肉汤中微纳米颗粒的表征和形成机理的研究进展

袁波，杨勤子，白春清，陈丽丽，江勇，赵利*

1.国家淡水鱼加工技术研发分中心（南昌 330013）；2.江西科技师范大学生命科学学院（南昌 330013）

肉汤是一种主要由鱼、肉、海鲜等汤料，添加一定量香料和调味剂组成的食物，是世界上最受欢迎的食物之一，在全球范围内普遍食用，如意大利的海鲜汤、美式蛤蜊汤、越南海龙皇汤。中国也有“宁可食无肉，不可食无汤”的饮食文化，美容喝猪蹄汤，催奶喝鲫鱼汤，感冒喝老鸡汤。在中国人的观念里，食品原料的精华都浓缩在汤里，饭前喝上一碗汤就是最健康科学的饮食结构。研究发现，铜和镁在沸腾过程中从牛肝迁移到汤，从而提供矿物质的生物可及性[1]。汤的煮沸过程可以诱导非血红素、铁和血红素色素从牛肉和羊肉转移到汤中[2]。肉汤以水为介质，肉中的蛋白质、脂质及一些水溶性物质在加热条件下溶解入汤中，辅以佐料，可使肉汤营养丰富，口感鲜美。肉汤中的非挥发性物质包括蛋白质、还原糖、氨基酸、核苷酸、多肽、无机盐等，挥发性物质主要为脂肪醛、脂肪酸、醇和酯[3]。肉汤有利于营养物质在人体的运输，可以促进消化，具有补充能量、滋补健康等作用。

根据产生的途径，食品中纳米颗粒可分为两类。一类是通过纳米技术，人为编程食品中的原子、分子，形成纳米级粒子，如纳米级改性淀粉[4]、纳米颗粒添加剂[5]等，可以改善食物的风味，使食品具有稳定性好、保质期高等优点。纳米技术被广泛应用于食品工业的包装、检测、保鲜、运输等各个环节，进一步推进食品科技的创新性发展。另一类则是食品中天然存在或加工过程中自然产生的伴生物，即微纳米颗粒（micro/nano particles，MNPs）。如牛奶中的酪蛋白胶粒[6]、面包和烤肉等食物在高温加工过程中产生的碳纳米粒子[7]、鱼头汤熬煮过程中产生的微纳米颗粒[8]，它们是食物中的两亲性化合物通过共价和非共价作用产生的大量自组装颗粒[9]，具有惊人的生物相容性、功能性和稳定性，和化学合成的纳米材料相比毒性较小，是制备有机纳米组件的重要建筑材料[10]。许多肉汤或其提取物成为饮食补充剂或药物等工业产品，其中一些汤的生物学功能和临床效果在药理和临床研究中也得到科学评价[11]。

有关肉汤中MNPs的研究主要集中于化学组分、分离表征及生理功能等方向。主要从MNPs的组成成分出发，对肉汤中MNPs的表征方法、形成机理及其影响因素的研究进行概括总结。

1 微纳米颗粒的表征方法

食品体系中MNPs因超小尺寸和物理化学特性，使其具有独特的特征和巨大的应用潜力。然而，关于MNPs在食品生产中的应用及其安全方面的评估还知之甚少。因此，获得MNPs数量和结构类型的可靠信息变得尤为重要。MNPs的表征包括尺寸、形状、分布和聚集状态、表面积及化学组成等内容。最普遍用到的表征技术包括以下几类。

1.1 光散射技术

光散射是指颗粒将照射到其上的激光向周围散射，颗粒的大小、多少决定了散射光各个特性参数的变化，因此可以通过测量光强、偏振度、衰减比等激光参数的空间分布获得待测颗粒的信息[12]。如丁达尔效应被用于区分胶体和溶液，在暗室观察下，激光照射肉汤可见明显的通道现象[11]。光散射技术主要分为静态光散射技术（static light scattering，SLS）和动态光散射技术（dynamic light scattering，DLS）。SLS是测定固定角度的散射光强，具有浓度依赖性和角度依赖性[13]。可以测定纳米颗粒的粒径大小和形状，不适合测量直径在亚微米级及以下的颗粒，因为会发生多重衍射，而使测量结果的准确性明显降低。肉汤中微纳米颗粒的测量主要使用动态光散射法。DLS是通过测量纳米颗粒做布朗运动引起的激光强度波动实现粒度测量的，可将粒子直径的检测范围延伸到纳米或亚纳米数量级[10]。DLS被用于表征食品模型[14]、牛乳中的粒径分布[15]及肉汤中纳米颗粒的平均水合粒径和Zeta电位[16]，与显微镜技术结合可获知MNPs的形态和表面结构，与纯度色谱（size exclusion chromatography，SEC）结合可分离食品中微纳米颗粒[17]。

1.2 显微镜技术

食品体系中微纳米颗粒的粒径、外观、理化性质和组学分布等分析均与显微镜技术密不可分，主要采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）和原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）。

TEM[18]是一种利用电子束穿透样品，形成散射电子与透过电子，聚焦在荧光屏上的纳米级成像技术，分辨率约0.2 nm。TEM被广泛用于检测液体食品中微纳米颗粒、包埋功能性成分的蛋白质/多糖纳米颗粒和血清白蛋白纳米颗粒等[19-20]各种纳米粒子的成像和表征。Gao等[21]用TEM观察到猪骨汤中微纳米颗粒呈现均匀的球形外观。Ma等[22]利用TEM观察金枪鱼头汤在熬煮过程中的微纳米颗粒，为MNPs的壳核胶体球形结构提供一定证据。SEM则是通过电子束在样品表面扫描，激发样品的二次电子，经探头检测器接收并在荧光屏上成像，形成暗场像。TEM分辨率较高，但仅适用于足够薄的样品。而SEM依赖于表面处理而非投射，因此能对较大样品成像，产生样品表面的高分辨三维图像。SEM多用于观察蛋白质、多糖和脂质体纳米颗粒的形状及表面结构。Rubilar等[23]通过SEM可以明显观察到亚麻籽油微胶囊的颗粒表面形态及大小分布。

激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）在传统光学显微镜基础上，利用激光作为光源，采用共拖聚焦原理和装置，扫描样品并收集信号，通过计算机处理，还原样品二维、三维图像[24]。它具有灵敏度高、多色荧光成像等优点，可以直观观察到MNPs中各组分的位置及相互作用。苏红[25]利用CLSM观察鳙鱼和三文鱼头汤中的MNPs结构时发现，汤中脂肪自组装成球形颗粒，而磷脂、蛋白质和糖则分布在脂肪球的外围，各组分共同组成稳定的颗粒。翟争妍等[26]采用CLSM对鱼头汤中磷脂、蛋白质和糖基化分子（糖脂和糖蛋白）进行染色，结果发现加盐后Cl-进入MNPs与甘油三酯结合，Na+则与MNPs外围的电负性多糖结合。陈旭[27]利用CLSM观察到大豆蛋白与酶的结合稳定程度。

原子力显微镜（AFM）是依靠悬臂下纳米大小的针尖接近样品表面时，检测针尖与样品间的作用力（原子力），观察样品形态的装置[28]。AFM由于其检测精度高、对样品无特殊处理要求等，被广泛使用于食品科学研究[29]。石燕[30]用AFM观察酥油微胶囊的颗粒形貌及其表面粗糙度。Guo等[31]采用AFM研究玉米醇溶蛋白精细的微观结构。

其他表征方法也被用于MNPs的研究，如：Lin等[32]利用光学显微镜观察到鱼汤中微纳米颗粒的形成趋势，随着熬煮时间的延长，汤中MNPs数量不断增加，熬煮150 min时，MNPs数量最多、结构最稳定；Yao等[33]利用红外透射成像在空间上揭示肉汤中MNPs各组分的分布和化学变化规律，证实MNPs同时含有甘油三酯和与其空间合并的糖缀合物；金绍娣等[34]采用傅里叶变换红外光谱测试制备的纳米颗粒机构，结果发现阿拉伯胶与蛋白质形成新的氢键络合。

2 微纳米颗粒的形成机理

肉汤在炖煮时，发生一系列化学反应和物理变化，迁移到溶液中的两性化合物成分（如蛋白质、脂肪酸和多糖），在分子间次级键作用下发生自组装形成胶体颗粒，即微纳米颗粒[4]。Yao等[33]利用丁达尔效应发现激光照射肉汤可以观察到明显的通道现象，证明肉汤是一个复杂的胶体体系，即在炖煮过程中形成胶体颗粒；肉汤在熬煮过程中通过脂质氧化、美拉德反应等积累甘油三酯和糖缀合物，肉汤中MNPs的持续形成逐渐促进分子间相互作用，驱动下游离物质的空间合并和自组装，从而使主要的营养物质和风味化合物进一步在MNPs中积累。Ke等[10]发现猪骨汤经过文火熬制后，每毫升汤中约含有10亿个粒径约230 nm的颗粒。Qian等[35]在金枪鱼头汤熬煮过程中发现MNPs，经过抗氧化研究发现，不同粒径大小的球形颗粒具有一定抗氧化作用。Wang等[36]研究发现，猪骨汤中的食物胶体颗粒可直接与腹膜巨噬细胞相互作用，腹膜巨噬细胞可以取代口腔巨噬细胞，食物摄入导致食物MNPs与免疫细胞直接接触，这可能意味着一种食物-身体相互作用的新模式。与人工编程的纳米粒子相比，肉汤中自发产生的MNPs的未知性、复杂性和不可控性更强。MNPs与人体生理效应的研究需要系统地探索MNPs的分子特征、形成机理，包括分子大小、电荷分布、链支化和亲水疏水平衡等因素。肉汤中MNPs的形成原理和机制主要是从分子间的相互作用来解释的，包括蛋白质间的相互作用、蛋白质与其他物质间的相互作用。

2.1 蛋白质间的相互作用

加工过程中，原料中的蛋白质不断迁移进溶液，维持蛋白质结构的作用力在热的作用下被破坏，空间结构发生去折叠，蛋白质变性。蛋白质结构展开，使蛋白质分子表面的亲水基团相对减少，埋藏在内部的疏水基团和半胱氨酸残基暴露出来，导致疏水作用力大于亲水作用力。加上高温导致蛋白质分子运动加剧，蛋白质分子间相互碰撞、聚合的概率增大，从而引起蛋白质聚集[37-38]。蛋白质聚集体具有特殊的尺寸效应和表面性质，通常拥有着与天然蛋白质不同的表面活性，其在油-水界面处形成的网络结构和表现的流变性质均不相同，对乳液的稳定性和脂肪的消化产生不同的影响，界面活性、黏弹性、乳化特性等均可能优于天然蛋白[39-40]。这些聚集物由于结合了静电和空间稳定机制，是一种非常有效的胶体稳定剂，能够保护液体防止絮凝[41]，为食品工业化提供一些参考。苏红[25]研究发现，随着熬煮时间的延长，汤中蛋白质含量持续增加，微纳米颗粒也增多并趋于稳定，证明蛋白质聚集现象。尤娟等[42]在研究中观察到鲢肌球蛋白的热聚集现象。

2.2 蛋白质与其他物质间的相互作用

蛋白质与糖类之间的相互作用是通过糖基化实现的，糖链通过共价键与蛋白质肽链相连接[43]。美拉德反应机理的非酶糖基化是食品中蛋白质糖基化的主要方法，仅通过加热就能促使蛋白质与糖发生共价结合，且产生的糖基化产物具有溶解度高、稳定性高的优点[44]。汪胡芳等[45]利用糖基化成功生产出甜菊苷、橙皮苷及芦丁苷等新型药物载体。

蛋白质与脂质间的相互作用主要是二者形成乳化体系[46-47]，β-乳球蛋白和脂肪酸主要是通过疏水作用相结合，位于β-乳球蛋白内部的疏水孔穴是脂肪酸最主要的结合位点[48]。熬煮过程中，蛋白质经热变性后与脂肪作用的结合位点增多，脂肪与蛋白质或小肽发生乳化作用。禄彦科[49]研究发现猪骨汤中MNPs颗粒的主要影响因素是汤中脂肪的溶出量，脂肪的迁移与MNPs数量的增加呈现正相关。汪慧勤[50]对河蚬汤和猪骨汤的研究中发现，2种汤的微纳米颗粒均主要由蛋白质、多糖和脂质组成，且河蚬汤MNPs能显著改善非酒精性脂肪肝，猪骨汤MNPs在胞内外均有明显的抗氧化活性，二者均可以改善巨噬细胞的氧化应激状态。

β-乳球蛋白还被报道可以和脂溶性维生素、脂肪酮和芳香族化合物等反应生成蛋白质复合物[51-52]。禄彦科[49]研究发现，猪骨汤MNPs中包含蛋白质、多糖、核苷酸、金属离子等营养物质都结合组装于颗粒中。

2.3 影响微纳米颗粒形态及性质的相关因素

肉汤中营养和风味物质的迁移，是MNPs原料的主要来源途径。汤中物质的迁移主要有2个原因：一是食物在热和其他因素作用下组织完整性被破坏，导致组织中各物质迁移到汤中；二是在浓度差的作用下，食物中的营养物质从食物表层向水中迁移，当内外层营养物质形成浓度差后，内层营养物质向表层迁移，从表层向汤中迁移[9]。Qi等[53]研究发现鸡汤炖煮过程中游离氨基酸含量显著增加，这是由于烹饪过程诱导游离氨基酸从鸡肉组织迁移到汤中。熬煮工艺对羊肉产品的脂肪酸组成也有较大规模的影响，Campo等[54]发现炖菜可以增加羊肉中n-6多不饱和脂肪酸的百分比。Zhang等[55]关于鲫鱼汤的研究发现，温度对鲫鱼汤中蛋白质的水解和溶解度起着至关重要的作用，随着温度的升高，汤中的总肽和氨基酸的含量随之上升。曾清清等[56]研究骨块大小、料液比和不同熬煮条件对鸡骨高汤品质及风味的影响，结果表明料液比对高汤品质有显著影响，适当的料液比不仅能溶出较多营养物质，风味也较好。

料液质量比、熬煮温度、熬煮时间、配料的添加等加工工艺条件的不同，决定汤中各物质成分的浓度和比例，进而影响汤中MNPs的形态结构和物理特性。钱雪丽[57]的研究发现，随着熬煮时间的延长，鱼汤中的脂质、水溶性蛋白、总糖、维生素E等物质含量呈现先增加后减少的趋势，在150 min时达到最佳；汤中MNPs也随时间不断产出，数目增多，粒径增大，150 min时MNPs结构最稳定；相比较清汤，油煎后熬煮的白汤中MNPs表面较为粗糙。潘馨怡[58]研究发现，加盐浓度的改变与汤中各营养物质的迁移显著相关；随着加盐浓度的增加，汤中微纳米颗粒的变化趋势呈现尺寸先减小后增大，数量先增多后减少，稳定性先增强后削弱。主要原因可能是食盐促进原料中盐溶性球蛋白和阴离子多糖的迁移，促使大量表面带羟基的蛋白质及带负电的阴离子多糖与MNPs表面的磷脂结合，共同构成MNPs的膜结构，从而导致MNPs之间的静电斥力的增大，抑制MNPs与MNPs之间的聚集，导致MNPs的粒径较小，数量较多，且各组分之间的分布也很稳定。而盐浓度过高时，MNPs膜结构所带的负电荷被过多的Na+中和，从而导致MNPs的表面静电斥力降低，MNPs能够彼此相互“吸引”，形成尺寸较大的聚集体。苏丽等[59]研究发现，食盐的添加时机对乌鳢鱼头汤中MNPs的形态有显著影响，熬煮90 min时加盐，汤中形成很多大颗粒，60 min组的MNPs呈现稳定的双层球形小颗粒。

3 结语与展望

食品体系纳米颗粒的研究虽然取得一些进展，但仍有很多问题亟待解决。微纳米颗粒因其特殊的物理、化学性质，其营养成分的分布、相互作用、风味等表现出与原料不同的特性，但微纳米颗粒的形成机制、化学定位、与原料中蛋白质/多糖等物质在人体中的相互作用还需深入研究。从食品安全的角度来看，纳米食品仍面临一些挑战，虽然微纳米颗粒可为食品纳米加工提供一些技术参考，有助于改善食品的感官特性，并可能发挥健康益处，但对微纳米颗粒的安全方面还知之甚少。微纳米颗粒被证实对巨噬细胞、胃肠道屏障等具有积极的生理功效影响，但其与机体的相互作用机制和途径尚不明确，成为后续有待研究的内容。