红树林来源细菌抑菌活性及其增肥潜力评估

摘要： 通过平板对峙实验、菌丝生长速率抑制实验，测试细菌对禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、香蕉枯萎病菌、油茶炭疽病菌、巴西曲霉的抑菌活性，并通过固氮解磷实验、产γ-聚谷氨酸实验探究增肥潜力。结果表明：细菌YY9，暹罗芽孢杆菌T1，T6，贝莱斯芽孢杆菌T3对菌丝生长速率抑制率均达到80%以上；细菌YY6～YY12表现出较强的固氮能力，细菌YY9产γ-聚谷氨酸质量浓度达到（6.57±0.34） g·L-1。

关键词： 贝莱斯芽孢杆菌； 暹罗芽孢杆菌； 抑菌活性； 固氮能力； γ-聚谷氨酸

中图分类号： S 476文献标志码： A"" 文章编号： 1000-5013（2024）05-0654-07

Evaluation of Antibacterial Activity and Fertilization Potential of Bacteria Derived From Mangrove Forests

Abstract： The antibacterial activity of bacteria against Fusarium graminearum， Fusarium pesudograminearum， banana wilt fungus， Camellia oleifera， and Aspergillus brasiliensis were tested through plate confrontation experiments and mycelial growth rate inhibition experiments. The fertilization potential was explored through nitrogen fixation and phosphorus removal experiment， as well as γ-polyglutamic acid production experiment. The results show that bacteria YY9， Bacillus siamensis T1 and T6， Bacillus velezensis T3 have inhibition rate" over 80% on mycelial growth rate. Bacteria YY6-YY12 show stronger nitrogen fixation ability， and the mass concentration of γ-polyglutamic acid produced by bacteria YY9 can reach （6.57±0.34） g·L-1.

Keywords： Bacillus velezensis； Bacillus siamensis； antibacterial activity； nitrogen fixation ability； γ-polyglutamic acid

农业生产对维护人类粮食安全和社会稳定起到了重要的作用。然而，植物病虫害的不断蔓延对农作物产量和质量造成了严重威胁，限制了农业的可持续发展，如假禾谷镰刀菌（Fusarium pesudograminearum）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）等病原真菌综合侵染引起的小麦茎基腐病［1］，镰刀菌或腐霉菌单独侵染、镰刀菌和腐霉菌复合侵染引起的玉米茎腐病［2］，古巴尖镰孢菌侵染引起的香蕉枯萎病［3］， 油茶炭疽病菌（Camellia oleifera）则是危害油茶植株生长和产量的主要病害［4-5］。

防控植物病害的方法一般采用化学防控手段，但杀菌剂的长期使用会导致环境污染、生态失衡及“3R”问题的产生等，而生物防控对环境友好，病原菌不易产生抗药性，符合可持续发展需求。因此，开发绿色微生物农药有现实意义和经济意义。

微生物农药因具备选择性高、对人畜无害、对自然环境污染小、不易产生抗药性等优点而倍受青睐，是目前发展最迅速、推广应用最成功的一类生物农药产品。与真菌和病毒等其他微生物农药相比，细菌易于培养，农药活性评价也相对容易。更重要的是细菌发酵生产工艺成熟，工业化生产成本可控，更加便于产业化利用。所以，细菌类微生物农药一直受到科研单位和企业的青睐，成为微生物农药研发创制和商业化开发的热点领域。在2010-2020年全球新登记的微生物农药中，细菌种类占比超过40%［6］。目前，我国主要生物农药品种多样［7］，包括细菌类微生物农药、真菌类微生物农药、病毒类微生物农药、基因工程菌类微生物农药等，在植物保护、虫害防治方面发挥着重要作用。

细菌不仅可以开发为生物农药，而且还有增肥效果。如某些细菌具有合成γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的能力。γ-PGA是由多种杆菌产生的一种胞外多肽，具有优良生物相容性、生物降解性及无毒无污染性，广泛用作药物缓释材料、食品的水凝剂及高强度纤维［8］。在农业应用方面，γ-PGA可以用于改良酸化植烟土壤［9］，调节土壤微生物群落变化和促进作物生长，富集有益微生物，在作物采摘后依旧维持较高的土壤生物活性［10］，与化学肥料合用，起到明显提高肥效的作用［11］。目前，暹罗芽孢杆菌［12-13］、地衣芽孢杆菌［14］、枯草芽孢杆菌［11，15］等细菌均具有产γ-PGA的能力。基于此，本文对红树林来源细菌抑菌活性及增肥潜力进行评估。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器

γ-PGA（上海市麦克林生化科技股份有限公司）；葡萄糖，磷酸氢二钠，硫酸镁等药品（国产分析纯）；TGL-20M型台式高速冷冻离心机（湖南省长沙市湘仪实验室仪器开发有限公司）；UV-1800PC型紫外可见分光光度计（上海市美谱达仪器有限公司）。

1.2 供试试验菌株

油茶炭疽病菌由华侨大学化工学院王奇志副教授馈赠。香蕉枯萎病菌（banana wilt fungus）由华侨大学化工学院王明元教授馈赠。禾谷镰刀菌，假禾谷镰刀菌由江苏省南京市中旗科技股份有限公司馈赠。巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）购自广东省广州市微生物菌种保藏中心。

1.3 培养基配方

培养基配方，如表1所示。

2 实验部分

2.1 细菌的分离

用无菌药勺取约5 g福建省厦门市集美大桥红树林根部土壤，并将其装于无菌培养皿中。将约1 g土壤倒入9 mL无菌水试管中，摇匀后，稀释10倍。取0.5 mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，30 ℃培养2～5 d。观察微生物生长情况，依据菌落特征的差异挑取菌株。纯化菌株，直到获得单一菌落为止。挑选一部分菌株送往北京市擎科生物科技股份有限公司做16S rDNA鉴定。

2.2 固氮解磷效果

细菌固氮解磷的实验流程参考文献［16］，并做略微调整。挑取一接种环培养物分别接种到阿须贝无氮培养基、蒙金娜无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基上，每个培养基接种3～4株菌，培养5 d后观察透明圈产生情况。

2.3 对病原真菌的拮抗活性

采用对峙培养法考察各细菌对病原真菌的拮抗活性［18］。在PDA中央位置接种病原菌菌丝，并在周边等距接3～4株细菌，在室温下培养5 d后观察其拮抗效果。

2.4 对病原真菌菌丝体生长速率的抑制效果

实验过程参考文献［16］，并做一些调整。取节2.3具有拮抗效果的菌株接种于装有30 mL的LB液体培养基中，于30 ℃培养2 d后，取2 mL菌液加入到无菌培养皿中，随后倒入约50 ℃，20 mL的PDA中，摇匀。待培养基凝固后，往培养基中央接种一环病原真菌菌丝，室温下培养7 d，以不接细菌的PDA为对照。生长结束后分别测量对照组菌丝直径、实验组菌丝直径及菌丝生长速率抑菌率。菌丝生长速率抑制率计算式为

2.5 γ-PGA产量

采用比浊法建立γ-PGA标准曲线。精确配制γ-PGA母液，γ-PGA质量浓度为0.500 g·L-1，然后逐步稀释成0.278，0.227，0.182，0.167，0.154，0.125，0.100 g·L-1溶液，备用。分别取3 mL各质量浓度标准品溶液与等体积十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，0.07 mol·L-1）溶液混匀，室温下静置3 min后，测量其在400 nm波长下的吸光度（D（400））［19］。将各细菌接种于γ-PGA发酵培养基中，30 ℃培养3 d后，发酵液在转速为10 000 r·min-1离心机中离心20 min，将1 mL上清液稀释10，20倍，最终按照标准曲线计算γ-PGA质量浓度。每株菌重复3次，最后计算平均值。

2.6 复合菌剂可能性

考察增肥潜力细菌与抑菌活性的芽孢杆菌进行复配的可能性。将具有增肥潜力的细菌YY6，YY11接种于50 mL的LB培养基中，30 ℃培养24 h后，各取0.5 mL溶液涂布于PDA培养基上，随后在培养基表面接种暹罗芽孢杆菌T1，T6（细菌T1，T6），贝莱斯芽孢杆菌T3（细菌T3），细菌YY9，30 ℃培养2 d后观察是否有透明圈，不产生透明圈，则表明二者可共培养，有制备复合菌剂的可能。

3 实验结果与讨论

3.1 菌株分离

从红树林根部土壤中共分离到130多株细菌。取其中3株细菌T1，T3，T6进行16S rDNA鉴定。结果表明，细菌T1，T6为暹罗芽孢杆菌 （相似性分别为99.93%和100.00%），细菌T3为贝莱斯芽孢杆菌（相似性为100%）。

暹罗芽孢杆菌于2010年被刊物International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology收录为有效种名，属芽孢杆菌科芽孢杆菌属。研究表明，暹罗芽孢杆菌可用于治疗烟草赤星病［20-21］、花生白绢病［22］，分解原油，降解土壤中化合物等，有着广泛的应用前景［23］。

贝莱斯芽孢杆菌对辣椒褐腐病［24］、油菜根肿病和稻瘟病［25］、禾谷镰刀菌［26］均表现出良好的抑菌效果。目前仅有四川省成都市百事东旺生物科技有限公司登记的贝莱斯芽孢杆菌为生物农药（http：∥www.icama.org.cn/），贝莱斯芽孢杆菌还有较大的开发空间。

3.2 菌株固氮解磷效果

细菌YY5～YY12固氮解磷效果，如图1所示。

由图1可知：细菌YY6～YY12的透明圈直径与菌落直径的比值为2.0～5.2，具有较强的固氮效果；细菌YY7，YY11具有其他菌株不具备的解无机磷和有机磷效果，具有较强的增肥潜力研究价值。

3.3 对病原真菌拮抗活性的考察

各细菌对病原真菌拮抗效果，如图2所示。由图2可知：各菌株对5种植物病原菌表现出较明显的抑菌效果，有进一步研究开发的价值。

3.4 植物病原真菌菌丝生长速率抑制实验

细菌对病原真菌菌丝生长速率抑制效果图，如图3所示。

植物病原真菌菌丝生长速率抑制率，如图4所示。

由图3，4可知：4株细菌对5种植物病原真菌菌丝生长速率抑制率均在80%以上，其中细菌T3的抑制效果最佳，对5株植物病原菌菌丝生长速率抑制率均在90%以上。

菌株zk1的菌液对胶孢炭疽菌的抑制率达到91.63%，对哈茨木霉的抑制率也接近80%［27］。细菌Vel-HNGD-F2抑菌物质粗提物对禾谷镰刀菌抑菌率达到（63.21±0.94）%［26］。细菌Pm9对禾谷镰刀菌、小麦全蚀病菌、小麦纹枯病菌、君子兰茎基腐病菌、番茄灰霉病菌和南天竹炭疽病菌6 种供试植物病原菌抑制率在55.5%～87.5%之间［28］。细菌T3对植物病原菌的抑制率与文献报道的一致，在农业生产上具有较好的应用价值。

3.5 产γ-PGA的能力

γ-PGA标准曲线为Y=3.355 74X-0.020 95，R2=0.995 3，其中Y为γ-PGA质量浓度，X为D（400）。各菌株γ-PGA产量，如图5所示。图5中：ρ（γ-PGA）为γ-PGA质量浓度。

由图5可知：8株菌具有合成γ-PGA的产量，其中，细菌YY9合成的γ-PGA质量浓度达到（6.57±0.34） g·L-1。 细菌CAU83的γ-PGA最高产量为30.10 g·L-1［29］，细菌LBY-7的γ-PGA最高产量为23.15 g·L-1［13］，细菌LW-1的γ-PGA最高产量为44.78 g·L-1［12］。因此，细菌YY9的γ-GPA产量还有很大的提升空间。

3.6 复合菌肥配制可能性评估

细菌与芽孢杆菌拮抗关系，如图6所示。

由图6（a）可知：细菌YY6与4株生防细菌有一定的拮抗关系，不能用于复配复合菌剂用，而细菌YY11可与细菌YY9进行复配。

4 结论

1） 分离到的细菌具有固氮功能，其透明圈直径与菌落直径的比值在2.0～5.2，具有较强的固氮效果，对无机磷和有机磷的溶解效果则较弱。

2） 通过对峙培养实验表明，分离到的细菌T1，T6，T3，细菌YY9对5株植物病原真菌（禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、香蕉枯萎病菌，油茶炭疽病菌、巴西曲霉）有抑制作用。通过菌丝体生长速率抑制实验，结果表明，4株细菌对5株植物病原真菌菌丝生长速率抑制率达到80%以上，尤其细菌T3的抑制率达到90%以上，有进一步开发的价值。

3） 多株细菌具有合成γ-PGA的能力，细菌YY9合成γ-PGA的质量浓度为（6.57±0.34） g·L-1，还有很大的提升空间。参考文献：

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