单分子技术的i 基序DNA动态结构实验研究

顾江新， 侯锡苗

（西北农林科技大学a.资源环境学院；b.生命科学学院，陕西 杨凌 712100）

0 引言

生物大分子指生物体内的多糖、脂质、蛋白质和核酸等。生物大分子在生命过程中的功能与其结构的动态变化密切相关，“结构决定性质”是现代生命科学得以快速发展的思想基础［1］。以单个分子作为研究对象，对其行为（包括构象变化、相互作用和相互识别等）进行实时、动态检测以及在此基础上的操纵、调控等，有利于揭示生物大分子的作用机制［2-4］。生物大分子的空间尺度在几十纳米量级，无法使用传统光学显微镜检测其结构变化。单分子荧光显微镜利用荧光分子能量共振转移进行相对位置的测量，具有纳米级别的超高分辨率，可用于单分子研究［5-7］。

在人类基因组DNA的高级结构中，通过半质子化的胞嘧啶配对构成非典型四链体结构i 基序（intercalated motif，i-motif）受到广泛关注。i-motif结构多存在于端粒及癌基因的启动子区，对调节癌基因的表达具有重要作用，已经成为抗癌治疗的新靶点［8-9］，i-motif结构的多变性和敏感的pH 依赖性使其在纳米机械及药物递送系统中获得应用［10-11］，环境pH 值的变化对i-motif结构产生直接影响，但对于i-motif 的折叠状态及性质仍缺乏系统的研究。本文实验通过在含有i-motif结构的DNA 底物上标记荧光对，记录不同pH值条件下的荧光能量转移效率，旨在阐明i-motif结构的动态变化过程和作用机制。

1 实验原理与方法

1.1 实验原理

图1 所示为单分子荧光共振能量转移的基本原理。如图所示，在某一双链DNA分子的两端进行荧光标记时，供体（D）荧光分子受激发所发出的荧光通过诱导偶极，会部分被受体（A）荧光分子吸收，然后受体荧光分子被点亮的过程。在该过程中，能量转移效率与荧光分子间的距离有关，其关系表达式［12］为

图1 单分子荧光共振能量转移理论示意图

式中：FRET为荧光能量转移效率；R和R0分别为2 个荧光分子的相对位置和特征距离，与光谱重叠面积、溶液离子环境等有关。通过测量反应过程中能量转移效率即可获得相对位置变化。

1.2 实验设备

图2所示为单分子荧光显微镜的光路及实物图。主要硬件为IX71 倒置显微镜（OLYPUS公司），所有器件均固定于其上；LC-605A固态激光器（Cohrent公司）产生特定波长的激光，经过光纤输入显微镜光学系统；通过电动千分尺调节激光的入射角度，使激光经过二色镜反射在P-545 载物台（Physik Instrumente公司）上固定的反应槽内部下表面形成全内反射；荧光分子受激发的荧光，经反射系统进入分色箱中，通过DU-897U-CS0-＃BV 电荷耦合器件（Andor Technology 公司）转换成数字信号输出。

图2 单分子荧光显微镜

实验通过MetaMorph图像工作站对硬件进行管理和控制，可选择激光波长和强度，利用AutoShutter 功能实现录像和激光的同步打开、关闭及自动对焦，最终输出的数字信号也由图像工作站记录并进行可视化处理。

1.3 实验材料

实验使用PB 缓冲体系。分别将磷酸二氢钾与磷酸氢二钾试剂溶解于双蒸水（1 mol／L），调至不同的pH值（5.8，6.2，6.6，7.0，7.4，8.0），配制出PB 反应溶液（50 mmol／L），加入防止荧光淬灭或发生光漂白的除氧体系，除氧体系由奎诺二甲基丙烯酸酯（4 mmol／L）、D-葡萄糖（0.8%）、葡萄糖氧化酶（1 mg／mL）和过氧化氢酶（0.4 mg／mL）组成。

实验底物由一条含有i-motif 结构的bcl2 基因序列与一条短双链DNA 退火而成，短DNA 链的作用是将底物固定在反应槽表面，如图3 所示。以单链DNA为对照。底物的修饰选用花青素荧光分子Cy3 和Cy5，该荧光对具有荧光效率高、发光稳定和分子量小等优势。将Cy3 连接至bcl2 序列的3'末端和单链DNA的末端，将Cy5 连接至短DNA 链的第6 个核苷酸处。此时，bcl2 序列和单链DNA分别被夹在2 个荧光之间（见图3），其结构的轻微变化都将改变2 个荧光之间的距离，进而影响荧光能量转移效率。

图3 实验底物及荧光修饰示意图

1.4 实验方法

实验过程要求室温恒定为20 ℃，单分子荧光显微镜必须提前预热至稳定状态，待电荷耦合器件降温至-80 ℃后才能正常工作。将注射器和移液枪头连接至反应槽，抽入反应缓冲液对反应槽进行3 次润洗。将底物稀释至50 pmol／L，注入反应槽内孵育10 min，底物即被固定于反应槽表面。用反应缓冲液冲走游离的底物，抽入含有除氧体系的成像缓冲液。向物镜表面滴加香柏油，将反应槽固定于载物台上。选择532 nm的激发光，挑选连接均匀且密度适中的视野，每个检测视野内找到500 ～600 个荧光信号，于1 min 内录取600 帧数据。对获取的数据进行筛选、分析和可视化处理。

2 实验结果与分析

2.1 pH值的影响

图4 所示为bcl2 基因序列和单链DNA在不同pH值条件下的荧光传递效率分布（图中分子数占比表示具有该FRET值的分子数与全部分子数的比例）。由图可知，当pH ＝6.2 时，bcl2 序列的荧光能量转移效率分布在0.95 左右显示1 个单峰，说明i-motif结构处于均匀、完全的折叠状态；随着pH值增加至8.0，荧光能量转移效率分布逐步向左移动，效率峰最终停留在0.40左右，表明i-motif 结构在高pH 值条件下的部分去折叠过程。单链DNA 在不同pH 值条件下的荧光能量转移效率分布均没有发生移动，效率峰稳定在0.27 左右［见图4（b）］，说明其结构呈现无规则卷曲状态。

图4 在不同pH值下反应底物的荧光传递效率分布

2.2 折叠状态

图5所示为bcl2 基因序列的动态荧光传递效率曲线及形成的C-发夹结构。由图可知，bcl2 序列的荧光能量转移效率动态分布曲线拟合出6 个峰，表明imotif结构具有6 个折叠状态。除了完全折叠的i-motif（最高效率）和无规则卷曲状态（最低效率）之外，至少还存在4 个中间状态，分别对应于荧光能量转移效率峰在0.8、0.7、0.5 和0.4 处。这些是由部分C：C +碱基配对形成C-发夹结构，包括平行发夹、反平行发夹和不完全配对发夹等（见图5）。由此可见，当pH 值发生改变时，i-motif 可以在多种折叠状态间进行自发地变构与转换，推测各折叠状态可发挥不同的生理功能。

图5 反应底物荧光传递效率动态分布曲线及形成的C-发夹结构示意图

3 结语

本文实验利用单分子荧光共振能量转移技术，对含有i-motif结构的基因序列bcl2 在不同pH值条件下的动态变化进行检测。结果表明：i-motif 结构具有6个折叠状态，在低pH值条件下处于均匀、完全的折叠状态，而在高pH 值条件下部分去折叠；总之，i-motif结构随pH值的改变可在多种折叠状态间进行自发地变构与转换，为进一步探索i-motif 的生理功能提供参考。