Maresin1 通过Sirt1 抑制Caspase11/GSDMD 通路减轻小肠缺血再灌注损伤的研究

【摘 要】目的：探讨巨噬素1（Maresin1，Mar1）在小鼠肠缺血再灌注（ischemia-reperfution，IR）中的作用及其可能机制。方法：通过夹闭肠系膜上动脉（superior mesenteric artery，SMA）建立小肠IR模型。第一部分①组12只小鼠随机分为Control组、IR组和IR+Mar1组。第二部分②组20只小鼠随机分为Control组、IR组、IR+Mar1组、IR+EX527组、IR+Mar1+EX527组。Mar1于术前30 min采用5 μg/kg腹腔注射。EX527于术前1 d 10 mg/kg经腹腔注射。Control组仅分离SMA而不夹闭。其余模型组均用无损伤血管夹夹闭SMA根部，45 min后松开血管夹形成小肠IR模型。各组小鼠均于再灌注后4 h采集静脉血和回肠标本。检测①组小鼠肠组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量；检测血清4 kd荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（FITC-Dextran 4000，FD-4）含量；免疫荧光染色检测肠Occludin蛋白表达，HE染色观察肠组织病理形态。Western blot检测①、②组肠组织Sirt1、P-NF-κB p65（P-p65）、Caspase11、GSDMD-N蛋白表达。结果：①组中与Control组相比，IR组肠组织MDA水平，血清FD-4含量，病理学损伤程度均升高（Plt;0.01）；SOD、GSH水平，Sirt1蛋白表达下降；P-p65、Caspase11、GSDMD-N蛋白表达增加。与IR组比较，IR+Mar1组肠组织MDA水平及血清FD-4含量，病理组织学损伤程度均下降（Plt;0.05）；SOD、GSH水平，Sirt1蛋白表达增加；P-p65、Caspase-11、GSDMD-N蛋白表达减少。②组中与IR+Mar1组比较，IR+Mar1+EX527组Sirt1蛋白表达下降；P-p65、Caspase11、GSDMD-N蛋白表达增加。而IR+EX527组与IR+Mar1+EX527组蛋白表达差异无统计学意义。结论：Mar1预处理通过Sirt1抑制Caspase11/GSDMD通路减少肠组织缺血再灌注损伤。

【关键词】巨噬素1；缺血再灌注损伤；小肠；焦亡

【中图分类号】R656.1 【文献标志码】A 【收稿日期】2023-12-26

小肠缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）是一类危及生命的外科急症，常见于肠系膜栓塞、失血性休克、肠移植、绞窄性肠梗阻等疾病[1]。肠道是机体耐受缺血再灌注较低的器官之一，可迅速进展为肠坏死。据报道，肠缺血损伤如不能得到积极的治疗，患者存活率通常不超过50%[1-2]。提高患者对肠缺血炎症的耐受具有积极意义。在组织缺血再灌注期间，多种细胞死亡方式共同调节病理进程[3]，细胞焦亡途径的调节被认为是治疗干预缺血性损伤的一个新靶点[4]。

细胞焦亡是一类由半胱天冬酶（Caspase）介导的，由Gasdermin蛋白家族执行的一类程序性细胞炎性死亡[5]。通过调节焦亡通路减少炎性损伤是目前研究的一个热点。去乙酰化酶1（silent informa⁃tion regulator of transcription 1，Sirt1）是一种Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，属于NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶家族，在线粒体生物发生、癌症、代谢、基因沉默等方面发挥着重要作用[6-7]。Sirt1激活能够调节肠上皮内环境稳态及控制炎症状态[6，8]，但在肠缺血性疾病中对焦亡通路的调节尚不清楚。

Maresin1（Mar1）是一类具有共轭三烯双键的14s-二羟基分子，在炎症消退过程中由二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）通过脂氧合酶氧化途径合成[9]。Mar1被证明具有强大的促炎症消退作用[10]。目前研究表明，Mar1在脓毒症、肺炎、肝炎、结肠炎等多种疾病中有积极的治疗作用[11]。但在肠缺血性疾病中尚未报道，本研究旨在通过建立小肠IR 模型，探讨Mar1 是否通过Sirt1 缓解Caspase11/GSDMD通路诱导的焦亡损伤改善小肠缺血再灌注。

1 材料与方法

1.1 动物

选取6～8 周无病原体雄性C57BL/6 小鼠32 只（体质量19～23 g），购自重庆医科大学实验动物中心。动物使用许可证号：CQLA-2021-0433，所有小鼠均在IVC环境饲养，自由饮水，普通饮食，温度湿度适宜。动物实验均遵循实验相关规定进行，动物实验经过重庆医科大学附属第二医院伦理委员会批准（伦理审查编号：2023年研伦审第14号）。

1.2 试剂

Maresin1（Cayman，No. 10878）、超氧化物歧化酶检测试剂盒（superoxide dismutase，SOD，Solarbio #BC0175）、丙二醛检测试剂盒（malondialdehyde，MDA，Solarbio #BC0025）、谷胱甘肽检测试剂盒（glutathione，GSH，Solarbio #BC1175）、Anti-Sirt1（万类 #WL02995）、Anti-Caspase11（CST #14340）、Anti-Phospho-NF- κB p65（CST #3033s，磷酸化位点Ser536）、Anti-GSDMD-N（affinity #DF13758）、Anti-Occludin（Abcam#ab216327）、Anti-Claudin1（Abcam #ab180158）、Anti-β-Ac⁃tin（Servicebio #GB15001）、羊抗兔二抗（Boster #BA1056）、FITC标记山羊抗兔二抗（Servicebio #GB22303）。

1.3 方法

1.3.1 动物建模及分组

参照文献[12]方法建立模型，所有小鼠术前禁食12 h，自由饮水，备皮后经腹腔注射异戊巴比妥50 mg/kg（购自sigma 公司）麻醉，沿腹中线开口1～2 cm逐层分离入腹，钝性分离肠系膜上动脉（superior mesentericartery，SMA），用微动脉夹夹闭SMA造成小鼠肠缺血，观察到小肠挛缩苍白即缺血成功，缺血45 min后开放血管再灌注，关闭腹腔后置于暖垫复温，再灌注4 h后处死小鼠。分组如下：第一部分①组小鼠随机分为3组（n=4），Control组、IR组和IR+Mar1 组；第二部分②组小鼠随机分为5 组（n=4），Control 组、IR、IR+Mar1 组、IR+EX527 组、IR+EX527+Mar1组。假手术组仅分离SMA，不做夹闭处理；模型组操作同假手术组并夹闭SMA；Mar1组于术前0.5 h 5 μg/kg腹腔注射给药并做夹闭SMA 处理。Sirt1 抑制剂（EX527，Targetmol，T6111）于术前1 d 10 mg/kg经腹腔注射[6]。

1.3.2 病理组织学

取回盲部5 cm 内小肠组织用4% 多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片后行苏木精- 伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色。组织病理评分采用Chiu’s评分[13]。即0分：正常绒毛和腺体；1分：绒毛中轴出现肠黏膜上皮下间隙（Gruenhagen’s腔），伴随毛细血管充血；2分：固有层肠黏膜上皮抬高，肠上皮下间隙明显扩张；3 分：肠黏膜上皮抬高，绒毛向两侧倒状，部分绒毛顶端脱落；4分：大量绒毛及固有层脱落，毛细血管扩张裸露；5 分：固有层蜕变或被消化，出血或溃疡形成。

1.3.3 SOD、MDA、GSH试剂盒检测

1.3.3.1 SOD检测

取相同部位回肠组织，1∶10加入提取液后冰浴匀浆，8 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清。96孔板中依次加入相关检测试剂后，37 ℃温育30 min，560 nm检测光密度（optical density，OD）值。根据试剂盒说明书计算SOD活性。

1.3.3.2 MDA检测

取相同部位回肠组织，1∶10加入提取液后冰浴匀浆，8 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清。加入相关检测试剂后，置于100 ℃干式恒温锅60 min，冷却后10 000 r/min常温离心10 min，取上清。测定各样本532 nm和600 nm OD值。根据试剂盒说明书计算MDA活性。

1.3.3.3 GSH检测

取相同部位回肠组织，1∶10加入提取液后冰浴匀浆，8 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清。96孔板中加入相关试剂后常温静置2 min，412 nm检测OD值，绘制标曲，根据试剂盒说明书计算GSH活性。

1.3.4 肠道渗透率测定

用4 kd荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（4 kd FITC-Dextran，FD-4，Sigma-Aldrich，USA）测定IR后肠道屏障通透性的变化。参照报道[14]，小鼠行IR处理，缺血开始时，按照0.25 mg/g立即予以FD-4溶液灌胃，夹闭回盲部连接处小肠，再灌注4 h后收集血液，4 ℃ 4 000 r/min离心收集上清，置于多功能酶标仪，480/520 nm 检测荧光强度，绘制标曲，计算FD-4含量。

1.3.5 免疫切片荧光

4%多聚甲醛固定肠组织，石蜡包埋切片，行脱蜡、抗原修复、封闭处理。Anti-Occludin一抗孵育4 ℃过夜，次日PBS清洗后行二抗常温避光孵育30 min，清洗后DAPI常温避光孵育10 min后滴加荧光淬灭剂封片，正置荧光显微镜下观察荧光强度。

1.3.6 蛋白质印记法（Western blot）

PBS 润洗小肠，取20 mg 相同部位肠组织，加入含蛋白酶抑制剂组织裂解液200 μL，置于匀浆仪中充分裂解，而后冰上裂解30 min，4 ℃13 000 r/min 离心15 min，取上清液，BCA试剂盒检测提取蛋白浓度，加入1/4体积5X上样缓冲液，100 ℃金属浴5～10 min，按照30 μg/孔蛋白上样电泳，转移蛋白至PVDF膜，后用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入到稀释一抗液（Anti-Sirt1、Anti-Phospho-NF-κB p65、Anti-Caspase11、Anti-GSDMD-N、Anti-β-Actin、Anti-Occludin、Anti-Claudin1，1∶1 000 稀释），在4 ℃孵育过夜，次日用TBST洗膜后，用HRP标记的羊抗小鼠二抗室温孵育1 h，ECL显影液（四正柏）在分子凝胶成像系统成像。Image J进行半定量分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，2组组间比较采用LSD-t 检验分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Mar1预处理对小肠上皮病理组织损伤的影响

在对小鼠行Mar1治疗后，取小肠组织样本进行病理学检查（图1A），并根据小肠Chiu’s评分分级（图1B）。图示Control组肠绒毛结构完整，排列整齐，无腺体损伤，无Gruenhagen’s腔出现；与Control组比较，IR组可见绒毛缩短大量丢失，炎症细胞聚集，可见增大的Gruenhagen’s腔及腺体损伤，评分较高（t=10.910，Plt;0.001）。在对缺血小鼠进行Mar1治疗后，肠绒毛损伤明显减轻，绒毛排列大致整齐，对比IR组有明显改善，总体评分降低（t=6.502，Plt;0.001）。

2.2 Mar1预处理对小肠通透性的影响

肠道通过上皮细胞间紧密连接形成物理屏障抵御肠内抗原[15]。测定了各组小鼠紧密连接蛋白含量，小肠上皮Oc⁃cludin蛋白免疫荧光染色（图2A），相比于Control组，IR组肠上皮Occludin蛋白大量丢失，IR+Mar1组较IR组丢失减少。Western blot结果示（图2C），IR组相比于Control组，Occludin蛋 白（图2D，t=6.810，Plt;0.001）及Claudin1 蛋白（图2E，t=9.968，Plt;0.001）丢失较多，Mar1预处理可减少Occludin（图2D，t=3.669，P=0.011）、Claudin1（图2E，t=7.354，P=0.002）蛋白丢失。与免疫荧光染色检测结果一致。通过评估各组小鼠血清FD-4含量发现（图2B），IR组与Control组比较，小鼠血清FD-4含量升高（t=8.066，Plt;0.001），IR+Mar1组较IR组降低（t=2.939，P=0.026）。

2.3 Mar1预处理对小肠上皮氧化应激的影响

SOD、GSH是抗氧化应激系统的重要成员，MDA是组织细胞脂质过氧化代谢的产物。检测结果发现（图3），Control组与IR 组比较，IR 组血清SOD（图3A，t=7.157，Plt;0.001）、GSH（图3B，t=4.865，P=0.003）含量下降，MDA含量上升（图3C，t=4.862，P=0.003）；Mar1预处理后，相比IR组，IR+Mar1组SOD（图3A，t=11.170，Plt;0.001）、GSH（图3B，t=2.600，P=0.041）含量上升，MDA含量下降（图3C，t=2.834，P=0.029）。

2.4 Mar1预处理对Sirt1、P-NF-κB p65、Caspase11、GSDMD蛋白表达的影响

对各组小鼠小肠组织行Western blot 检测发现（图4A），IR与Control组相比，Sirt1表达降低（图4B，t=11.350，Plt;0.001），P-NF-κB p65（图4C，t=19.810，Plt;0.001）、Cleaved-Caspase11（图4E，t=5.351，P=0.006）、GSDMD-N（图4D，t=4.348，P=0.012）表达升高。Mar1 预处理后，相比于IR 组，Sirt1 表达上升（图4B，t=3.576，P=0.023），P-NF-κB p65（图4C，t=9.635，Plt;0.001）、Cleaved-Caspase11（图4E，t=4.444，P=0.011）、GSDMD-N（图4D，t=3.476，P=0.026）表达下降。

2.5 Mar1预处理对特异性抑制Sirt1小鼠的影响

EX527 是Sirt1 特异性抑制剂。通过给药EX527 抑制Sirt1 受体，分组行IR 造模Western blot 示（图5A）。与IR+Mar1 组比较，IR+Mar1+EX527 组Sirt1 表达降低（图5B，t=9.686，Plt;0.001），P-NF-κB p65（图5C，t=4.512，P=0.011）、Cleaved-Caspase11（图5E，t=10.050，Plt;0.001）、GSDMD-N（图5D，t=4.727，P=0.009）表达均升高。与IR+EX527 组比较，IR+Mar1+EX527 组Sirt1（图5B，t=1.550，P=0.196）、P-NF-κB p65（图5C，t=1.967，P=0.121）、Cleaved-Caspase11（图5E，t=0.583，P=0.591）、GSDMD-N（图5D，t=1.084，P=0.339）表达无统计学意义。以上结果提示Mar1 可通过Sirt1 抑制cas⁃pase11/GSDMD通路减少肠组织焦亡炎症损伤。

3 讨论

肠IR发病机制复杂，线粒体损伤、自由基累积、钙超载、炎症反应等多种因素均可能加重机体损伤[16]。因其发病诱因较多，且病情进展迅速，患者生存率低，一直是外科急症较为棘手的问题。探寻一种能够提高患者对炎症耐受，抑制过度炎症的药物具有积极的治疗意义。Mar1是一种源自DHA的促炎症消退介质（specialized pro-resolving lipid media⁃tor，SPM），文献报道，Mar1可通过NF-κB通路抑制NLRP3介导的神经根细胞死亡[17]，减轻组织损伤；在小鼠脓毒症模型中，Mar1可通过提高小鼠炎症耐受从而提高整体存活率[18]。急性炎症反应是机体的一种自我保护机制，但不受控制的急性炎症反应可能会造成组织严重损伤并导致慢性炎症[19]。据报道，Mar1可通过抑制NF-κB显著减少DSS诱导结肠炎中炎症因子的表达及中性粒细胞（polymorpho⁃nuclear leukocyte，PMN）浸润抑制过度炎症[20]，此外，Mar1也能通过抑制M1巨噬细胞浸润和促进M2巨噬细胞极化来减少炎症损伤[21-22]。由于涉及SPM作为激动剂阻止PMN浸润和巨噬细胞非炎症反应的激活，SPM 控制过度炎症机制并不等同于抗炎反应[23]。这为控制机体过度炎症提供了一种潜在的治疗方法。在结肠炎模型小鼠中，Mar1可以改善结肠炎模型小鼠疾病活动指数，减少体质量下降趋势和结肠组织病理损伤[24]。机制上可能通过负调控Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）抑制NF-κB 通路减少中性粒细胞迁移和活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的产生，激活Nrf改善肠上皮紧密连接蛋白表达，以及增强巨噬细胞M2表型缓解结肠炎损伤[20，25]。而在肠缺血再灌注疾病方面，尚未见相关Mar1疗效的报道。因此，作为一种有效的促炎症消退药物，Mar1对于小肠缺血再灌注的治疗具有潜在的应用前景。

肠道内环境的稳态依赖于微生物群、肠道上皮细胞和宿主免疫系统之间复杂的相互作用[26]，完整的肠道黏膜上皮层是小肠作为功能屏障，物质交换和营养吸收的基础[27]。当肠道上皮绒毛遭到破坏时，肠道屏障功能受损可能导致致病菌的菌群位移及其代谢物从肠腔进入血液循环系统，进而诱发全身炎症反应，甚至多器官功能衰竭[28]。本研究通过建立小鼠小肠IR模型，探究了Mar1对小肠IR的保护作用，结果显示IR 组小肠上皮绒毛大量脱落，Gruenhagen's腔形成以及肠绒毛上皮的不连续性。此外，通过测定紧密连接蛋白含量以及肠道渗透性实验发现，模型组紧密连接蛋白大量丢失，肠道渗透率提高。提示小肠IR后小肠上皮的内环境稳态及肠道黏膜屏障功能遭到严重破坏。而Mar1处理组相较于IR组，上述现象可得到逆转。表明Mar1可能通过保护肠上皮病理形态，减少上皮紧密连接蛋白丢失从而保护肠道黏膜屏障功能。

组织缺血再灌注损伤往往伴随着氧化应激的发生。目前有大量文献聚焦于缺血再灌注损伤抗氧化应激的治疗。在缺血再灌注过程中，过量的ROS会触发各种信号通路的激活，诱导细胞死亡，增加炎症反应，损害肠道屏障。线粒体抗氧化剂MitoQ可以通过抗氧化通路Nrf2/ARE防止氧化应激导致的线粒体DNA 损伤，保护小肠屏障功能[29]。Mar1也被证明可以有效降低血清MDA水平，增加血清SOD 和GSH 水平缓解脂多糖（lipopolysaccha⁃ride，LPS）诱导的心肌损伤[30]。SOD 和GSH 是机体抗氧化体系的重要成员。因此本研究检测了各组小鼠小肠组织中的SOD、MDA、GSH含量。IR组相较于Control 组，小鼠血清中SOD、GSH 含量下降，MDA含量升高。而与IR组比较，Mar1处理组SOD、GSH升高，MDA降低。提示Mar1可有效抑制小肠缺血再灌注过程中脂质过氧化反应，提高小肠组织抗氧化应激能力。

焦亡是一种重要的自然免疫反应，可特异性拮抗感染和危险信号，激活先天免疫诱导免疫吞噬[31]，在病菌先天免疫防御和致命性内毒素血症中有着重要的作用[32]。经典的焦亡途径由抗原刺激模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）介导组装炎症小体，通过活化Caspase1裂解焦亡“刽子手”—GSDMD，产生具有细胞膜成孔能力的GSDMDN，致使细胞产生焦亡。而非经典途径可直接由LPS 活化人类Caspase4/5 或者小鼠Caspase11 裂解GSDMD产生细胞焦亡[5]。据报道，LPS诱导的非经典途径Caspase11 的活化，也会触发炎症小体NLRP3和ASC依赖的Caspase-1的激活[32]，形成“炎症瀑布”。既往实验证实，肠道IR的发展与细胞焦亡有着密切的联系[33]。在肠道屏障受损、肠道菌群移位以及内毒素血症的背景下，减少由LPS诱导的组织焦亡显得愈加重要。为了明确Mar1是否通过抑制肠道细胞焦亡保护小肠缺血再灌注损伤，本研究检测了Sirt1、NF-κB的表达与焦亡通路相关蛋白Caspase11、GSDMD的关系。结果显示，IR组相较于Control组Sirt1表达降低，NF-κB与焦亡通路相关蛋白表达升高。而Mar1 处理组Sirt1 表达上升，NF-κB与焦亡通路相关蛋白表达下降。提示Mar1可能通过Sirt1抑制Caspase11活化，进而抑制细胞焦亡，减轻肠组织缺血再灌注损伤。

为了进一步验证推测，本研究使用了Sirt1抑制剂EX527，特异性抑制Sirt1 表达。结果显示，IR+EX527 组NF-κB 与焦亡相关通路蛋白表达增加，Mar1处理后没有明显降低组织焦亡相关蛋白水平。证明Mar1 能通过Sirt1 抑制NF- κB/Caspase11/GSDMD焦亡通路，改善小肠缺血再灌注损伤。NF-κB对于各种免疫细胞发育及促炎细胞因子和趋化因子转录均发挥着重要作用[34]。之前的研究已有报道，Sirt1激活可以减少炎症因子的表达，减轻肠道氧化应激，以维持肠道内稳态[8]，机制上可能通过抑制NF-κB通路抑制炎症反应[35]。最近的研究报道，Mar1 可以通过抑制SIRT1/PGC-1α/PPAR-γ 通路抑制 LPS 诱导的 RAW 264.7 巨噬细胞炎症反应[36]，与本实验结论一致。

综上所述，Mar1预处理可以通过Sirt1抑制Cas⁃pase11/GSDMD途径减少肠组织焦亡，保护肠上皮屏障功能，提高肠组织抗氧化能力，从而减少肠组织缺血再灌注损伤。作为一种有效的治疗手段，Mar1对肠缺血疾病的潜在作用机制有待进一步探索。

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（责任编辑：曾 玲）

基金项目：重庆市自然科学基金面上资助项目（编号：cstc2021jcyjmsxmX0266）。