MC3T3-E1细胞成骨模型的应用及研究进展*

曹志威 武晓蓉 邵国 赵志军 张春阳

骨的再生修复一直是个世界性难题。骨骼具有很强的再生能力，具体表现在损伤（骨折）修复期间，以及成年后的骨骼发育和持续重塑过程中[1]。大量研究表明，骨修复与骨发育过程相似，其机制十分复杂，涉及多种细胞类型和细胞内外分子信号通路[2-3]。骨不连、骨缺损或骨溶解等是临床上常见的再生修复类型，目前治疗手段非常有限，此类疾病都是因骨细胞分化成熟过程出现问题引起的。因此，在体外选取一种成骨细胞模型来探究骨生长及再生修复的分子机制是十分有必要的。

MC3T3-E1细胞（小鼠颅顶前骨细胞）是最常用的成骨样细胞系之一，通常情况下，MC3T3-E1细胞在含抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松等诱导因子的培养基中能够很好地向成骨细胞分化[4]，重现体内成骨细胞的生长周期。该细胞现已被发展为研究细胞分化调节、细胞因子和激素调节、基质蛋白的合成和分泌、骨骼疾病的分子机制和药物药代动力学的理想模型[5-9]。近年来，MC3T3-E1细胞培养也发展到对新型生物材料的细胞相容性和成骨活性方面的评估[10-11]。

本文就MC3T3-E1细胞成骨模型的培养、鉴定及应用等方面进行综述。以期明确MC3T3-E1细胞成骨模型的研究方向，并提出几点新见解。

1 体外培养

MC3T3-E1细胞取自新生小鼠颅顶骨，是一种贴壁生长的成纤维细胞[12]。该细胞系有多个亚克隆，在含抗坏血酸培养基中的成骨分化与矿化能力各有不同[13]。MC3T3-E1亚克隆4和亚克隆14表现出高水平的成骨细胞分化能力，是当前研究者们首选的成骨模型。

不同组分的培养基对MC3T3-E1细胞增殖和成骨的影响有所不同。维生素C（Vitamin C, VC）是抗坏血酸的L-对映体，是生物体不可缺少的营养物质[14]。Ⅰzumiya等[15]比较了是否含VC的α-MEM或DMEM培养基对MC3T3-E1细胞增殖和成骨的影响，结果显示无论细胞密度如何，α-MEM都会促进细胞增殖，即使在不含VC的α-MEM中也是如此。此外，细胞在含或不含VC的DMEM培养基中增殖能力都明显低于α-MEM培养基。这些结果表明VC并不是MC3T3-E1细胞的必需营养物质，α-MEM似乎是此细胞培养的更优选择。在使用VC和β-甘油磷酸成骨诱导后，出现了一个有趣的现象[15]，在额外添加VC的培养基中培养的细胞钙化程度明显高于在α-MEM培养基中自带VC培养的细胞，这或许是因为商业α-MEM培养基中的VC失去了生物活性，而新鲜的VC发挥了重要作用。相反，使用DMEM作为基础培养基来诱导成骨，其效果并不明显，在3周时几乎没有钙化。

上述研究表明，用于培养MC3T3-E1细胞的两种主要培养液α-MEM和DMEM在增殖、成骨和钙化等方面存在很大差异，这些差异影响了生物材料的评估，即使评估相同的材料，也可能产生不同的结果。目前大部分实验对于该细胞的培养及成骨诱导所使用的基础培养基都是α-MEM，如何优化培养基的成骨效果是研究者们下一步的研究方向。

2 鉴定方法

2.1 细胞形态

MC3T3-E1细胞在使用基础培养基培养时形态与成纤维细胞类似，呈梭形，而进行成骨诱导后细胞逐渐伸展呈多角形，并伸出多个树枝状突起，胞体和胞核逐渐变大[16]。大部分研究鉴定该成骨模型时未将细胞形态纳入其评价指标，这些学者认为细胞形态与细胞状态、代数及培养基的不同都有关系，甚至不同人培养出来的细胞形态可能都会略有差异，故单从细胞形态来判断MC3T3-E1细胞成骨模型建立是否成功没有意义。

形态决定功能，尽管细胞形态对于MC3T3-E1细胞成骨的鉴定没有太大帮助，但对细胞成骨前后的形态对比研究可能会揭示细胞的某些功能。

2.2 碱性磷酸酶活力检测

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）是成骨细胞的标志性酶，在MC3T3-E1细胞成骨早期产生，很容易在细胞表面找到[17]。文献报道，MC3T3-E1细胞的ALP活力随着成骨诱导时间的延长而增加[18]。

目前检测成骨细胞中ALP表达的主要技术有基因检测法、染色法和活力检测法。传统的ALP活力检测基本原理是在特定条件下，ALP可以将底物对-硝基苯磷酸盐（Para-nitrophenyl phosphate, PNPP）分解成对-硝基苯酚（p-Nitrophenol, PNP）和磷酸盐，通过测定PNP的吸光度来间接反映ALP的活力[19]。虽然该方法已广泛应用于成骨细胞的鉴定，但仍存在灵敏度低、干扰强、可能出现假阳性结果等问题。在过去的几年里，随着光学、电化学及荧光探针等新兴材料的出现[20-21]，各种ALP活性分析方法得到了蓬勃发展。这将为检测ALP活性提供更多潜在的原则和策略。

2.3 矿化结节染色

矿化结节是MC3T3-E1细胞分化成熟的标志[22]，同时也是其行使成骨功能的主要形态学表现。正常成骨条件下，细胞在培养至第14天后会有少量矿化结节形成，随着诱导时间的延长，矿化结节逐渐增加[23]，且在一些促成骨药物的作用下，矿化结节也可提前出现。

目前实现商品化的矿化结节染色方法包括Von Kossa法、茜素红S法和四环素法[24-26]。Von Kossa法是矿化结节染色的经典方法，但由于其特异性较差，在成骨培养中观察到的阳性染色可能不仅仅是羟基磷酸钙结节，也有可能是某些来源不明的营养不良矿化[27]，现在大多数实验均不使用此方法。茜素红S法是检测矿化结节的最常用方法，它是一种蒽醌类衍生物，作为阴离子染料，能够与钙离子以螯合方式形成橘红色或紫红色复合物[24]。值得一提的是，茜素红并不是钙特异性染料，会受到其他金属离子（如镁、锰、钡、锶等）的干扰，但是这些离子含量往往很低，因此并不会影响最终的染色结果。与Von Kossa法相比，茜素红S法的优势在于对少量的矿化结节能够得到更可靠的结果。此外，四环素可以与矿化结节中的钙离子螯合并形成荧光的磷酸复合物，这一特性使得四环素也可用来检测成骨过程中的矿化情况[25]。

除上述三种染色方法外，研究者们还尝试利用各种荧光染料对矿化结节进行检测，Querido等[28]首次证实Giemsa可作为体外矿化结节的荧光染料。扫描电镜通常用于观察骨的胶原结构，而廖乃顺等[29]首次利用扫描电镜来观察成骨细胞矿化结节的形态结构，虽然该方法可更加精确地显示矿化结节的数量及微观结构，且具有一定的新颖性，但此方法成本较大，不利于推广。

2.4 成骨相关基因检测

在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中，许多基因参与其中，如矮小相关转录因子2（runt-related transcription factor 2, Runx2）、ALP、骨钙素（osteocalcin, OCN）和骨桥蛋白（osteopontin, OPN）等。利用蛋白印迹法和聚合酶链式反应等技术手段检测这些基因的表达，往往也可作为一种佐证来判断细胞是否成骨。正常成骨条件下，随着诱导时间的延长，成骨相关基因的表达也随之增加。但细胞和培养基的不同可能会使部分基因的表达出现略微差异。

在MC3T3-E1细胞正常成骨诱导过程中，成骨相关基因的表达在14天前大致呈上升趋势[23]。茜素红染色矿化结节也在该时间节点出现，说明在此之后细胞可能已经分化成熟。因此做成骨相关研究时，选取成骨诱导14天前的细胞较为合适。若培养周期过长，细胞污染几率和时间成本也会增加。

3 细胞培养环境

MC3T3-E1细胞通常在体外二维微环境中培养。然而，该培养环境与成骨细胞的组织内环境非常不同，不能完全模拟体内骨环境。三维细胞培养技术是一种新颖的细胞培养技术，可以通过支架或特殊装置模拟细胞在体内的生长状态[30]。水凝胶能模拟天然细胞外基质的生物化学和力学环境，已被广泛用于细胞培养和组织工程。Ⅰ型胶原是骨骼细胞外基质的主要成分，其为成骨细胞提供了一个良好的培养环境。已经证明，在3D胶原凝胶中培养细胞会影响细胞形态、细胞间相互作用和对可溶性因子的反应[31]。Matthews等[32]将MC3T3-E1细胞接种于3D Ⅰ型胶原凝胶中，并与2D凝胶中培养的细胞进行比较，结果显示，前者矿化结节及成骨细胞标志基因的上调出现较早。此外，有研究团队研发出了3D羟基磷灰石（HAP）-多肽杂化水凝胶[33]，该水凝胶具有良好的生物相容性、机械稳定性及低细胞毒性等特点，可长期用于细胞培养。

利用MC3T3-E1细胞来研究成骨细胞在体外的生物学变化成为当前的热点。微重力（microgravity, MG）和辐射（radiation, RA）是太空中的主要环境因素[34]，对人体尤其是骨组织有多种影响。Dong等[35]模拟微重力和X射线单独或联合作用MC3T3-E1细胞，与对照组相比，细胞活性降低，成骨相关基因Runx2表达降低。等离子体能够产生多种生物活性物质，特别是活性氧（reactive oxygen species,ROS），各种实验表明ROS可以影响细胞活性[36]。Tominami等[37]证明短期适当的等离子体照射可促进MC3T3-E1细胞分化，且不会对细胞造成损伤，但其潜在机制仍不清楚。

随着人们对MC3T3-E1细胞培养环境的研究进一步深入，越来越多骨骼疾病的发病机制被揭示。通过模拟不同情境下体内骨细胞所处的微环境来探究某些疾病的发病机制已成为现阶段的研究热点。

4 细胞模型的体外应用及优劣势

骨质疏松症是一种以骨折风险增加、骨量减少和骨结构紊乱为特征的全身代谢性骨骼疾病[38]。成骨细胞是骨的主要成分，对骨的发育和形成至关重要。骨形成在很大程度上取决于成骨细胞的数量和活性，成骨细胞功能障碍是导致骨质疏松的直接原因[39]。因此，探索促进成骨细胞活性和分化的方法可能有助于预防骨质疏松。MC3T3-E1细胞成骨模型是其理想选择之一。

颅骨缺损通常由创伤、感染、肿瘤、先天性畸形或骨骼疾病引起[40]，骨重建是目前最主流的治疗方法。颅骨修复过程中发挥主要作用的是前骨细胞和间充质干细胞，二者向成骨细胞的分化能够帮助缺损部位的快速修复。组织工程技术在近几年发展迅速，一种典型方式是将合适的种子细胞和生长因子添加到可降解的多孔支架中[41]。MC3T3-E1细胞作为前骨细胞，在体外成骨后与支架结合能促进缺损部位的骨修复。

牙齿脱落后会导致牙槽骨的破坏和吸收减少[42]。这可能会给后期恢复拔除部位的美观和功能带来困难。目前最可靠、最有效的治疗方法是用植骨材料填充拔牙后的缺损区[43]。利用体外实验寻找一种促成骨因子或药物是当下研究的热点，不少研究者选择MC3T3-E1细胞作为体外实验的种子细胞。

原代培养的成骨细胞可以很好地模拟体内成骨过程[44]，但存在增殖能力差、培养时间受限、转染效率低等问题，在骨组织工程的应用方面受到了限制。研究者们开发出了多种成骨细胞系，其中包括骨样细胞MLO-Y4、骨肉瘤细胞MG-63、前骨细胞MC3T3-E1等。MC3T3-E1细胞的生物学功能与原代培养的成骨细胞最为接近，其增殖能力强、能无限传代，并且作为成骨细胞的前体，可用于研究细胞的整个成骨过程。而其他成骨细胞系虽能无限传代，但由于其取自成熟的骨细胞或瘤样细胞，部分生物学特性与原代培养的成骨细胞略有不用，故不作为细胞成骨模型的首选。所以，在当前骨组织工程的大背景下，MC3T3-E1细胞被广泛地用于研究成骨细胞的分化、增殖和分子机制，并且作为众多疾病的靶细胞类型的首选。

尽管MC3T3-E1细胞是一种几乎能替代原代人成骨细胞的体外模型，适用于各研究领域，但在临床转化方面，最令人担忧的是物种差异，有一定的局限性。因此，应谨慎推断结果，根据具体研究情况得出结论。另外，目前商业化的MC3T3-E1细胞系来源于新生小鼠的颅顶骨，而在现阶段的大部分研究中，MC3T3-E1细胞系多应用于四肢骨的研究，颅顶骨的生长方式以膜内成骨为主，而四肢骨则以软骨内成骨为主，二者的生长方式不一样，当MC3T3-E1细胞应用于四肢骨的成骨过程研究时所得出的结论是否严谨需要进一步讨论。

5 展望

合适的细胞模型有助于更好地了解所涉及的生理、病理和再生过程。MC3T3-E1细胞是一种前骨细胞，其在早期具有较强的增殖、矿化和分化能力，已被广泛用于研究成骨细胞在体外的生物学变化。必须指出的是，许多因素可以影响MC3T3-E1细胞的生长，例如，用于细胞培养的培养基及其添加剂、细胞接种密度及培养系统本身，这可能会导致不同的结果。长期以来，单层培养一直是MC3T3-E1细胞体外培养的标准方法。但这不能反映自然条件下的骨生长，因此人们对建立一个更接近细胞自然环境的细胞系统更感兴趣。研究表明，在3D系统中培养的细胞，与普通培养的细胞有很大的差异，其更能体现细胞的真实状态，这将会是未来研究的重点。此外，许多研究已经将MC3T3-E1细胞成骨模型用于生物材料的评估，并将注意力放在参与细胞成骨的信号通路上。随着研究深入和其他技术的发展，有望扩大其应用前景。