类器官在肺部疾病研究中的运用

李彦军,刘杨青,章培军,王 健,王宇星,张年萍

(1.大同大学医学院免疫学研究所,山西 大同 037009;2.山东大学基础医学院医学遗传学系,山东 济南 250013)

半个世纪前一项经典的实验证明了脊椎动物细胞的巨大自组织能力。即使在完全解离的条件下,细胞也可以重新聚集并重建器官的原始结构。近年来,这一神奇的特征被用于从组织或干细胞中重建部分器官甚至完整的器官。这种源自干细胞的3D培养物称为类器官。近来类器官技术的研究受到了科学界极大的青睐和期待。在哺乳动物中研究组织和器官生物学非常具有挑战性,特别是在人类中,由于样本的可及性和伦理问题,进展可能会受到阻碍。因此,类器官的出现进一步推动了疾病的发生发展、药物的筛选、基础研究以及再生医学等领域的探索。在过去十年中,类器官技术得到了显著发展。通过使用类器官技术培养得到的组织,在微米到毫米尺度上捕获了真实器官具备的一些细胞、解剖及功能标志。目前研究人员开始从其他领域(例如生物工程、化学、物理)中汲取灵感,以产生更适合实际应用且更具生理相关性的类器官。毫无疑问,这项技术为未来科学的发现创造了一个充满可能的世界,但目前这一技术仍存在一些弊端,类器官能否真正应对挑战仍是一个谜。

肺是人体呼吸系统中最重要的器官,承载着呼吸、免疫、肺循环等多种重要的功能。当肺部发生病变时,往往给患者带来很大的痛苦。探究肺部疾病的发生发展,对于临床上治疗肺部疾病有很大的帮助。但传统的研究方法存在无法克服的缺陷,阻碍了进一步探究肺的特性及相关疾病的深入认知。肺类器官技术作为一种新颖的方法问世,可进一步帮助人们更好地认清疾病,并寻求更加合适的治疗方法。肺类器官是目前最接近实际肺器官的模型,它很好地再现了肺的组织结构和细胞类型。近年来,肺类器官成为人类肺部疾病建模、药物筛选和个性化治疗等的有力工具。

1 肺类器官建立

肺由一个高度分支的管道系统组成,复杂的管道将空气带入肺泡,在肺泡进行气体交换。肺的近端和远端区域包含专门用于不同功能的上皮细胞:传导气道中的基底细胞、分泌细胞和纤毛细胞以及肺泡内的Ⅱ型和Ⅰ型细胞。肺类器官可以从胚胎干细胞(ESCs)、成体干细胞(ASCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)中建立[1]。目前建立的肺类器官模型主要有以下四种类型:①由ASCs形成的肺类器官;②由iPSCs和ESCs诱导分化得到的肺类器官;③基于AT2细胞培养的3D模型;④类器官衍生的气液界面(ALI)培养模型。

研究报道美国一个研究团队已经借助干细胞成功培养出迄今为止最接近人体肺结构的类器官,其拥有肺的所有细胞类型。为了概括肺特定的结构特征和有效的气体交换,可以通过使用配备气液界面的微流体装置来模拟肺结构和功能的复杂性。目前,微流体装置和肺类器官被移植在一起,以实现对类器官培养条件的精确控制。这种组合平台有助于进一步准确模拟肺部周围的复杂组织微环境[2]。微型装置可以有效地概括人体肺泡中微生物感染正常细胞的免疫反应,还可用于在机械刺激时通过高分辨率显微成像实时可视化这些细胞反应[3]。

肿瘤类器官是利用肿瘤组织培养出来的3D微模型,能很好地再现来源肿瘤组织的结构和功能[4]。肿瘤类器官可以弥合二维癌细胞系和基于动物的模型系统之间的差距。开发有效的癌症治疗方法需要与生理相关的体外模型来概括肿瘤的复杂特征。癌组织起源球体系统已应用于肺癌细胞的原代培养[5]。源自正常组织的类器官也可以用于诱导或者基因编辑模拟肺癌的发生发展。Park等[6]从人类支气管上皮细胞中建立了类器官,并利用基因编辑技术上调c-Myc、Bcl2等基因的表达,随后再接种到免疫缺陷的小鼠体内,结果显示小鼠肺部产生肿瘤。患者的活检或者切除的组织可以体外培养出模拟原始癌症组织的类器官[7]。微流体平台有助于建立类器官研究模型,通过控制氧浓度、机械因素和化学药物浓度来了解与肿瘤进展、转移和药物代谢相关的肿瘤微环境[8]。此外,微流体的培养系统可以培养出与原始肺肿瘤相似的肺肿瘤类器官,以此实现更准确的个性化药物测试并改善治疗策略[9-10]。与传统的2D细胞培养系比较,肿瘤类器官培养系最大的不同之处是增加了基质胶,其目的是为了模拟细胞外基质[11]。近年来肿瘤类器官的培养体系由特定的培养基与基质构成。该系统培养基中的主要成分为改良的DMEM/F12、Glu-MAX、HEPES、B27、EGF、HGF、N2、FGF7、FGF10、Primocin、Noggin、Wnt3A、Gastrin、R-spondin、青霉素/链霉素、烟酰胺、乙酰半胱氨酸、前列腺素E2、神经调节素1、SB202190(p38抑制剂)、A83-01(TGF-beta抑制剂)与Y27632(Rho 激酶抑制剂)等。

2 类器官在不同肺部疾病中的运用

2.1慢性阻塞性肺疾病(COPD):COPD是一种以持续气流受限为特征的肺部疾病。世界卫生组织《全球卫生估计》公布COPD是全球第三大死因,仅2019年造成323万人死亡。在我国慢性阻塞性肺疾病有着较高的发病率[12],疾病负担不可忽视。已经有研究表明,炎性反应机制、蛋白酶-抗蛋白酶失衡机制和氧化应激等机制共同作用,产生小气道和肺气肿两种重要病变,两种病变作用造成COPD特征性的持续性气流受限。肺上皮受损是COPD主要的病理生理因素,针对肺上皮的修复或再生药物的开发研究是COPD的治疗前景策略,已有研究报道WNT 信号通路可能是药物开发及研究的潜在药物靶点[13-14]。WNT信号通路在干细胞自我更新、组织稳态和许多器官的伤口修复中起着的重要作用[15-16]。Huang等[17]通过建立不同的精密切割肺片(PCLS)模型和肺类器官模型,阐明WNT-5A 和 WNT-5B 能够抑制成纤维细胞和上皮祖细胞共培养肺类器官的形成,其中WNT-5B对肺类器官肺泡上皮祖细胞的生长和分化的抑制更加明显。Wnt/β-catenin信号活性在COPD患者肺上皮细胞中降低,其下调的机制包括成纤维细胞衍生的WNT-5A/5B。

综上所述,人们可以运用类器官进一步探寻发病机制并寻找能够有效干预WNT 信号通路的方法,例如筛选抑制信号通路的药物等,可能有助于COPD 的肺泡修复[18]。Ng-Blichfeldt团队通过培养肺类器官,发现TGF-β损害了成纤维细胞形成上皮类器官的能力,表明慢性肺病(如COPD和IPF)持续的间充质TGF-β活化,可能会导致上皮修复缺陷,所以激活诱导的缺陷间充质-上皮信号可能有助于COPD患者上皮修复[19]。此外,Benam等[20]设计了一种与 ALI 平台集成的人体小气道芯片,用于模拟COPD的加重。该装置包含多孔 PDMS 膜分隔的上部空气通道和下部介质通道。正常气道上皮细胞或COPD上皮细胞置于膜上,内皮细胞置于对面。上通道空气流入形成ALI环境,促进气道上皮细胞分化。在用病毒模拟处理后,与芯片上的正常气道上皮细胞比较,COPD芯片分泌的细胞因子,如巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)、白细胞介素-8(IL-8)水平显著增加,表明这些微流体平台可以作为识别 COPD 恶化相关生物标志物的有效工具。使用这种微流体模型,可以筛选出与炎性反应相关的 COPD恶化的最佳药物,这验证了该平台能够精确评估药物疗效。

2.2特发性肺纤维化:特发性肺纤维化(IPF)是间质性肺疾病中最为普遍的形式之一,是一种以肺功能进行性丧失为特征的疾病。IPF的特征是气囊周围的肺组织中纤维化瘢痕形成,最终导致呼吸困难。随着全球人口老龄化,IPF的发病率和死亡率也在增加,而生存率却没有很好的改善[21]。因此,采用体外培养肺类器官对 IPF进行更加精确的分析,可以帮助人们更好的认识这一疾病的发生发展并寻找有效的治疗策略。患者源性诱导多能干细胞的Ⅱ型肺泡上皮细胞作为3D器官培养的新策略可以帮助人们克服原代细胞分离和体外培养等困难,并为IPF提供新的精准治疗方法,从而改善患者的生存和生活质量[22]。Stabler等[15]将外源性 TGF-β1添加到肺类器官培养体系中,极大的改善 IPF 疾病体外建模的成功率。Surolia等[23]通过观察来自 IPF 患者的肺类器官,发现抑制波形蛋白中间丝 (VimIFs)表达能够降低肺成纤维细胞的侵袭性。Schruf等[24]的研究发现,与 IPF 相关的 9 种细胞因子混合物,这些细胞因子在 IPF 支气管肺泡灌洗液或痰液样本中表达上调,其加入能够很好模拟真实 IPF 肺中的细胞因子微环境。Wynn等[25]利用 CRISPR/Cas9 技术成功建立了HPS基因突变的人类胚胎干细胞衍生的肺类器官,同时他们观察到 HPS 基因突变的肺类器官和人类 IPF 患者组织样本之间存在细胞因子 IL-11上调的重叠,IL-11上调是终末期 IPF 纤维化的关键指标。上述研究表明,建立纤维化类器官可以概括 IPF 的重要特征,并有助于 IPF 的治疗与药物筛选。

2.3肺癌:癌症是全世界主要死因之一,2020年导致全球近1 000万人死亡,其中(就癌症新病例而言)肺癌以221万例位居第二位。肺癌在组织学上主要分为三种主要类型(腺癌、鳞状细胞癌和小细胞癌)和几种不太常见的类型(包括腺鳞癌和大细胞神经内分泌癌)[26]。尽管研究者对肺癌的各种组织学亚型中发生的复杂基因组畸变研究较多,但对肺癌侵袭性的认识仍然不是很清晰[27-28]。Shi等[11]成功建立了从患者肿瘤和人源肿瘤组织来源移植瘤模型(PDX) 中培养非小细胞肺癌(NSCLC)类器官的方案,为 NSCLC 的药物测试和生物标志物的发现提供了很好的研究模型,该模型可以在较短的时间内筛选出合适药物用于患者的个性化治疗。该模型的成功建立不仅有利于肺癌生物标志物的发现、筛选和验证,而且还有利于快速评估出合适的疗法,尤其适用于治疗失败的肿瘤患者使用。Dijkstra等[29]运用个性化癌症免疫疗法,将外周血淋巴细胞和自体肿瘤类器官共培养,可用于富集错配修复缺陷型非小细胞肺癌患者外周血中的肿瘤反应性 T 细胞。免疫疗法有望从根本上改变癌症患者的治疗方式,已有研究表明,肿瘤类器官可用于在个性化的离体模型系统中建立,以支持基于T细胞的疗法。

越来越多的研究表明,类器官可以作为评估患者对抗癌药物筛选的优秀模型。来自肺癌患者的类器官可用于高通量药物筛选以期为每个患者提供最有效的抗癌药物或抗癌药物的最佳组合[30]。Kim等[26]从原发性肺癌组织中建立了来自五种肺癌亚型的80个肺癌类器官活生物库,涵盖了95%以上的肺癌患者:腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、腺鳞状细胞癌和大细胞癌。其建立的肺癌类器官生物库保持了它们各自亲本组织的组织学和遗传特征,有潜力用于患者特异性药物试验和靶向治疗和耐药机制的概念验证研究。不同遗传背景来源的肺癌类器官对药物的敏感性也不相同,已有研究成功培养出具有两个基因突变的肺癌类器官,并利用其分析对奥拉帕利的敏感性。研究发现具有BRCA2 p.W2619C突变的类器官比具有BRCA2 p.M965I突变的类器官具有更低的奥拉帕尼IC50。同时还发现奥拉帕尼严重破坏了具有BRCA2 p.W2619C突变的肺癌类器官的结构,PDX进一步证实奥拉帕尼抑制肿瘤生长。Barrera-ro dríguez 等[31]开发了多细胞肿瘤球体来分析药物敏感性的变化并确定获得多细胞耐药性所涉及的分子机制。Jabs等[32]开发了一种基于自动显微镜的观察法,以使用肺癌患者衍生的类器官同时研究细胞死亡和生长停滞,这已被用于筛选临床相关的肺癌治疗药物。

2.4COVID-19:2019年12月新型冠状病毒(COVID-19)爆发。新冠肺炎疫情目前已成为全球重大的公共卫生事件,成为威胁全球人类健康、破坏全球经济和社会稳定的危险因素。2020年1月,国际病毒分类委员会将引起COVID-19的新型冠状病毒命名为严重急性呼吸系统综合征病毒2(SARS-CoV-2)。面对这场大流行病,许多科学家致力于病毒感染机制、致病机制以及有效治疗方法的探究。科学家们利用非洲绿猴肾细胞Vero E6、人肺腺癌细胞Calu-3、人结直肠腺癌细胞Caco-2等2D培养系对病毒的感染机制、复制机制等方面进行了研究[33-36]。虽然2D细胞培养系易于培养和基因编辑,但它们作为单一类型的细胞系,不能模拟其在实际组织中的状态。动物模型ACE2转基因小鼠也用于SARS-CoV-2研究中,但动物模型与人之间的物种隔离不能真正反映病毒的入侵和人体免疫应答机制。面对上述两种模型的不足,人们可以通过建立肺类器官模型,研究COVID-19的发病机理并进行药物筛选以寻找最佳治疗策略。肺类器官在模拟人类疾病发生、研究宿主-病原体之间相互作用和药物筛选方面拥有巨大的前景。大量的临床数据与生物学研究均表明,SARS-CoV-2主要通过呼吸道感染肺部,轻症患者表现为轻微的呼吸道症状,重症患者可因肺损伤、多器官衰竭而死亡[37]。COVID-19患者尸检报告显示,SARS-CoV-2能够感染支气管上皮中的分泌细胞、纤毛细胞、杯状细胞以及肺泡中的AT2细胞[38-39]。在iPSCs或ESCs 诱导分化形成的肺泡类器官中,SARS-CoV-2只侵染AT2细胞[40]。在ESCs诱导分化形成的支气管类器官中,大多数被感染的是纤毛细胞,少部分被感染的是分泌细胞[41]。Tindle等[42]提出了一种由成人干细胞衍生而来,具有近端和远端气道上皮细胞的人肺类器官模型,该模型具有可传代、可扩增、个性化等优点。来自成人肺类器官 (ALO)、初级气道细胞或 hiPSC 衍生的肺泡 Ⅱ 型 (AT2) 肺细胞被 SARS-CoV-2 感染,以创建 COVID-19 的体外肺模型。结果显示,受感染的 ALO很好地概括了 COVID-19 患者衍生的呼吸道样本在不同队列中的转录组特征,验证了 COVID-19 人肺模型的可行性,能够用于 COVID-19 发病机制与检验新疗法和疫苗有效性的研究。SARS-CoV-2感染人体组织范围很广,包括肺、心脏、大脑等组织系统。为研究SARS-CoV-2特异性感染肺的宿主反应,Tiwari等[43]建立了ipsc来源的3D人类肺类器官,其通过病毒模拟感染肺类器官,发现肺泡上皮细胞高表达ACE2和TMPRSS2,并允许SARS-CoV-2感染,宿主因子如神经蛋白酶-1 (NRP1)、组织蛋白酶L (CTSL1)、纤溶酶和促肽酶相关肽酶13 (KLK13)在肺类器官模型中均有表达。在对感染的反应中,肺类器官中大多数固有免疫、细胞因子/趋化因子和炎性反应小体中的关键基因都上调。例如,免疫相关基因STAT1/2、IRF7、CCL5、CXCL10、TNF-α、IL-6、IL-8和IFN与患者表达的临床结果一致,证明细胞因子风暴的产生会导致严重的肺损伤。并且研究发现SARS-CoV-2感染肺类器官激活了炎性反应小体通路相关基因(NLRP3、ASC、IL-18、caspase-1和NLRC4),证实炎性反应小体激活会导致肺部炎性反应和细胞死亡。此外,他们通过使用刺突蛋白抑制剂进行研究发现病毒进入是刺突蛋白介导的。

相关研究建立了一个 hPSC-LOs 平台,该平台包括表达(SARS-CoV-2 的受体)的 AT2 样细胞。该团队对受感染的类器官进行 RNA-seq 分析,结果显示细胞因子/趋化因子信号传导上调,仅具有适度的干扰素特征,这模仿了在原发性人类 COVID-19 肺部感染中观察到的炎性反应变化[40,44]。Lamers等[45]建立了支气管肺泡类器官模型,通过使用低剂量的干扰素lambda 1治疗感染SARS-CoV-2的支气管肺泡培养物,结果发现在减少病毒复制和传播方面非常有效,表明病毒对干扰素具有高度敏感性,干扰素是一种可行的治疗选择。

2.5其他疾病:囊性纤维化(CF)是一种常染色体隐性遗传病,是由囊性纤维化跨膜传导调节基因(CFTR)突变引起的。基因编辑是一种很有前景的CF疗法,因此需要一种无需病毒载体、药物选择和报告基因富集的有效模型。近年来有团队通过比较不同的转染方法发现利用CRISPR/Cas9技术电穿孔是最有效的一种。通过使用这种无VDR方法,在野生型诱导多能干细胞 (iPSC)中产生dF508、G542X和G551D突变的效率提高了4.8%～27.2%。当它应用于携带dF508突变的患者来源的iPSC时,实现了超过20%的精确校正率。基因校正导致iPSC衍生的近端肺类器官以及患者衍生的腺癌细胞系CFPAC-1中CFTR功能的恢复。这项研究证明了基于基因编辑的疗法对单基因疾病CF的可行性[46]。囊性纤维化的疾病建模通常通过利用患者衍生的iPSC来实现。Mccauley等[47]发现经典Wnt信号通路的周期性调节能够通过NKX2-1+祖细胞中间产物使人类iPSC快速定向分化为功能性近端气道类器官。该类器官具有毛喉毒素诱导的肿胀缺陷,可通过基因编辑来纠正疾病突变。在纠正CFTR突变的基因编辑之前和之后,用毛喉毒素处理囊性纤维化患者特异性气道上皮类器官,校正后的类器官表现出明显着的肿胀反应,而患病的类器官表现出很小的肿胀反应,这意味着囊性纤维化的类器官将能够为医学或药物疗法提供体外模型。

肺结核由病原性细菌结核分枝杆菌(MTB)感染肺部的引起的疾病,结核病可防可治,肉芽肿是人类结核病的重要标志。许多研究表明,宿主免疫状态与肺结核的发生发展高度相关,因此深入理解人体对结核分枝杆菌的免疫反应对于制定结核病的预防和治疗策略至关重要。人类肺泡类器官可用于研究MTB与肺上皮之间的直接相互作用[48]。近几年随着类器官技术的兴起及利用,利用肺类器官作为结核病研究模型有令人兴奋的前景,但是在其被普遍性用作实验模型之前,仍然存在一些重要的挑战,例如最主要的是在肺类器官的结构中引入免疫细胞,其才能涵盖免疫反应的复杂性和基质免疫细胞在体外感染时的串扰。

人类基底细胞培养产生的类器官可以筛选出影响纤毛细胞和分泌细胞两者数量比例的细胞因子和蛋白质,因此可能是治疗平衡被破坏的疾病如慢性哮喘的潜在治疗方法[1]。Sachs等[30]证明气道类器官(AO)可作为模拟呼吸道合胞病毒(RSV)等病毒感染的很好模型,并提供了病毒蛋白 NS2 对细胞迁移和融合直接影响的体外证据,证明在类器官模型中研究中性粒细胞-上皮相互作用的可能性。Wnt/β-catenin信号通路对肺发育和肺组织稳态起至关重要的作用,其在人类肺气肿和小鼠模型的肺泡上皮细胞中降低。Wnt/β-catenin 信号的异常激活可诱导来自肺气肿患者的 3D 肺组织培养物的内在肺泡修复。这些研究表明,Wnt/β-catenin信号可以在成人肺气肿肺中启动细胞修复和组织再生,其可作为肺气肿组织修复的潜在治疗靶点[49]。

3 结论与展望

肺类器官在许多肺部疾病的研究与应用方面具有巨大的潜力,但同时也存在一些不足之处。肺类器官模型的局限性之一是缺乏微环境,包括生物力学刺激、基质细胞、血管和免疫细胞。这些成分和结构在调节干细胞行为和肺组织结构的形成中发挥着重要作用,因此微环境的缺乏导致本研究使用类器官进行研究的范围受到限制。肺类器官技术还面临的问题是成功培养的普遍性和重复性,只有能精准重复类器官的培养,才能够证明类器官培养系统的成熟和可控性,才有可能在各项研究领域中推广运用这一技术,即在相同的实验条件下,每个来源相同的类器官都能产生非常相似的特点,包括类器官的大小、组成、3D结构及基因表达等方面。因为类器官的可重复性等问题,所以该技术应用在药物研发中也面临着许多挑战。例如,类器官运用于药物筛选时要求起始条件相同以便获得更加真实可靠的实验结果,但是培养的类器官通常大小不一致,如果在类器官的形成过程中控制其大小,则可能会影响其分化等。当前肺类器官有机体培养系统的另一个主要缺点是使用Engelbreth-holm-swarm (EHS) 小鼠肉瘤细胞外基质(ECM)。尽管 EHS 基质作为类器官支持基质得到了最广泛的应用,但由于其有未知成分组成的动物肿瘤衍生原料,所以具有一些局限性,包括批次间差异和缺乏组织微环境[50]。因此,使用 EHS 基质培养的类器官通常无法预测药物测试和疾病机制研究中精确且可重复的生物学结果[51]。尽管微流体可用于芯片肺,但由 PDMS 膜两侧的2D细胞组成的传统微流体系统在重现体内细胞-ECM 相互作用方面存在局限性,因此芯片肺的使用仍需进一步探索。

尽管癌症类器官有望反映肿瘤间的异质性并评估临床使用中药物反应的变化,但离体敏感性与最终患者结果之间的联系仍有待证实。此外,在实现基于癌症类器官的个性化医疗之前,必须考虑肿瘤内异质性,因为同一肿瘤不同部位的癌细胞群可能表现出不同的药物敏感性。肿瘤的异质性为患者来源的肿瘤类器官成功建立带来困难与挑战,由于不同类型的肿瘤微环境的不同,使得不同个体组织来源的肿瘤类器官建立培养要求不尽相同,因此仍然需要更多的研究去探索各种肿瘤类器官模型最佳的培养方案。目前肿瘤类器官培养技术依然不是很成熟,培养条件相对复杂,已建立的肿瘤类器官绝大多数来源于上皮细胞或组织,能否通过非上皮细胞或组织来建立与培养肿瘤类器官,设计出更简单、高效的培养方案仍需进一步探索[52]。

类器官作为一种具备独特优势,有应用前景的模型,相信在未来的发展中有着广阔的前景。随着科学研究的深入,相信未来一定会将血管、免疫细胞等成分和结构引入类器官培养体系中,使类器官更加接近人类结构[26]。化学合成生物材料能够为类器官提供可调节的物理刺激和机械张力(例如刚度、几何形状),随着这一新兴技术的崛起,能够更好地帮助肺部疾病建模[52]。类器官工程未来的另一新方向是将多种类器官融合和共培养,这种技术的实现可能需要使用微流体和功能性生物材料进行,用于整合器官系统和高度精细的疾病建模[53]。模拟全身综合药物反应的“多类器官芯片”,将成为提高新药发现成功率的新兴技术[54]。此外,来自临床个体癌症患者组成的类器官生物库可能有助于癌症治疗的个性化[55]。类器官与免疫细胞或其他细胞共培养构成了下一个前沿[7]。近年来爆发的新型冠状肺炎给人们带来了很大的伤害,将肺泡类器官和支气管类器官在不同培养系统中建立,可以为人们更全面地认识SARS-CoV-2和寻找更完美的治疗方法带来新的思路。同时伴随着生物医学与材料学等多学科的交叉渗透,高通量测序技术、器官芯片技术等新技术的问世,类器官的发展将会更加迅猛。随着研究进一步深入,类器官可以在病因学机制、精准治疗、药物筛选等方面更好地为人类服务。