MK8719 激活STAT6 并促进抗炎型小胶质细胞活化在缺血性脑损伤大鼠中发挥保护作用的研究

【摘 要】目的：观察氧连接N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）水解酶抑制剂MK8719在脑缺血损伤大鼠中的作用。方法：建立大鼠大脑中动脉梗塞模型模拟脑缺血再灌注损伤，通过2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphen⁃yltetrazolium chloride，TTC）染色评估脑梗死体积，并通过改良的神经损伤评分量表评估大鼠的神经运动障碍减轻，HE和尼式染色用于评估脑损伤后组织改变，组织免疫荧光染色用于评估抗炎型小胶质细胞活化情况。体外培养BV2小胶质细胞并建立氧糖剥夺/复糖复氧模型模拟缺血缺氧再灌注损伤，Western blotting检测总蛋白及核蛋白中的信号转导及转录激活蛋白6（sig⁃nal transducer and activator of transcription 6，STAT6）、磷酸化STAT6及O-GlcNAc糖基化STAT6表达。酶联免疫吸附检测（En⁃zyme linked immunosorbent assay，ELISA）评估小胶质细胞释放的炎性因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）量。结果：MK8719给药组大鼠梗死灶体积减小，神经运动障碍，抗炎型小胶质细胞比例增加；在体外培养的小胶质细胞中，MK8719组的O-GlcNAc糖基化STAT6、磷酸化STAT6及核STAT6表达增加（Plt;0.001），促炎因子（IL-6及IL-1β）释放减少（Plt;0.001），抗炎因子（IL-10及TGF-β）释放增加（Plt;0.001）。结论：MK8719对脑缺血损伤大鼠有保护作用，其作用机制可能与STAT6激活诱导的抗炎型小胶质细胞活化有关。

【关键词】缺血性脑卒中；MK8719；信号转导及转录激活蛋白6；小胶质细胞

【中图分类号】R3 【文献标志码】A 【收稿日期】2023-12-07

脑卒中是导致中老年人群死亡、残疾的主要疾病之一，缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）是最常见的脑卒中类型。于CIS急性期（CIS后2周）干预脑缺血损伤能挽救缺血半暗带（梗死组织周围的低灌注区域）的进一步损伤，从而有助于降低疾病死亡率[1]。CIS急性期的重要损伤机制之一为过度的炎性反应与氧化应激、微循环障碍、线粒体功能障碍等损伤环节相互作用，形成炎性级联效应从而加重脑损伤[2]。因此，过度的炎性反应是加重脑缺血损伤的关键机制，而抗炎治疗被认为是急性期CIS的重要治疗手段。

小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，是CIS后响应缺血缺氧刺激，启动神经炎性反应的重要效应细胞。根据所处微环境的不同，小胶质细胞表现出不同活化状态。在神经炎性反应中，小胶质细胞被分为抗炎型和促炎型。在脑缺血损伤后，抑制所有小胶质细胞活化，可能干扰抗炎型小胶质细胞的组织损伤修复作用；而促进抗炎型小胶质细胞活化，一方面可通过增加抗炎细胞因子白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、白细胞介素-4（inter⁃leukin-4，IL-4）等释放，拮抗促炎型小胶质细胞的过度活化；另一方面可释放更多的神经血管营养因子，如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管生长因子等，从而有利于组织损伤修复[3-4]。因此，促进抗炎型小胶质细胞活化可能是CIS急性期更为安全有效的抗炎治疗方法。

STAT6是一种核转录蛋白，是CIS后诱导抗炎型小胶质细胞活化的重要因子。在脑缺血损伤动物中，STAT6通过诱导抗炎型小胶质细胞活化，减轻脑组织损伤[5]。在体外研究中发现，O-GlcNAc糖基化能促进STAT6的激活，并诱导具有抗炎功能的巨噬细胞/小胶质细胞活化[6]。目前，尚不清楚促进STAT6的O-GlcNAc糖基化是否能在脑缺血损伤中促进抗炎型小胶质细胞活化。O-GlcNAc 水解酶（O-GlcNAcase，OGA）抑制剂Thiamet-G可增加脑组织蛋白的O-GlcNAc糖基化水平，在脑缺血损伤模型中具有抗炎保护作用[7]。MK8719作为一种高效的OGA抑制剂，具有极好的血脑屏障透过能力[8]，但其在脑缺血损伤中的作用亦未明确。因此，本研究旨在探讨MK8719在急性脑缺血损伤大鼠中的作用及给药后STAT6和抗炎型小胶质细胞的改变。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

重庆医科大学实验动物中心共提供104 只成年雄性Sprague Dawley大鼠（220～250 g），其中Sham组大鼠共26只，MCAO 组大鼠32 只，MCAO+NC 组大鼠24 只，MCAO+MK8719组大鼠22只，造模后12只大鼠死亡。所有实验都得到了重庆医科大学实验动物伦理委员会的批准。本研究中所用线栓购自北京西浓公司。MK8719购自美国Selleck，货号为S8890；2，3，5-三苯基四氯化铵（2，3，5-triphenyl-2Htetrazoliumchloride，TTC）及水合氯醛购自美国Sigma ‒Aldrich公司。组织免疫荧光共标染色所使用的抗Iba-1及CD206 抗体购自于美国Abcam 公司，货号分别为ab178847和ab64693。总蛋白及核蛋白提取试剂盒购自Invent公司，货号分别为SD-001 和SC-003。Western Blotting 所使用的抗STAT6 抗体购自于美国的Santa Cruz 公司，货号为sc-374021；抗磷酸化STAT6 抗体（P-STAT6）抗体购自于美国Sigma‒Aldrich 公司，货号为SAB4504546，抗LaminB1和抗β-actin 抗体购自于Proteintech 公司，货号为12987-1-AP 和81115-1-RR，抗O-GlcNAc糖基化抗体购自于美国Cell Sig⁃naling Technology公司，货号为9875。ELISA试剂（IL-6、IL-1β、IL-10 和TGF-β）盒购于中国Boster 公司，货号分别为EK0411、EK0394、EK0417和EK0515。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备

利用大脑中动脉梗塞模型（middlecerebral artery occlusion，MCAO）模拟脑缺血损伤。大鼠通过腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，给药剂量为10 mL/kg。暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉后，通过颈外动脉将线栓插入颈内动脉，距离插入点约18～20 mm处为大脑中动脉，于1 h后取出线栓并结扎缝合伤口。假手术组（Sham组）大鼠仅剥离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，无线栓插入。

1.2.2 给药方法及动物分组

由于脑缺血损伤后3 d是炎性损伤最为剧烈的时期，且小胶质细胞在MCAO后3 d亦开始大量活化[9]，故选择MCAO后3 d为治疗时间。具体来说，将MK8719稀释于0.9%的生理盐水中（1.5 mg/mL），于术后1 h进行腹腔注射（30 mg/kg），每天1次，直到MCAO后第3天，给药后动物饮食无影响，无死亡。安慰剂组（MCAO+NC组）大鼠腹腔注射相同体积的生理盐水。实验动物分为4组：Sham组、MCAO组、MCAO+NC组和MK8719组。

1.2.3 TTC染色

采用TTC染色评估MCAO后3 d的脑梗死体积。大脑沿冠状方向切片（2 mm），用2% TTC溶液在37 ℃避光环境下染色30 min。使用Image J软件测量每个大脑的梗死面积，梗死体积（mm3）计算如下：总梗死面积-（右半球面积-左半球面积）×切片厚度。相对水肿体积（%）的计算方法如下：（右半球体积-左半球体积）（/ 左半球体积×2）×100%。

1.2.4 改良的神经损伤评分

在MCAO后3 d，记录人员采用改良的神经损伤评分方法（the modified neurological sever⁃ity score，mNSS）对动物的运动、反射、感觉功能和平衡能力进行评估，0分代表功能正常，18分为最大神经功能损伤。

1.2.5 尼式染色及HE染色

大鼠深度麻醉后，用生理盐水对动物进行心脏灌注后快速取出全脑，并用4%多聚甲醛固定12 h。常规石蜡包埋后切片（5 μm），切片分别用甲酚紫、苏木素-伊红染色，在400倍视野下选取梗死周围组织进行观察。在尼式染色中，随机选取梗死灶周边0.3 cm皮质区域的3个不重叠区域计算完整神经元数的平均值。HE染色的形态变化由重庆医科大学第二附属医院的病理医生进行评估。

1.2.6 细胞培养及给药处理

BV2小胶质细胞在含有10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素的DMEM培养基中，于37 ℃的5%的CO2培养箱中培养。为了诱导氧糖剥夺/复糖复氧模型（Oxygen and glucose deprivation/ re-oxygenation，OGD/R），用无糖DMEM替代高糖DMEM，并将细胞转移到三气培养箱中，在37 ℃含94% N2、1% O2和5%CO2的环境下培养3 h后，再将细胞于正常培养环境及完全培养基中培养24h。OGD/R后的BV2细胞与MK8719（200 ng/mL）孵育12 h作为MK8719组。

1.2.7 Western blotting 检测蛋白表达

从模型组的缺血半暗带（梗死灶边缘0.3 cm）皮质区域和BV2细胞中提取蛋白。总蛋白在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中提取。每个样品中取等量的蛋白质在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，再转移到聚偏氟乙烯膜。然后用5%牛血清白蛋白在室温下封闭1.5 h，在4 ℃下一抗孵育过夜，Bio-Rad发光仪显影成像。利用Image Lab（Image Lab 6.0.1，Bio-Rad）软件对条带进行量化。一抗孵育浓度如下：STAT6（1∶500），磷酸化STAT6（1∶200），O-GlcNAc 糖基化抗体（1∶500），β-actin（1∶1 500），LaminB1（1∶1 000）。

1.2.8 STAT6的O-GlcNAc糖基化检测

STAT6抗体在洗涤缓冲液中稀释至终浓度50 μg/mL，将400 μL稀释后的抗体加入蛋白A/G磁珠中，在4 ℃下旋转孵育4 h。组织匀浆在4 ℃下与磁珠旋转孵育过夜。短暂离心后，在95 ℃下洗脱5min，洗脱液用于Western blotting检测。

1.2.9 组织免疫荧光染色

心脏灌注后取脑，并固定12 h。于蔗糖溶液梯度脱水后，将脑组织制成10 μm厚的冷冻切片。用5% BSA和0.5% Triton X-100在37 ℃下封闭1 h，封闭结束后用Iba-1和CD206抗体（1∶200）孵育过夜，荧光二抗于室温孵育2 h，洗片后再滴加含DAPI封片剂，于Leica荧光显微镜下观察。计算梗死灶周边皮质区域的CD206/Iba-1双阳的细胞与Iba-1阳性细胞之比。

1.2.10 酶联免疫吸附检测

采用ELISA对BV2细胞培养基上清液中的炎性细胞因子（IL-6、IL-1β、IL-10和TGF-β）浓度进行定量分析。用酶标仪测定各实验孔在450 nm处的吸光度。细胞因子浓度根据试剂盒中提供的标准方法进行计算。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的多重比较进行检验分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 MK8719可减轻MCAO大鼠的脑缺血损伤

TTC 染色结果显示，MK8719 给药减少了梗死体积[MCAO+MK8719 vs. MCAO+NC，F（3，28）=181.400，Plt;0.001]（图1A和1B）；行为学评分结果表明，MK8719给药可减轻脑缺血后大鼠的神经运动功能障碍[MCAO+MK8719 vs.MCAO+NC，F（3，88）=529.200，Plt;0.001]（图1C）；HE 染色后光镜下观察发现，MCAO组的脑组织结构松散，神经元排列紊乱、胞质疏松且有不同程度的细胞核固缩变形。MK8719给药后，脑组织及神经元损伤减轻（图1D）；尼式染色中，MCAO组的神经元变形，中央尼式小体溶解。计数脑梗死灶周围皮质区域细胞形态正常、核圆且核仁清晰的完整神经元，发现MK8719 给药后完整神经元个数增加[MCAO+MK8719 vs. MCAO+NC，F（3，20）=201.700，Plt;0.001（] 图1E）。

2.2 MK8719增加STAT6的O-GlcNAc糖基化水平并诱导抗炎型小胶质细胞活化

脑缺血损伤后，大鼠脑组织中STAT6的O-GlcNAc糖基化水平增加[Sham vs. MCAO，F（3，20）=17.510，P=0.019]；MK8719 给药后STAT6 的O-GlcNAc 糖基化水平增加[MCAO+NC vs. MCAO+MK8719，F（3，20）=17.510，P=0.012]（图2）。使用Iba-1/CD206共同标记抗炎型小胶质细胞，如图3 所示，MK8719 给药组中，抗炎性小胶质细胞（Iba-1/CD206 双染细胞）活化高于模型对照组[MCAO+NC vs.MCAO+MK8719，F（3，20）=10.760，Plt;0.001]（图3）。因此，推测MK8719可能通过影响STAT6促进抗炎型小胶质细胞活化从而发挥神经保护作用。

2.3 小胶质细胞中，MK8719促进STAT6活化并改变炎性因子释放

为探索MK8719在脑缺血损伤中的保护作用是否与小胶质细胞有关，本研究进一步通过体外培养小胶质细胞（BV2 细胞系），建立氧糖剥夺模型进行验证。OGD/R 后，STAT6 的O-GlcNAc 糖基化水平增加[OGD/R+MK8719 vs.OGD/R，F（3，20）=26.480，Plt;0.001]；MK8719 给药后，STAT6的O-GlcNAc 糖基化水平进一步增加[OGD/R+MK8719 vs.OGD/R，F（3，20）=26.480，P=0.004]（图4C、G），但总STAT6的表达水平没有明显改变（图4A、E）。同时，STAT6的磷酸化水平增加[OGD/R+MK8719 vs. OGD/R，F（3，20）=57.930，Plt;0.001]（图4A、D），细胞核的STAT6（n-STAT6）表达水平增加[OGD/R+MK8719 vs. OGD/R，F（3，20）=103.300，Plt;0.001]（图4B、F）。ELISA检测发现，MK8719增加抗炎因子IL-10及TGF- β 的释放[OGD/R+MK8719 vs. OGD/R，F（3，32）=60.510，Plt;0.001，F（3，32）=60.970，Plt;0.001]并减少促炎因子IL-1β及IL-6的释放[OGD/R+MK8719 vs. OGD/R，F（3，32）=147.500，Plt;0.001，F（3，32）=37.400，P=0.001]（ 图4H）。

3 讨论

O-GlcNAc糖基化是指在蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上添加单糖的翻译后修饰，能调控被修饰蛋白的定位、功能、活性及寿命等[10]，在阿兹海默病、心脏病、癌症等多种疾病的发生发展中有着重要作用[11-13]。促进脑组织O-GlcNAc糖基化能缓解小胶质细胞介导的神经炎性损伤。氨基葡萄糖治疗通过增加模型动物脑组织的O-GlcNAc糖基化水平，能缩小脑梗死体积并缓解神经运动功能障碍[14]。MK8719作为一种高效的O-GlcNAc水解酶抑制剂，具有高效的促O-GlcNAc糖基化作用，而其在脑缺血损伤中的作用仍不明确。本研究结果表明，MK8719能改善MCAO动物的脑组织损伤和神经运动功能障碍，其保护作用可能与抗炎型小胶质细胞活化有关。

小胶质细胞在中枢神经系统的发育、稳态及疾病发展中发挥重要作用。小胶质细胞具有代谢可塑性，这允许它在不同疾病状态下维持活化功能，也导致小胶质细胞的活化功能表现出很大的时空异质性。神经炎性反应研究中，将活化的小胶质细胞分为抗炎型和促炎型。目前认为，在脑缺血损伤中，诱导抗炎型小胶质细胞活化的抗炎策略具有很大的治疗潜力[15-16]。STAT6是诱导抗炎型小胶质细胞活化的重要调控分子，通过磷酸二聚化入核发挥转录因子活性。已有文献指出，O-GlcNAc糖基化能促进STAT6入核，从而增强其转录活性[6]。本研究亦发现，MK8719能增加STAT6的O-GlcNAc糖基化水平，并促进STAT6的赖氨酸磷酸化水平及细胞核中STAT6的表达。目前尚不能明确O-GlcNAc糖基化调控STAT6磷酸化的机制。在肠道蠕虫感染的研究中，研究者发现促进STAT6的O-GlcNAc糖基化可以增强STAT6 的赖氨酸磷酸化，但突变STAT6的多个糖基化位点后，STAT6的酪氨酸磷酸化水平无明显改变[6]。因此，STAT6的O-GlcNAc糖基化应不是STAT6赖氨酸磷酸化的先决条件，其可能通过其他调控因子介导STAT6的酪氨酸磷酸化。此外，脑缺血后急剧的代谢改变可通过影响化学修饰底物水平调控各种蛋白的翻译后修饰。在乳腺肿瘤中发现，Hedgehog信号通路通过调控脂质代谢减少尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖胺的生物合成途径从而抑制STAT6的O-GlcNAc糖基化[17]。本研究观察到MK8719能促进小胶质细胞释放抗炎因子（IL-10、TGF-β）并抑制促炎因子（IL-6、IL-1β）释放，增加MCAO大鼠脑组织中抗炎型小胶质细胞的活化，这提示MK8719可能通过促进STAT6介导抗炎型小胶质细胞活化，从而发挥脑保护作用。然而，未明确STAT6是否是MK8719发挥抗炎保护作用的核心分子。已有研究报道，诱导NF-κB的OGlcNAc糖基化亦可减轻MCAO后的炎性损伤并抑制促炎性小胶质细胞活化[18]。阿兹海默病研究中，RIPK3的O-GlcNAc糖基化通过诱导抗炎型小胶质细胞活化，从而缓解认知障碍[19]。因此，在接下来的研究工作中，将进一步探讨STAT6是否为MK8719在脑缺血大鼠中发挥抗炎保护作用的核心调控分子。

综上所述，MK8719可能通过诱导抗炎型小胶质细胞活化，从而在脑缺血损伤中发挥神经保护作用。这可能与O-GlcNAc糖基化介导的STAT6激活有关。然而，MK8719的最佳用药时间、用药剂量以及在脑缺血损伤中如何通过STAT6发挥保护作用仍有待进一步研究。

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（责任编辑：曾 玲）

基金项目：重庆市科技局资助项目（编号：2022NSCQ-BHX1471）。