早期2型糖尿病肾病与醛糖还原酶基因甲基化水平的临床研究

包利文，尹丽明，王少波

【摘要】目的 探讨醛糖还原酶（AKR1B1）基因甲基化水平和早期2型糖尿病（T2DM）肾病蛋白尿之间的联系。方法 选取2020年5月至2022年4月期间东莞市厚街医院收治的40例T2DM合并蛋白尿阳性患者作为糖尿病肾病（DN）组，选择同时期39例诊断T2DM且尿蛋白阴性志愿者作为糖尿病（DM）组，进行前瞻性研究。比较两组患者的临床资料，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）与AKR1B1基因甲基化水平，并分析AKR1B1基因甲基化水平与临床资料中差异有统计学意义的指标的相关性。结果 DN组患者糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（2 h PG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）及尿微量白蛋白与肌酐比值（UACR）水平均高于DM组，肾小球滤过率（eGFR）低于DM组（均P<0.05）；DN组AKR1B1甲基化水平低于DM组（P<0.05），两组MTHFR甲基化水平比较，差异无统计学差异（P>0.05）；Pearson相关分析结果表明，AKR1B1甲基化水平与FBG、2 h PG、HbA1c、Scr、BUN、UACR呈负相关，而与eGFR水平呈正相关（均P<0.05）。结论 AKR1B1基因DNA甲基化可能参与了DN的发生、发展过程，且AKR1B1甲基化水平与FBG、2 h PG、HbA1c、Scr、BUN、UACR呈负相关，与eGFR水平呈正相关，可预估患者T2DM患者病情。

【关键词】醛糖还原酶 ; 甲基化 ; 糖尿病肾病 ; 亚甲基四氢叶酸还原酶

【中图分类号】R587.1【文献标识码】A【文章编号】2096-3718.2023.20.0087.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2023.20.029

随着我国经济和社会的发展，人民饮食习惯的改变，糖尿病（diabetes mellitus， DM）发病率日益升高，已成为威胁人类健康的重要因素[1]。 DM可产生多种并发症，糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）是其最明显的微血管并发症，DN目前是除肾小球肾炎之外，导致终末期肾病（end stage renal disease， ESRD）的第二大病因，对DM患者的生活质量造成极大的影响， DN的发生发展受遗传和环境因素的影响，而环境因素会改变表观遗传状态，因此表观遗传机制可能在DN的发病机制中起关键作用[2]。近年来，表观遗传修饰的相关研究越来越受到重视， DM患者的高血糖代谢状态可能存在相关的“代谢记忆效应”，长期的高血糖状态，即使患者血糖水平恢复正常，仍可出现DM的相关并发症。最新研究提示，“代谢记忆”与靶细胞的表观遗传改变的关系密切[3]。表观遗传修饰是指在不改变DNA序列的情况下影响基因的表达和功能。其中， DNA甲基化是研究最广泛的表观遗传标记。醛糖还原酶（AKR1B1）基因编码一种催化葡萄糖还原为山梨醇的酶，而山梨醇所导致的氧化应激是糖尿病慢性并发症的主要途径之一[4]。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是高同型半胱氨酸（Hcy）代谢过程中重要的酶，通过甲基化Hcy转化为甲硫氨酸，从而降低血浆Hcy水平，而Hcy具有血管毒性作用，可通过氧化应激损伤血管内皮细胞、刺激血管平滑肌细胞增生等多种途径，导致肾小球滤过率增加，从而参与DN病变进程[5]。本研究旨在探讨AKR1B1和MTHFR甲基化水平与早期2型糖尿病（diabetes mellitus type 2， T2DM）肾病的关系，为患者病情预估提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年5月至2022年4月期间东莞市厚街医院收治的40例T2DM合并蛋白尿阳性（尿蛋白含量≥ 30 mg/24 h或20 μg/min [7]）患者作为DN组，选择同时期39例诊断T2DM且尿蛋白阴性（尿蛋白含量<30 mg/24 h或20 μg/min）的研究对象作为DM组，进行前瞻性研究。纳入标准：①所有患者均符合《中国2型糖尿病防治指南（2017年版）》 [6]中T2DM的诊断及分型标准；②DN组患者同时符合《糖尿病肾脏病诊治专家共识》 [7]中的DN的诊断标准，尿微量白蛋白与肌酐比值（UACR>30 μg/mg）；③近期未服用肾毒性药物；无精神疾病或意识障碍。排除标准：①合并慢性肾炎、尿路感染等疾病；②半年内有恶性高血压、心脑血管意外等危重病史；③伴凝血功能障碍。本研究获得东莞市厚街医院医学伦理委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料统计 收集所有患者的一般资料，包括性别、年龄、BMI、病程。嘱其禁食8 h，次日清晨在患者空腹状态和餐后2 h各抽取静脉血3 mL，同时收集晨尿3 mL，均以3 500 r/min的离心速率离心10 min后取得上清液待测。利用全自动生化分析仪[贝克曼库尔特（美国）股份有限公司，型号：AU5800]测定血清糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（2 h PG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBiL）、直接胆红素（DBiL）、血红蛋白（Hb）、总胆固醇（CHOL）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、三酰甘油（TG）水平，采用全自动生化分析仪检测尿微量白蛋白与尿肌酐，并计算肾小球滤过率（eGFR）、UACR，采用电子血压计[松下电气机器（北京）有限公司，京械注准20162070530，型号：EW3106]检测患者收缩压（SBP）与舒张压（DBP）。另取患者空腹靜脉血3 mL，取一部分抗凝后离心（离心条件同上），取血浆待检。采用全自动凝血分析仪（Instrumentation Laboratory Co.，型号：ACL TOP 700）检测血浆凝血酶原时间（PT），采用酶联免疫吸附法检测血浆纤维蛋白原（FiB）。利用全自动血液分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：6800PLUS）检测白细胞计数（WBC）。

1.2.2 MTHFR、AKR1B1基因甲基化水平检测 通过基于下一代测序的亚硫酸氢盐测序（BSP）评估基因特异性DNA甲基化。首先针对目标区域或位点，完成重亚硫酸盐修饰的基因组DNA序列PCR（BS-PCR）引物设计和合成，使用在线MethPrimer软件设计BSP引物。使用ZYMO EZ DNA Methylation-GoldTM Kit转换1 μg基因组DNA，使用KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix PCR試剂盒将二十分之一的洗脱产物用作35个循环的聚合酶链式反应（PCR）扩增模板。对于每个样本，将多个基因的BSP产物平均汇集，5'-磷酸化，3'-dA尾，并使用T4 DNA连接酶（NEB）连接到条形码适配器。在Illumina平台上对所有样本的条形码库进行测序[5]。C位点的甲基化水平=支持甲基化的reads数/（支持甲基化的reads数+支持非甲基化的reads数），引物由上海捷瑞公司设计合成，引物序列：

MTHFR

上游5'-TAGATTTAGGTACGTGAAGTAGGGTAGAC-3'，

下游5'-GAAAAACTAATAAAAAACCGACGAA-3'；

AKR1B1

上游5'-GGGTTATTTAAAGGTATGTGTT-3'，

下游5'-AACACCATTATTAAACAAAAA-3'；

U6（内参）

上游5'-TTTAGGTATGTGAAGTAGGGTAGATGT-3'，

下游5'-CAAAAAACTAATAAAAAAAACCAACAAA-3'。

1.3 观察指标 ①比较两组患者的一般资料。②比较两组患者MTHFR与AKR1B1基因甲基化水平。③分析DN组患者AKR1B1基因甲基化水平与一般资料中差异有统计学意义的指标的相关性。

1.4 统计学方法 应用SPSS 23.0统计学软件分析数据，计数资料包含临床疗效，以[例（%）]表示，组间比较采用χ2检验；符合正态分布的计量资料采用（ x ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布的计量资料使用中位数（四分位数间距） [M（P25，P75）]进行描述，组间比较采用Mann-Whitney U检验，采用Pearson法进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较 DN组患者HbA1c水平、FBG、2 h PG、Scr、BUN及UACR水平均高于DM组，eGFR低于DM组，差异均有统计学意义（均P<0.05）；两组患者性别、年龄、BMI、病程、SBP、DBP、ALT、AST、TBiL、DBiL、PT、WBC、Hb、FiB、CHOL、HDL、LDL、TG比较，差异均无统计学意义（均P>0.05），见表1。

2.2 两组患者基因AKR1B1和MTHFR甲基化水平比较 DN组AKR1B1甲基化水平低于DM组，差异有统计学意义（P<0.05），DN组MTHFR甲基化水平高于DM组，但差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3 DN组患者AKR1B1甲基化水平相关性分析 Pearson相关分析结果表明，AKR1B1甲基化水平与FBG、2 h PG、HbA1c、Scr、BUN、UACR呈负相关，而与eGFR水平呈正相关，差异均有统计学意义（均P<0.05），见表3。

3 讨论

DN是T2DM的一种严重的微血管并发症，是导致ESRD最常见的原因之一，预防或减缓DN的进展能带来相当的社会经济效益，且DN可以通过早期指标检测来预防或延缓病情进展，因此，寻找早期诊断和预后的生物标志物是DN临床研究的重点问题。研究表明，表观遗传对于DN的发生发展影响明显，而表观遗传的改变易受到较多因素的影响，如长期高血糖所导致的基因甲基化等[8]。DNA甲基化改变是表观遗传的主要表现方式，已被认为参与了DN的发病机制，通过动物实验已证实DNA甲基化抑制剂对DN有益[9]。因此，早期预测DN高风险患者从而预防和延迟患者病情显得非常重要，本研究搜索Scopus，Pubmed，CochraneCentral等数据库选择了在糖尿病肾病中具有重要作用的基因（AKR1B1、MTHFR）进行研究，测定早期DN患者外周血中靶基因启动子区甲基化水平，探讨目标基因的DNA甲基化水平与蛋白尿及eGFR的关系。

本研究结果显示，DN组患者HbA1c、FBG和2 h PG水平均高于DM组，提示DN患者血糖控制情况较差，其中FBG和2 h PG是常用的血糖检测指标，而HbA1c是红细胞血红蛋白的β链N端缬氨酸与葡萄糖非酶化结合的产物，占血红蛋白总量的60%～70%，红细胞寿命是120 d，所以HbA1c能很好地反映2～3个月的血糖水平，且不受饮食、运动、血糖忽高忽低影响，因此检测HbA1c更能评价患者的血糖情况，已经成为评价糖尿病管理的重要途径[10]。DN组患者Scr、BUN及UACR水平均高于DM组，eGFR低于DM组，均提示DN患者有明显的肾功能损害。

NAZIR等[11]关于DN遗传变异的荟萃分析发现，有11个基因变异与DN显著相关，且证实炎症与DN的发生进展有很强的相关性。本研究表明，AKR1B1基因的甲基化水平在DN患者中低于DM患者，而DN组MTHFR甲基化水平高于DM组，但差异无统计学意义。刘恺远等[12]对于DN的研究显示，AKR1B1基因DNA甲基化与糖尿病肾病的发生、发展有关，AKR1B1基因DNA甲基化水平越低，血糖及尿蛋白水平越高。而MTHFR基因的甲基化水平与DN无关，这可能与MTHFR通过基因突变而不是甲基化影响血浆Hcy浓度，从而损伤血管，最终促进DN病变发生有关[13]。

此外，本研究结果显示，AKR1B1甲基化水平与FBG、2 h PG、HbA1c、Scr、BUN、UACR呈负相关，而与eGFR水平呈正相关，提示在DN患者中AKR1B1基因DNA的甲基化水平越低，血糖水平越高，肾功能损伤越严重，AKR1B1甲基化水平可能是一种新的预测DN生物标志物和新的分子靶点，可替代早期的DN分子预测靶点，这与ALDEMIR等[14]的研究结果相同。推测这一结果可能与AKR1B1基因主要功能是编码AKR1B1有关，AKR1B1是多元醇通路的关键限速酶，能导致山梨醇堆积，从而增加氧化应激，使机体内细胞呈现高渗状态，进而出现细胞水肿、缺氧等，最终导致肾脏、眼底及周围神经的损害[15]。AKR1B1基因DNA的甲基化水平越低，提示AKR1B1越多，肾脏、眼底及周围神经的损害现象越明显。有研究表明，T2DM患者体内长期高糖环境致使DNA甲基化状态发生改变，甲基化水平降低，激活AKR1B1基因，导致肾功能组织病变，进而致使DN的发生[16]。

综上，AKR1B1基因DNA甲基化可能参与了DN的发生、发展过程，可作为预测DN的潜在生物标志物，且AKR1B1甲基化水平与FBG、2 h PG、HbA1c、Scr、BUN、UACR呈负相关，与eGFR水平呈正相关。但本研究样本量较少，后续可以进一步进行大样本甲基化研究，探索早期预测及治疗DN高风险患者的新途径。

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