体ncRNA 对于破骨细胞调控的研究；（3）对于外泌体ncRNA 来源的研究主要局限在BMSCs，未来是否会有更多来源的外泌体ncRNA 调控骨折愈合值得深入探讨；（4）促进骨折愈合本质上是一种激活细胞和组织生长的过程，应对肿瘤产生的风险是未来面临的一个难题。总之，外泌体ncRNA 的研究为骨折愈合的研究提供了新思路、新观点，但将其转化为临床应用还存在着诸多挑战。相信在不久的将来，随着深入地研究和难题的解决，不同来源的外泌体ncRNA 将在骨折愈合机制的研究中取得更大的进步，并对防治骨折愈合有更重大的意义。