Maresin-1 改善青少年期抑郁小鼠的抑郁样行为和神经炎症

【摘 要】目的：阐明Maresin-1（MaR1）对慢性社交挫败（chronic social defeated stress，CSDS）诱导青少年期（5～8周）小鼠抑郁样行为的影响，验证其在CSDS诱导的神经炎症中的作用，为理解抑郁症的分子机制和探索生物标志物提供参考。方法：利用多种方法来检测CSDS诱导10 d后C57BL/6J小鼠的抑郁样行为和神经炎症。并每2 d注射1次MaR1（5 μg/kg）治疗小鼠，以观察其对CSDS诱导的抑郁样行为和神经炎症的影响。行为学实验后进行PET-CT扫描并对PET图像进行定量分析；收集小鼠脑组织样本进行免疫荧光染色，采用Image J对海马区域Iba-1细胞、 TSPO免疫荧光强度进行统计；将小鼠海马体在冰上分离，并立即在液氮中快速冷冻，然后储存在-80 ℃下进行随后的RNA提取，试剂盒检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1 beta，IL-1β）和IL-4含量。结果：与对照组相比，CSDS应激后，小鼠表现出低糖水偏好比（P=0.003）低社会交互比（P=0.000）、更长的不动时间（P=0.002），在海马区域，小胶质细胞活化，表现为SUV 值升高（P=0.020），Iba-1和TSPO的免疫荧光强度增强（P=0.000）和促炎细胞因子IL-1β和TNF-α升高（P=0.016、0.036）。而MaR1改善了上述CSDS诱导的抑郁样行为，抑制小胶质细胞的激活和减少促炎因子的表达。结论：MaR1能够缓解CSDS诱导的青少年期小鼠抑郁样行为，抑制小胶质细胞的活化。神经炎症是青少年抑郁症的潜在致病因素，具有抗炎特性的药物如MaR1有潜力作为临床相关的抗抑郁药，需要进一步地研究。

【关键词】青少年；抑郁症；小胶质细胞；［18F］DPA-714PET；Maresin-1

【中图分类号】R749.4 【文献标志码】A 【收稿日期】2024-02-20

抑郁症作为一种严重的、危及生命的精神疾病是青少年中最普遍的精神障碍[1]。全球约有34%的10～19岁青少年有患有抑郁症的风险，特别是来自中东、非洲和亚洲的青少年患抑郁症的风险最高[2]。1项荟萃分析显示，在中国约有19.85%的儿童和青少年患有抑郁症[3]。目前对于抑郁症的诊断主要依靠临床症状和量表，然而患有抑郁症的青少年更容易出现易怒和不稳定的情绪[4]，而不是经典的抑郁核心症状（情绪低落），且使用不同的量表，对于抑郁的诊断也具有很大的差异[3]，因此为了更加准确对青少年抑郁症的诊断，迫切地需要找到一个客观的生物标志物。

另一方面，临床上常用的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂可能会导致更多的不良事件，如自杀风险增高[5]。因此寻找一些新的治疗靶点也迫在眉睫。事实上，越来越多的研究认为炎症在抑郁症的发生发展中起着重要作用[6-8]。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，被认为与中枢神经系统炎症和疾病进展密切相关[9-10]。小胶质细胞能够对神经炎症做出反应，并通过释放炎症诱导的细胞因子及其代谢产物从而来调节抑郁症状。MaR1是一种抗炎和促分解介质，具有再生组织的潜力[11]。1项临床研究发现，青少年抑郁症患者的MaR1水平较低，抗抑郁治疗后MaR1 水平升高[12]。MaR1 可能在抑郁症状的发展以及药物治疗中起关键作用。

因此，本研究旨在阐明MaR1对慢性社交挫败（chronic social defeated stress，CSDS）诱导青少年期（5～8周）小鼠抑郁样行为的影响，验证其在CSDS诱导的神经炎症中的作用，更好地为青少年抑郁症的治疗提供潜在的治疗靶点，为理解抑郁症的分子机制和探索生物标志物提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只雄性CD-1小鼠和60只雄性C57BL/6J小鼠（年龄为4周龄，重15～20 g），均购自重庆医科大学动物实验中心。在获得小鼠后，将小鼠适应性饲养1周（1只/笼）。饲养条件包括室内温度为（24±1） ℃；小鼠的昼夜节律为12 h，即8：00（开灯）至20：00（关灯）；每周更换1次垫料；以及获得充足的饲料和水。对这些小鼠进行的实验程序得到了重庆医科大学伦理委员会（K2023-010）的正式批准。

1.2 实验流程

建模前，C57BL/6J和CD-1小鼠被分开关在笼子里适应1周，并让后者形成领地意识。CD-1小鼠仅用于CSDS中。根据攻击潜伏期和1 min内攻击次数等参数对攻击性CD-1小鼠进行了3次筛选。

将C57BL/6J小鼠随机分为生理盐水对照组（CON组）、CSDS+生理盐水组（CSDS+NS组）和CSDS+MaR1（5 μg/kg）组（CSDS+MaR1 组）。CON 组和CSDS+NS 组每2 d 腹腔注射1次2 mL生理盐水；CSDS+MaR1组每两日注射1次Maresin1药物。CSDS+NS组和CSDS+MaR1组小鼠每天会被CD-1鼠攻击5～10 min。之后，该组小鼠将与CD-1鼠饲养在同一笼盒，笼盒中间用带有小孔的透明隔板隔开，使C57BL/6J小鼠仍然可以看到和闻到CD-1鼠，但不能与CD-1鼠直接接触。每天移动C57BL/6J小鼠的位置，使得其每天被不同的CD-1鼠攻击，慢性社交挫败共持续10 d。

1.3 行为学测试

1.3.1 糖水偏好实验（sucrose preference test，SPT）

进行这项测试是为了评估小鼠快感缺失[13]。每只小鼠的笼子里都放着2个形状、大小、外观相同的水瓶，一瓶装有纯净水，另一瓶装有1%的蔗糖溶液。瓶子随机摆放在两侧。为避免外界干扰，测试在给小鼠足够食物和安静的环境中进行。计算24 h内糖水偏好百分比公示如下：

1.3.2 社会交互实验（social interaction test，SIT）

该测试的目的是评估小鼠社交回避行为[14]。测试分为2个阶段，每个阶段持续2.5 min。在初始阶段，将正方体空场测试箱（大小为50 cm×50 cm×50 cm）底部的其中一侧的中间（范围为9.5 cm×9.5 cm×6.5 cm）放入1个没有CD-1鼠的网笼，然后将小鼠放在测试箱中央自由探索。第一阶段结束后将小鼠拿出，并放回原来笼盒30 s，为了去除气味，用酒精擦拭网笼和测试箱。第二阶段，放入1个有CD-1鼠的网笼，将小鼠放在测试箱中央自由探索。当小鼠进入互动区（网笼周围20 cm×30 cm）计时并记录。计算社交交互比率（social in⁃teraction ratio，SI），即在有CD-1小鼠的互动区所花费的时间— 466 —与在没有CD1小鼠的互动区所花费的时间之比。

1.3.3 悬尾实验（tail suspension test，TST）

小鼠被悬挂在工作台上30厘米处，其头部距离工作台15 cm，并用胶带封住其尾巴后部的1/3共6 min。测量实验的最后4 min的不动时间。根据小鼠在悬尾试验中的不动时间来评估与行为绝望一致的抑郁样反应[15]。

1.4 PET-CT扫描

使用[18F]DPA-714对小鼠大脑进行PET-CT扫描。每组随机选择4只小鼠在通过外侧尾静脉注射[18F]DPA-714后，使用纳米PET 扫描仪（Mediso Ltd.，Budapest，Hungary）进行PET-CT扫描。在异氟烷麻醉下，将小鼠置于扫描仪视野的中心进行全脑扫描，在PET扫描后0～20 min内测量区域脑摄取值，以便对小鼠的摄取值进行标准化（standardizeuptake values，SUV）。对PET图像进行定量分析，计算公式如下：

1.5 免疫荧光分析

行为学测试结束后使用戊巴比妥钠麻醉小鼠。将脑组织灌注入含有0.01 M磷酸盐缓冲液和4%多聚甲醛的溶液中进行固定，然后在4 ℃下保存并用4%多聚甲醛固定。对脑组织进行切片，厚度为3～5 μm，并将其包埋在石蜡中并干燥。在抗原提取之前，在微波炉中使用EDTA缓冲液（PH=8.0）处理25 min以去除蜡质。随后，在4 ℃下孵育时加入抗TSPO（1∶2 000，Abcam，UK）和抗Iba-1（1∶1 000，Novus，USA）。经过PBS冲洗后，在37 ℃下与羊抗小鼠IgG（1∶100，Servicebio）和羊抗兔IgG（1∶100，Servicebio）结合荧光素异硫氰酸酯孵育90 min。然后，在给切片PBS 冲洗之前，使用DAPI溶液复染10 min。利用配备Fluoview FVX共聚焦扫描头和激光扫描共聚焦显微镜（Olympus SP2 倒置显微镜，Leica Microsystems Heidelberg GmbH，Germany），将切片放置于载玻片上，并覆盖玻片进行扫描。通过Image J程序来确定海马切片中GFAF、TSPO和Iba-1的免疫荧光强度。

1.6 实时荧光定量PCR分析

行为学测试后，将小鼠进行大脑切除。将海马在冰上分离，并立即在液氮中快速冷冻，然后储存在-80 ℃下进行随后的RNA 提取。使用试剂盒（Tiangen Biotechnology，中国）从海马组织中提取总RNA，并使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测量浓度。然后使用逆转录试剂盒（Servicebio）将RNA逆转录cDNA，该试剂盒使用实时荧光定量PCR 系统（ABI Prism 7500）、SYBR Green qPCR预混液（High ROX）（Servicebio）和以下引物进行扩增：IL-1β（上游引物为5’-GCATCCAGCTTCAAATCTCGC-3’，下游引物为5’-TGTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3’）；TNF-α（上游引物为5’-GGCAGCCTTGTCCCTTG-3’，下游引物为5’-GCCTCCCTCTCATCAGTTCTA-3’）；IL-4（上游引物为5’-TGTCATCCTGCTCTTCTTTCTCG-3’，下游引物为5’-TTTGGCACATCCATCTCCGT-3’）。使用GAPDH作为参考，通过2-ΔΔCt方法计算相对表达。

1.7 统计学方法

使用GraphPad Prism 9.5.1分析数据，数据以均数±标准差（x±s）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）各组间的差异，并采用t 检验评估2 组间差异的显著性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MaR1治疗改善CSDS诱导的青少年期小鼠抑郁症状

10 d CSDS应激后，在小鼠中观察到抑郁样行为。具体表现为，对照组相比，糖水偏好比降低（P=0.003）、在TST中的不动时间增加（P=0.002），社会交互比率降低（P=0.000），结果如表1所示。结果表明，CSDS能够成功诱导青少年期小鼠的抑郁样行为。与CSDS+NS组相比，CSDS+MaR1组在TST中的不动时间显著降低（P=0.002），此外CSDS+MaR1组的糖水偏好比、社会交互比率均升高（P=0.019、0.004），结果说明MaR1治疗成功改善CSDS诱导的青少年期小鼠抑郁症状（表1）。

2.2 MaR1 治疗降低体内青少年期小鼠颅内PET-CT 中[18F]DPA-714的SUV值

[18F]DPA-714 PET成像方法用于监测3组小鼠的TSPO水平，以评估小胶质细胞活化。标准化摄取值（SUV，g/mL）用于监测全脑和不同脑区对[18F]DPA-714的摄取。在本研究中，每组各3 只雄性C57BL/6J 小鼠接受了[18F]DPA-714PET（图1A）。结果如表2、图1B所示。CSDS应激诱导下，[18F]DPA-714信号在大脑中明显增加。用MaR1治疗逆转了SUV的增加。具体而言，CSDS诱导下，青少年期小鼠海马区域SUV较对照组增加（P=0.020），而MaR1治疗组的小鼠，SUV值较CSDS+NS组有所缓解（P=0.029），这表明MaR1可能具有抑制小胶质细胞的活化的作用。

2.3 MaR1治疗降低CSDS青少年期小鼠海马体小胶质细胞标志物的表达

对小鼠海马区域小鼠脑片进行免疫荧光染色，示意图如图2。对不同组间海马体中小胶质细胞标志物Iba-1表达的差异进行分析，同时使用Image J分析Iba-1、TSPO的免疫荧光强度。在海马组织中，CSDS+NS组Iba-1、TSPO免疫荧光强度都明显高于CON组（P=0.000、0.000）。用MaR1治疗后逆转了小胶质细胞活化的趋势，CSDS+MaR1组免疫荧光强度明显低于CSDS+NS组（P=0.038、0.049）（图3、表3）。

2.4 各组小鼠海马炎症因子的变化（IL-1β、TNF-α、IL-4）

每组随机挑选3只小鼠，使用qRT-PCR技术测量它们体内与小胶质细胞密切相关的多种细胞因子的水平。与对照组相比，发现促炎细胞因子IL-1β 和TNF-α 升高（P=0.016、0.036）。研究结果表明，MaR1能够部分逆转CSDS诱导的促炎因子的表达，但这种差异并不显著（Pgt;0.05）。与对照组相比，IL-4则呈下降的趋势，MaR1也没有逆转此趋势（图4）。

3 讨 论

本研究旨在探讨MaR1对CSDS诱导青少年期小鼠抑郁样行为的影响，验证其在CSDS诱导的神经炎症中的作用。结果表明，MaR1 治疗改善了CSDS诱导的青少年期小鼠的抑郁样行为和小鼠颅内小胶质细胞的激活，而活体大脑的全脑细胞扫描和海马组织的免疫荧光分析支持这一发现。

本研究通过行为学实验评估了CSDS诱导青少年期小鼠抑郁行为和抗炎药物的治疗效果。糖水偏好实验被用作快感缺乏（抑郁症的核心症状）的评估[16]。CSDS应激降低了小鼠的糖水偏好百分比，而MaR1 治疗逆转了小鼠的抑郁症状。同样的，MaR1也明显缓解了CSDS诱导的小鼠悬尾实验的不动时间和社会交互比的下降，显示出该药物的抗抑郁效果。

越来越多的研究认为神经炎症在包括抑郁症在内的脑部疾病中起着至关重要的作用。小胶质细胞是中枢神经系统的巨噬细胞，正常情况下，小胶质细胞处于静息状态，当被激活后其能够产生促炎细胞因子和趋化因子，并导致神经退行性疾病[17]。目前，TSPO-PET成像是用于推断小胶质细胞活化状态的最广泛使用的体内方法，并且TSPO可以作为抑郁症等应激相关疾病的假定治疗效果的直接靶标[18]。在1项荟萃分析中发现，抑郁症患者的海马、前额叶皮层、前扣带皮层等区域的TSPO-PET信号明显增加[19]，这与本研究结果一致。本课题组前期也在不同的抑郁动物模型中观察到[18F]DPA-714信号的动态变化[20-22]，然而先前对啮齿动物模型的研究主要集中在成年小鼠上，且并没有人研究过青少年期抑郁小鼠模型的神经炎症变化。海马作为与压力和抑郁有关的最重要的区域之一。本研究观察到[18F]DPA-714的SUV在青少年抑郁小鼠海马区域中明显增加，表明小胶质细胞在海马区域被激活。同样的，MaR1治疗抑制了小胶质细胞的激活，这提示该药物可能通过抑制小胶质细胞的激活来减轻小鼠抑郁样行为。此外，多项研究表明，与健康对照组相比，青少年抑期郁症患者外周血中的TNF-α和IL-6水平明显增加[23-25]，这表明炎症细胞因子与青少年期抑郁症之间存在很强的关联。本研究发现在CSDS诱导下，青少年期C57BL/6J小鼠的促炎因子IL-1β 和TNF-α 升高。MaR1 治疗后，促炎因子的升高有缓解的趋势，但没有统计学意义，另外与前人研究不一致的地方[26]，本研究发现抑郁样小鼠IL-4水平反而呈下降的趋势，这可能是由于样本量太小所致，有待进一步的研究。

此外这项研究还有2个局限性：①没有测量动物大脑或者血液中的MaR1浓度，也没有用不同浓度的MaR1进行治疗；②在本研究中只用了雄性小鼠，没有排除性别和性激素的影响。总而言之，实验结果表明，MaR1能够缓解CSDS诱导的青少年期小鼠抑郁样行为，抑制小胶质细胞的活化。这些结果表明神经炎症是青少年抑郁症的潜在致病因素，具有抗炎特性的药物如MaR1有潜力作为临床相关的抗抑郁药，需要进一步的研究。

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（责任编辑：周一青）