黄连琥珀清心丸质量标准研究

摘要：为了建立黄连琥珀清心丸的定性定量检测方法，并为后续建立其质量标准提供依据，对方中的沉香、广枣、诃子、黄连、木棉花、肉豆蔻6味药进行显微鉴别；对诃子进行薄层鉴别；使用高效液相色谱法（HPLC）对盐酸小檗碱进行质量分数测定。建立了黄连琥珀清心丸的显微鉴别、薄层鉴别，方中盐酸小檗碱在0.018 0～0.902 0 mg/mL范围内呈良好的线性关系，质量分数检测方法科学、灵敏、重复性好，精密度、稳定性、重复性试验中相对标准偏差均小于3.0%，加样回收实验平均回收率为101.29%，相对标准偏差为 2.30%，所建立的质量标准操作简便、重复性好，可用于黄连琥珀清心丸的质量标准研究。

关键词：黄连琥珀清心丸；质量标准；显微鉴别；薄层色谱；高效液相色谱法

中图分类号：R284.1"" 文献标志码：A"" 文章编号：1002-4026（2024）04-0017-09

开放科学（资源服务）标志码（OSID）：

A study on the quality standards of Huanglian Hupo Qingxin pills

ZHANG Xiaodan1，HE Xiaodong2，GAO Yan1，YANG Longfei1，ZHANG Guanqun1，YU Zixiang1，LIU Mingjun1，WANG Yafei3， GENG Zangjia4*，ZHAO Bonian1*

（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine Institute of Pharmaceutical Research Collaborative Innovation Center for

Ecological Protection and High Quality Development of Characteristic Traditional Chinese Medicine in the Yellow River Basin，

Jinan 250355，China；2.Qingdao Shanghe Traditional Chinese Medicine Hospital Co.， Ltd. ，Qingdao

266200，China；

3.Institute of Acupuncture and Moxibustion and Massage， Shandong University of Traditional Chinese Medicine，

Jinan 250355，China;4.School of Pharmacy，Southwest Minzu University，Chengdu 610041，China）

Abstract∶To establish a method for the qualitative and quantitative assay of Huanglian Hupo Qingxin pills and provide abasis for the subsequent establishment of quality standards， the six ingredients in the formula （Aquilariae Lignum Resinatum， Fructus Choerospondiatis， Terminalia Chebula， CoptidisRhizoma， Flos Gossampini， and Semen Myristicae）were identified through microscopical observation. Thin-layer chromatography was used to identify Terminalia Chebula. Berberine hydrochloride concentration was assessed using high-performance liquid chromatography.Microscopical and thin-layer identifications of Huanglian Hupo Qingxin pills were conducted，which revealed a berberine hydrochloride concentration of 0.018 0～0.902 0 mg/mL，exhibiting a good linear relationship. The assay method was found to bescientific， sensitive， and reproducible， with relative standard deviations（RSDs）for precision， stability， and reproducibility tests all below 3.0%. The average recovery rate from spike-and-recovery testing was 101.29%， with an RSD of 2.30%.The established quality standardis simple and reproducible and can be used for studying the quality standards of Huanglian Hupo Qingxin pills.

Key words∶Huanglian Hupo Qingxin pills; quality standards; microscopical identification; thin-layer chromatography; high-performance liquid chromatography

胸痹病，最早见于《黄帝内经》，相当于现代医学中的冠状动脉粥样硬化性心脏病。中医认为胸痹病是由血瘀、痰阻、气虚为病因的本虚标实之症［1］，具有病程长，病情发展变化多，病因病机复杂等特点。随着现代人偏嗜肥甘厚味，基础疾病发病率增多，外部环境变化等因素，瘀而化热、郁而化热、热邪侵袭而导致的胸痹热邪攻心证也越发多见［2］。

藏医典籍《四部医典》秘诀部中“娘色乃”（即心脏病），与中医胸痹病，热邪攻心证病症基本吻合，主要症状都有头晕、呼吸急促、口干舌燥、胸痛、气短、心悸、恶心、痛有定处等。故结合藏医治疗“娘色乃”经验与中医思路，中药藏药性味、功效及配伍理论制成黄连琥珀清心丸，为黄连、琥珀、诃子、广枣、沉香、川木香、木棉花、肉豆蔻等11 种药材粉碎后加入辅料制成的糊丸，具有清心除热、安神止痛的功效。

黄连琥珀清心丸为青岛上和中医医院临床经验方，将中医药、藏医药进行融合，疗效确切，但尚未建立全面的质量内控指标。本研究对黄连琥珀清心丸开展了较为系统的标准研究工作，为有效控制黄连琥珀清心丸的质量提供支撑。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

BX43型显微镜（OLYMPUS CORPORATION）；DZKW-C型电子恒温水浴锅（上海树立仪器仪表有限公司）；METTLER AE240型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；Agilent Technologies高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Thermofisher C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2 实验试剂

乙酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200914）；三氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司，批号：20181207）；丙酮（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20140608）；甲酸（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20140608）；甲苯（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20191101）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200507）；盐酸（天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20180315）；磷酸二氢钾（天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20180315）。

1.3 对照品、对照药材及样品

没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110831-201906）；盐酸小檗碱对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：S01A10K94340），纯度≥98%；黄连琥珀清心丸三批样品（批号：20201022，20201023，20201024）及原药材饮片均由青岛上和中医医院提供，黄连、诃子、广枣、沉香、川木香、木棉花、肉豆蔻经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取黄连琥珀清心丸适量，研磨后置于载玻片上，滴加水合氯醛试剂，加热透化后置于显微镜下观察。可见沉香显微特征：具缘纹孔导管可见纹孔密，内含淡黄色或黄棕色树脂状物［3］（见图1（a））；黄连显微特征：石细胞呈鲜黄色，直径50～60 μm［4］（图1（b））；广枣显微特征：外果皮细胞，呈类多角形，胞腔内含棕色物［5］（图1（c））；木棉花显微特征：星状非腺毛，由多个呈长披针形的细胞组成，胞腔线性，内含棕色物［6］（图1（d））；诃子显微特征：石细胞类长条形，壁厚，孔沟细密而明显［7］（图1（e））；肉豆蔻显微特征：外胚乳细胞，呈多角形，内含棕色物［6］（图1（f））。

2.2 薄层色谱法鉴别

2.2.1 诃子薄层鉴别

取本品 2 g，加乙醇 10 mL，超声处理 30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 1 mL使溶解，作为供试品溶液。同法制成阴性对照溶液。另取没食子酸对照品，加无水乙醇制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。依照薄层色谱法［8］进行试验，吸取上述供试品溶液、阴性对照样品各10 μL，对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（体积比为7∶10∶3∶4）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇试液，置日光下检视［9］。结果，供试品色谱中，在与诃子对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰（图2）。

2.2.2 诃子薄层鉴别方法耐用性考察

对该薄层鉴别方法进行了不同薄层板、温度、湿度的考察，发现没食子酸均能分离，说明该鉴别方法良好。

（1）不同薄层板考察

吸取供试品（批号：20201022）、阴性对照、对照品溶液，分别点于硅胶 G 预制板和自制薄层板上，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇试液，置日光下检视，两块板子除了Rf值有较大变化外，均能达到良好的鉴别效果（图3）。

（2）不同温度考察

吸取供试品（批号：20201022）、阴性对照、对照品溶液，分别点于同一硅胶 G 薄层板上分别点样，分别在室温和低温3 ℃条件下展开，取出，晾干，喷以 2%三氯化铁乙醇试液。置日光下检视，室温和低温除了Rf值有较大变化外，均能达到良好的鉴别效果（图4）。

（3）不同湿度考察

吸取供试品（批号：20201022）、阴性对照、对照品溶液，分别点于同一硅胶 G 薄层板上分别点样，分别在不同湿度条件（湿度 40%、湿度 80%） 下展开，取出，晾干，喷以 2 %三氯化铁乙醇试液，置日光下检视，表明湿度对展开行为没有太大影响（图5）。

2.3 质量分数测定方法的建立

2.3.1 不同提取方式考察

取本品（批号： 20201022）适量，研磨成细粉，精确称取本品 2 g，并精密加入50%甲醇水-盐酸溶液（体积比100∶1） 25 mL，称定质量，分别进行回流提取、超声提取（超声 250 W，频率 40 Hz）、浸泡提取，每种提取方法平行制样3份，提取30 min，放冷后再次称定质量，用 50%甲醇水-盐酸（体积比100∶1）补足失重，摇匀，滤过，续滤液即为供试品溶液［10］。再称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成90.2 μg/mL对照品溶液。供试品及盐酸小檗碱对照品溶液进样量为10 μL，乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（体积比22∶78）为流动相进行检测，结果见表1。发现采用浸泡法提取的供试品溶液中盐酸小檗碱质量分数较低，回流与超声提取方法所得供试品溶液中盐酸小檗碱质量分数差别不大，考虑到操作简便性等因素，选择超声提取作为供试品提取方法。

通过不同提取方式考察发现，样品液相图谱中盐酸小檗碱较标品峰高宽，考虑为载药量过大，后续方法考察调整样品质量浓度，取样量改为1 g。

2.3.2 不同提取时间考察

按“2.3.1”项下已优化提取方法，对不同提取时间进行考察，分别对超声提取（功率 250 W，频率 40 Hz）20、30、40 min后的样品进行检测，平行制样3份，见表2。得到结果发现提取20 min

盐酸小檗碱质量分数较低，提取30、40 min质量分数差距不大，考虑到操作便捷性，选择超声提取时间为 30 min。

2.3.3 不同料液比考察

按“2.3.1”“2.3.2”项下已优化的不同提取方式、不同提取时间条件，继续对不同料液比进行考察，分别精密称定本品（批号： 20201022）0.25、0.50、1.00、2.00 g各3份，对样品中盐酸小檗碱进行质量分数检测，见表3。得到结果，取样量为 0.50 g 时提取所得供试品溶液中盐酸小檗碱质量分数较高，故选择以 0.50 g 为最佳取样量。

2.3.4 不同色谱条件考察

按照前面供试品溶液制备方法提样，二氢钾溶液（体积比50∶50）、色谱条件2

：乙睛-0.05 mol/l 磷酸二氢钾溶液

（体积比22∶78） 进行考察

结果显示乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（体积比22：78）时，盐酸小檗碱分离度良好（gt;1.5），出峰时间适宜，因此选用此条件进行后续条件的考察。

2.3.5 不同柱温考察

按照优化的色谱条件和供试品溶液制备方法，分别在柱温25、30、35 ℃条件下进行测定，结果见表4，不同柱温条件下除出峰时间不同外，均能达到良好的分离，质量分数相差不大，且药典中对黄连的质量分数检测为默认室温，综合考虑选择柱温 25℃进行检测。

2.3.6 不同流速条件考察

按照前文中优化的色谱条件和供试品溶液制备方法，分别在流速0.8、1.0、1.2 mL/min 条件下进行测定，结果见表5。结果得到，不同流速条件对色谱峰分离效果及峰形影响不大，综合考虑选择流速1.0 mL/min进行检测。

2.3.7 不同色谱柱考察

按照前文中优化的色谱条件和供试品溶液制备方法，分别采用Thermofisher C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、GL Sciencesinc C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行测定，结果见表6。结果表明，采用 Thermofisher C18色谱柱时，分离效果较好，峰形及出峰时间适宜，所以选择Thermofisher C18色谱柱进行检测。

2.4 质量分数测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱：Thermo fisher C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（体积比22：78）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.4.2 供试品溶液制备

取本品适量，研磨成细粉后精密称定 0.5 g，再精密加入50%甲醇水-盐酸（体积比100：1）25 mL称定质量，超声处理（功率 250 W，频率 40 Hz）30 min，放冷后再次称定质量，用 50%甲醇水-盐酸（体积比100：1）补足质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液及阴性溶液。

2.4.3 对照品溶液制备

精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成质量浓度为90.2 μg/mL对照品溶液。

2.4.4 专属性考察

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液，按既定色谱条件进行检测，得到结果，供试品溶液与对照品溶液相应位置有明显的吸收峰，且阴性样品在相应位置上未见明显吸收峰，说明阴性无干扰，方法专属性良好（图6）。

2.4.5 线性关系考察

取“2.4.3”项下盐酸小檗碱对照品，加甲醇稀释成质量浓度为 0.018 0、0.045 1、0.090 2、0.451 0、0.902 0 mg/mL的对照品溶液。各质量浓度对照品溶液均进样10 μL，按既定色谱条件检测，以峰面积为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。得到线性回归方程：y=34 505x+458.31，R2=0.999，表明盐酸小檗碱在0.018 0～0.902 0 mg/mL范围内呈良好的线性关系（表7）。

2.4.6 精密度试验

取“2.4.2”项下制备供试品溶液（批号：20201022），按既定色谱条件分别连续进样6次，计算每份供试品的质量分数。得到质量分数相对标准偏差（δRSD）为1.99%，保留时间的δRSD为0.49%，均小于3.0%，说明精密度良好。

2.4.7 重复性试验

取供试品（批号：20201022），平行制备供试品溶液6份，按既定色谱条件分别进样 2 次，计算质量分数及保留时间相对标准偏差（δRSD）。得到质量分数δRSD为1.97%，保留时间的δRSD为0.39%，均小于3.0%。结果显示，测定本品质量分数的方法重复性良好。

2.4.8 稳定性试验

取供试品（批号：20201022），平行制备供试品溶液6份，按既定色谱条件分别在 0、2、4、8、12、24 h 进行测定，得到质量分数δRSD为0.88%，保留时间δRSD为0.55%，均小于3.0%。说明样品在24 h内稳定。

2.4.9 加样回收试验

取供试品（批号：20201022），制成供试品溶液分别加入含有盐酸小檗碱对照品溶液 1 mL（质量浓度为0.461 mg/mL），平行制备6份，按既定色谱条件分别进样 2 次。得到结果，盐酸小檗碱的回收率在97.74%～104.87%，平均回收率为101.29%，δRSD为 2.30%。说明该测定方法回收率良好（表8）。

2.4.10 样品检测

取3批样品（批号：20201022、20201023、20201024）各3份，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，采用既定色谱条件进样检测，计算每份供试品盐酸小檗碱质量分数，得到3批样品平均质量分数为2.20 mg/g（表9）。

3 讨论

诃子是藏药中的常用药，具有十分重要的地位，有“藏药之王”美称［11］。藏医认为诃子功效有祛风、火、痰、寒， 行气活血，镇静解毒［12］，符合黄连琥珀清心丸主治，亦可调和药性，是中、藏相互借鉴，优势互补的实践。对诃子的薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）鉴别，本研究首先采用了文献［13］中的方法，发现供试品不圆整，多次调整展开剂比例后，仍未分离清晰，考虑可能是使用乙酸乙酯超声提取未能完全溶解其中成分，应选择极性较大的提取溶剂。随后查阅文献，采用文献［9］的诃子鉴别方法，以乙醇为溶剂，同时优化展开剂，对甲苯-乙酸乙酯-甲酸（体积比6∶4∶1）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（体积比7∶10∶3∶4上层液）实验结果进行比较。实验结果表明，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（体积比7∶10∶3∶4上层液）为展开剂，得到结果斑点清晰，且阴性无干扰。

对黄连琥珀清心丸中的川木香、广枣、肉豆蔻、沉香、木棉花已尝试创建相应的薄层鉴别方法，但结果均不理想。研究中，虽在药典［6］以及文献［14］中检索到以上药物的薄层鉴别方法，但出现了供试品斑点不清晰或有阴性干扰的问题，不可完全照搬其方法，需要基于本方中药物的理化性质等因素继续调整优化，这也是本课题组后续探寻黄连琥珀清心丸，及其质量标准建立所要关注的重点。

黄连琥珀清心丸为自制方，其功效为清心除热，安神止痛，方中黄连清热燥湿，泻火解毒为君药，因此以黄连中的活性成分盐酸小檗碱为指标［15］，建立了其质量分数测定检测方法。对文献［10］中盐酸小檗碱质量分数测定比例，乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液进行不同梯度的考察，发现乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（体积比22∶78）图谱基线更平稳，峰形、分离度良好，保留时间较适中，故选择为流动相比例。基于上述条件，对不同柱温（25、30、35 ℃），以及不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同色谱柱（Thermo fisher C18色谱柱、GL Sciencesinc C18 色谱柱）考察，发现柱温、流速的变化对测量结果干扰不大，色谱柱则选择Thermo fisher C18柱为佳。

同时对供试品的提取进行了考察，在分别对不同提取方法、提取时间、料液比进行考察后，发现取供试品0.5 g采用超声提取（功率 250 W，频率 40 Hz），提取时间30 min得到盐酸小檗碱质量分数较高。

黄连琥珀清心丸尚未建立全面的质量内控指标。本研究对黄连琥珀清心丸的显微鉴别和薄层鉴别项进行了修订和完善，并建立了有效成分指标盐酸小檗碱的质量分数测定。建立的方法简单易行，质量可控，对后续建立有效的黄连琥珀清心丸质量标准、控制产品质量提供了数据支撑。

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