线粒体靶向抗氧化剂Mito-Tempo 对脓毒症小鼠急性肝损伤的保护作用

【摘 要】目的：探讨线粒体靶向抗氧化剂Mito-Tempo对脓毒症小鼠急性肝损伤的影响及可能机制。方法：将C57BL/6小鼠随机分为对照组（Control组）、盲肠结扎穿刺组（CLP组）、Mito-Tempo治疗组（CLP+Mito-Tempo组）。采用盲肠结扎穿刺术（cecalligation and puncture，CLP）构建小鼠脓毒症急性肝损伤模型，CLP+Mito-Tempo组在CLP处理前1 h使用Mito-Tempo腹腔注射进行预处理。24 h后麻醉并处死小鼠，取小鼠肝脏组织进行HE染色观察肝组织病理损伤；ELISA法监测血清中炎症因子，免疫荧光染色检测肝组织中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平；电镜观察线粒体形态，Western blot法检测细胞焦亡相关蛋白剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 1，cleaved-Caspases-1）、剪切型焦孔素D（cleaved-gasdermin D，GSDMD）、白细胞介素-1α（interleukin 1α，IL-1α）、白细胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）的表达水平。结果：与Control组相比，CLP组肝损伤加重，ROS水平增加，线粒体形态出现破坏，细胞焦亡相关蛋白cleaved-Caspase-1、cleaved-GSDMD、IL-1α、IL-1β的表达水平增加；与CLP组相比，CLP+Mito-Tempo组肝组织损伤程度减轻，ROS水平降低，线粒体形态部分恢复，细胞焦亡相关蛋白cleaved-Caspase-1、cleaved-GSDMD、IL-1α、IL-1β的表达水平降低。结论：Mito-Tempo可以减轻脓毒症小鼠急性肝损伤，其机制可能与降低氧化应激水平抑制细胞焦亡的发生有关。

【关键词】脓毒症；急性肝损伤；氧化应激；细胞焦亡

【中图分类号】R575 【文献标志码】A 【收稿日期】2024-03-12

脓毒症是宿主因感染引起的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍，病死率高达20%～30%[1]。肝脏是人体参与免疫、代谢和解毒等生理过程的重要器官，因其解剖结构和生理功能的特殊性，使肝脏成为脓毒症发生发展过程中最易受损的器官，脓毒症相关性肝损伤是导致脓毒症患者死亡的独立危险因素[2]，目前研究证实，肝功能损伤可发生在脓毒症任何阶段，受损的肝细胞可触发损伤相关分子模式（damage-associated molecular pat⁃terns，DAMPs），级联激活放大全身炎症反应，加重肝脏和其他重要脏器功能障碍，进而增加患者的治疗难度，严重影响脓毒症患者的预后[3]。因此，积极探究脓毒症患者并发肝损伤的原因，寻找改善脓毒症相关性肝损伤的治疗靶点和药物，对改善脓毒症患者预后，降低病死率至关重要。

脓毒症的特点是免疫反应过度激活，从而引发广泛的炎症反应。现阶段研究认为，氧化应激（oxi⁃dative stress，OS）是导致脓毒症相关肝损伤的重要机制[4]，OS被认为是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生和清除之间的不平衡，它不仅可直接导致基因毒性损伤（DNA损伤），过量的ROS还可刺激肝细胞释放白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等促炎细胞因子，触发炎症级联反应，放大炎症效应，导致肝损伤[5]。事实上，ROS和炎症具有相互促进的作用，并形成恶性反馈回路，造成组织持续损伤。最近的研究表明，ROS 可通过激活Nod 样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小体而导致细胞焦亡[6]。作为1种促炎性质的程序性细胞死亡新方式，细胞焦亡被证明与脓毒症的发生发展密切相关[7]。因此，推断出过量的ROS通过诱发细胞焦亡加重了脓毒症相关性急性肝损伤，通过减少ROS的产生可能成为调控脓毒症炎症反应的潜在治疗策略。

线粒体是细胞能量代谢的重要细胞器，也是ROS产生的主要来源[8]。目前的研究表明，线粒体ROS（mtROS）可直接刺激促炎细胞因子的产生，加重脓毒症、自身免疫性疾病和心血管疾病[9]，同时，线粒体也易遭受ROS的直接攻击而导致线粒体功能障碍，而这也被认为是脓毒症相关器官功能障碍的主要发病机制之一[10]。因此，线粒体靶向抗氧化疗法被提出可作为炎症性疾病和癌症的新疗法[11]。Mito-Tempo是1种靶向作用于线粒体的抗氧化剂，具有很强的抗氧化活性，它的治疗作用已在各种疾病中得到广泛证实，Mito-Tempo可通过恢复小鼠心脏线粒体的功能来改善烧伤引起的心功能损伤[12]，还可通过抑制细胞凋亡来减轻醛固酮导致的肾小管损伤[13]。然而，Mito-Tempo在脓毒症诱导的急性肝损伤中的作用仍不确定，本研究旨在探讨Mito-Tempo对脓毒症诱导的肝损伤的保护作用及其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物。

C57BL/6野生型雄性小鼠采购于重庆医科大学实验动物中心，饲养于重庆医科大学实验动物中心SPF级动物房。小鼠平均年龄8～12周，体质量18～25 g。实验开始前，所有动物均在动物房适应性喂养7 d，室温维持在（22±2）℃，给予昼夜节律光照，正常给予水和食物。实验过程中所有操作及步骤均遵守国家条例规范和重庆医科大学动物管理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 盲肠结扎穿刺术（cecal ligation and puncture，CLP）诱导的脓毒症小鼠肝损伤模型

参照先前描述的方法，通过CLP诱导脓毒症小鼠肝损伤模型[14]。随机抽取小鼠，使用动物麻醉机（RWD，美国），以异氟烷吸入方式麻醉小鼠，刺激小鼠无反应视为麻醉充分。固定、备皮、碘伏消毒后，于腹中线剪开小鼠皮肤，切口1 cm 左右，并依次打开肌肉层及腹膜，使用眼科镊暴露腹腔，并寻找盲肠，轻轻将盲肠末端夹出腹部切口，距离小鼠盲肠末端1 cm处结扎盲肠，并使用21（gauge，G）针头穿刺结扎远端盲肠，并挤出少量盲肠内容物后将盲肠还纳入腹腔，使用3～0丝线逐层缝合肌肉层及皮肤层，完成小鼠CLP模型的制备。假手术组分离盲肠后不接扎，不穿孔，送回腹腔原位置，其余操作均相同。处理完毕后，将小鼠放回更换新鲜垫料的笼子自由进食水。

1.2.2 Mito-Tempo处理小鼠

随机抽取小鼠，并分为对照组（Control组，n=5），急性肝损伤组（CLP组，n=5）Mito-Tempo治疗组（CLP+Mito-Tempo组，n=5）。造模前，提前紫外灯照射工作台消毒，称小鼠重量并记录。在行CLP操作前1 h，通过腹腔注射的方式，按照体质量比例给予CLP+Mito-Tempo组小鼠20 mg/kg的Mito-Tempo（Sigma，USA），Control组给予同剂量的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer，PBS），术后将各组小鼠重新放置于无特定病原体环境的动物房中饲养，并观察、记录小鼠整体状态和疾病情况，模型后24 h取标本。

1.2.3 血清细胞因子测定

采集全血，室温下凝固1 h后，于1 000 g离心15 min，取上清即为血清，分装保存于液氮，溶解后可直接用于检测，用ELISA试剂盒（EBio科学公司，美国）检测血清中IL-6、白细胞介素-10（interleukin 10，IL-10）和TNF-α 的水平，用谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）检测试剂盒检测血清ALT和AST水平。

1.2.4 组织病理学

将肝组织进行固定、包埋、切片，用HE染色后用光镜评估组织学损伤。肝损伤评分采用先前描述的方法[15]，对以下6个指标进行了评分：空泡化、核凝结、核碎裂、核消退、红细胞停滞和炎症细胞浸润。评分根据5个显微镜视野（200×）中显示这些现象的细胞百分比：0=0%，1=0%～lt;10%，2=10%～lt;50%，3=50%～100%，总分越高，损伤越严重。

1.2.5 免疫荧光染色

将新鲜冰冻肝组织进行固定、包埋、切片，采用乙二胺四乙酸进行抗原修复，6%牛血清白蛋白封闭后按说明书指示方法添加MitoSOX Red染料（Sigma，USA）同新鲜肝组织切片避光在湿盒中孵育，最后用4，6-二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色。图像通过共聚焦显微镜（尼康）采集，并使用Image-Pro Plus 6软件进行统计分析。

1.2.6 Western blot

使用RIPA缓冲液对小鼠肝脏组织进行裂解，提取总蛋白和核蛋白，蛋白样品用10%～12% SDSPAGE分离后电转至PVDF膜，按浓度要求稀释液一抗，将条带分别同稀释好的抗小鼠剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 1，cleaved-Caspases-1）、剪切型焦孔素D（cleaved-gasdermin D，GSDMD）、白细胞介素-1α（interleukin 1α，IL-1α）、白细胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）抗体在4 ℃的湿盒中避光孵育过夜。清洗、孵育二抗后，使用增强化学发光底物显影，使用Image-Pro Plus 6.0测量信号强度。

1.2.7 氧化应激水平测定

超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）是与氧化应激相关的指标。根据制造商的说明，用MDA 检测试剂盒（Beyotime，S0131M）、SOD 检测试剂盒（Beyotime，S0101M）分别测定脓毒症小鼠血清中的MDA和SOD的水平，使用酶标仪（Bio-Rad仪器）测定发光强度。

1.2.8 电子显微镜评估

新鲜小鼠肝组织固定于2.5%戊二醛，进行脱水、包埋后切片，用透射电镜进行拍摄评估。

1.3 统计学方法

用GraphPad Prism 7.0、SPSS 19.0完成统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。组间两两比较采用SNK-q 检验法。多组数据间比较采用单因素方差分析（onewayANOVA），检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Mito-Tempo减轻CLP诱导的脓毒症小鼠模型肝损伤的严重程度

Control组、CLP组和CLP+Mito-Tempo组小鼠肝损伤评分分别为4.00±0.82，11.70±1.25，7.00±0.81，与Control 组相比，CLP诱导的脓毒症小鼠模型中肝脏组织出现严重的充血、核碎裂、核溶解、炎症细胞浸润（如图1箭头所示），肝损伤评分较对照组也明显升高（q=7.813，P=0.000），Mito-Tempo预处理可减轻肝损伤的严重程度，与CLP组相比，肝损伤评分也降低（q=4.756，P=0.005）（图1）。

2.2 Mito-Tempo 降低CLP 诱导的脓毒症小鼠模型ALT 和AST表达水平

血清ALT和AST水平是评估肝损伤最常用的生物标志物，Control 组、CLP 组和CLP+Mito-Tempo 组血清ALT 分别为43.80±8.45，291.00±17.60，168.00±12.60，AST 分别为43.90±8.01，245.00±32.70，139.00±27.70，与Control 组相比，CLP 组的血清ALT（q=26.120，P=0.000）和AST 水平（q=11.340，P=0.000）均明显升高，而在CLP+Mito-Tempo 组中，与CLP相比，血清ALT（q=12.970，P=0.000）和AST的水平（q=5.952，P=0.000）明显降低（图2）。

2.3 Mito-Tempo降低CLP诱导的脓毒症小鼠模型血清促炎性细胞因子的表达

本研究检测了对各组小鼠血清中IL-6、TNF-α和抗炎细胞因子IL-10 的表达，Control 组、CLP 组和CLP+Mito-Tempo 组血清IL-6 表达水平分别为47.5±11.1，545.0±103.0，173.0±27.8，TNF-α 表达水平分别为49.40±7.92，505.00±73.10，150.00±38.70，IL-10表达水平分别为37.3±12.1，136.0±25.9，329.0±65.1，和Control 组相比，CLP 组促炎性细胞因子IL-6（q=11.290，P=0.000）、TNF-α（q=13.340，P =0.000）、IL-10（q=5.330，P=0.001）的水平均升高，与CLP相比，Mito-Tempo预处理后明显降低了CLP+Mito-Tempo组IL-6（q=8.440，P=0.000）、TNF-α（q=10.460，P=0.000）细胞因子的表达，促进了IL-10（q=8.28，P=0.000）的表达（图3）。

2.4 Mito-Tempo改善了CLP诱导的脓毒症小鼠模型中氧化应激水平

为了评估氧化应激水平，本研究测定了血清中重要的抗氧化酶SOD和MDA的水平，Control组、CLP组和CLP+Mito-Tempo 组血清SOD 表达水平分别为57.30±6.13，28.40±4.01，46.70±6.81，MDA 表达水平分别为1.62±0.26，2.91±0.37，1.67±0.28，和Control组相比，CLP组SOD水平明显降低（q=7.080，P=0.000），而MDA水平升高（q=5.861，P=0.000），与CLP相比，Mito-Tempo预处理后升高了SOD（q=4.494，P=0.001）的表达水平，而降低了MDA（q=5.645，P=0.000）的表达（图4）；Control 组、CLP 组和CLP+Mito-Tempo 组线粒体ROS的荧光表达强度分别为0.57±0.05，1.89±0.21，0.74±0.13，与CLP组相比，线粒体ROS的荧光强度在Mito-Tempo预处理组中明显降低（q=10.740，P=0.000）（图5）。

2.5 Mito-Tempo改善了CLP诱导的脓毒症小鼠模型中线粒体形态

线粒体形态同线粒体功能密切相关，通过电镜观察线粒体形态，如图6所示，CLP组肝脏线粒体形态出现肿胀、线粒体膜膜完整性被破坏，线粒体嵴断裂或缺失，与CLP组相比，Mito-Tempo预处理可恢复线粒体形态。

2.6 Mito-Tempo抑制了CLP诱导的脓毒症小鼠模型肝组织Caspase-1的表达和细胞焦亡的发生

为了探讨Mito-Tempo 对小鼠肝组织中Caspase-1的表达和细胞焦亡的影响，本研究检测了Caspase-1、GSDMD、IL-1α和IL-1β蛋白在肝组织中的表达情况，实验结果发现，CLP组cleaved-Caspase-1蛋白相对表达量（0.355±0.024）相较于Control组（0.204±0.023）明显升高（q=6.545，P=0.001），而CLP+Mito-Tempo 组cleaved-Caspase-1 蛋白相对表达量（0.270±0.021）较CLP 组降低（q=3.389，P=0.025）；Control组、CLP组和CLP+Mito-Tempo 组cleaved-GSDMD 蛋白相对表达量分别为0.345±0.042，0.460±0.027，0.365±0.025，IL-1α 蛋白相对表达量分别为0.319±0.038，0.609±0.074，0.428±0.029，IL-1β 蛋白相对表达量分别为0.261±0.049，0.698±0.042，0.363±0.028，与Control 组相比，CLP 组cleaved-GSDMD（q=3.544，P=0.021）、IL-1α（q=5.659，P=0.000）、IL-1β（q=10.610，P=0.000）蛋白表达水平均升高，与CLP相比，Mito-Tempo预处理后降低了cleaved-GSDMD（q=2.990，P=0.042）、IL-1α（q=3.354，P=0.021）、IL-1β（q=8.134，P=0.000）的表达（图7）。

3 讨论

炎症反应是机体重要的生物防御机制，但异常激活的炎症反应可导致宿主组织损伤。脓毒症的特征是免疫系统的过度激活，从而引起细胞因子级联激活放大导致的失控性炎症。脓毒症所致急性肝损伤是导致脓毒症患者死亡的主要原因之一，对人类健康构成严重威胁[3]，因此，靶向炎症调控，抑制过度的炎症反应对于改善脓毒症患者预后、降低死亡率具有重要意义。目前研究发现，炎症反应与氧化应激相偶联，具有抗氧化能力的药物可以有效抑制炎症反应，改善脓毒症患者预后[16]。线粒体是ROS产生的主要来源，靶向线粒体传递抗氧化剂已被认为是治疗脓毒症的新策略。

Mito-Tempo是一种靶向线粒体的抗氧化剂，具有直接清除线粒体ROS的作用，从而最大限度降低氧化应激水平。现有研究证明Mito-Tempo可减轻对乙酰氨基酚导致的小鼠急性肝损伤，发挥保护性作用[17]，还可通过减少氧化应激，恢复脓毒症小鼠的肾功能，提升小鼠的存活率[18]，也可通过降低炎症反应、改善小鼠心脏线粒体功能，减轻阿霉素导致的心脏毒性[19]。本研究发现，经Mito-Tempo 治疗后，与CLP组相比，CLP+Mito-Tempo组肝组织损伤的严重程度有所改善（图1），同时血清中ALT和AST的活性也降低（图2）。血清中促炎细胞因子水平的升高是脓毒症重要的病理生理学特征，本研究观察到，经过Mito-Tempo治疗后，小鼠血清中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平降低（图3），而抑炎性细胞因子IL-10水平表达上升（图3），这些结果表明，Mito-Tempo能够缓解CLP诱导的脓毒症小鼠的肝功能损伤，调控炎症反应。

氧化应激在肝损伤的发病机制中起着重要作用，1项关于药物过量致肝损伤的研究发现，过量的对乙酰氨基酚可消耗肝脏还原型谷胱甘肽活性而诱发氧化应激反应，进而加重组织炎症反应，从而导致肝损伤[20]。事实上，肝脏在全身代谢反应中处于核心地位，负责机体糖异生、糖原储存和脂质的合成等，同时肝脏也是机体重要的免疫调节器官，这使得肝脏更容易遭受包括感染在内的多种因素诱导的氧化应激反应和氧化还原能力的受损，继而导致肝细胞生化和代谢过程的损害，加重肝损伤，因此，减轻氧化应激可成为治疗脓毒症相关肝损伤的潜在策略[21]。研究指出，氧化应激是细胞内ROS的积累与清除能力及抗氧化修复能力之间的不平衡[22]，脓毒症的发生发展与ROS的过量产生也密切相关[23]。因此，进一步研究了Mito-Tempo是否通过减轻氧化应激发挥肝脏保护作用。MDA是脂质过氧化和氧化应激升高的1个指标，SOD水平反应机体是抗氧化能力[24]。在本研究中，Mito-Tempo预处理提高了小鼠实验模型血清中SOD的活性，降低了MDA水平（图4），此外，还发现Mito-Tempo治疗降低了mtROS的荧光强度（图5），这些结果表明Mito-Tempo在体内具有较强的抗氧化能力。

线粒体功能障碍是导致脓毒症相关器官功能衰竭的重要原因之一，线粒体形态学改变和mtROS水平升高与线粒体功能障碍密切相关[25]。通过电镜扫描评估肝脏线粒体形态，本研究发现CLP组肝脏线粒体出现肿胀、膜完整性被破坏，线粒体嵴断裂或缺失，而Mito-Tempo治疗后可部分恢复线粒体形态（图6），其次，线粒体在调节细胞增殖和程序性死亡方面也发挥着重要作用。目前证据表明，ROS可作为NLRP3炎性小体的激活因子 [26]，影响Caspase-1-GSDMD 通路介导的细胞焦亡的发生，它能以细胞膜破裂和促炎性胞内物质释放的方式进一步放大炎症反应[27]，在脓毒症和脓毒性休克中起着关键作用。因此，ROS被认为是连接线粒体氧化应激和炎症反应的一个重要指标和关键治疗靶点[28]，本研究结果表明，Mito-Tempo治疗降低了细胞焦亡相关蛋白cleaved-Caspase-1、cleaved-GSDMD、IL-1α、和IL-1β的表达（图7）。这些结果为Mito-Tempo可以通过减轻细胞氧化应激和恢复线粒体功能来抑制Caspase-1的激活和细胞焦亡的发生提供了证据。

综上所述，脓毒症可导致线粒体损伤，而线粒体损伤可通过ROS的产生引起氧化应激，诱发细胞焦亡，线粒体靶向抗氧化剂Mito-Tempo可减轻氧化应激，抑制Caspase-1介导的细胞焦亡，调控炎症反应，为药物治疗脓毒症相关肝损伤的提供了新的潜在靶点。

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（责任编辑：曾 玲）

基金项目：重庆市科卫联合重点资助项目（编号：2023ZDXM004）。