茶叶中的微生物多样性及有害微生物污染的检测

陈思琪

[福建省产品质量检验研究院 国家加工食品质量监督检验中心（福州），福建 福州 350002]

茶被誉为世界三大饮料之一，当前，我国茶产业的发展基础雄厚，品牌效应显著，逐渐成为多个省份经济的支柱性产业。随着茶文化的普及和物质生活水平的提高，人们对市场中的茶叶及其制品安全的要求也逐渐提高，同时，国家对茶叶安全的监管力度也在不断加大，针对不同茶叶制定了对应的行业标准。如何进一步提升对茶产品质量管控力度问题，逐渐引起大众的热议。

从茶树的培育、病虫害的防治、茶叶加工的生物发酵、到茶叶的储存和功能成分制备，茶叶的微生物的应用覆盖面极广，在茶产业的发展中发挥着具有显著的作用。但是，茶叶中有害微生物的存在会对人体健康造成一定的风险，也影响着茶叶出口贸易的发展。

1 茶叶中的微生物应用

1.1 茶树培育与病虫害防治中的微生物应用

茶园土壤的生态系统能够直接影响茶树的生长，继而影响茶叶的品质，微生物作为生态系统中物质转化的重要媒介，在茶树的生长发育过程中发挥着巨大的作用。长期以来，随着专业人员对茶园土壤微生物系统中的不断研究，茶树根际微生物的作用也为人所熟知。茶园土壤微生物群落种类繁多、数量庞大，能够通过新陈代谢分解土壤中的物质增加土壤的养分，从而提高茶叶品质，特定的微生物还具有固氮、促进氮磷钾等微量元素的吸收、促进发芽、提高生长速度等作用。有效利用微生物菌剂作为培育茶树的绿色肥料，不仅能够增强茶树耐受力、提高茶叶产量，对于改善滥用化肥导致的农药残留重金属超标问题也具有促进作用[1,2]。

茶树的病虫害防治一直以来是茶叶产业发展中的关键问题。生物农药在茶树病虫害综合治理当中的应用被逐渐推广，研究表明多种细菌、真菌及病毒对特定的病虫害具有针对性的防治作用[1-3]。例如：应用广泛的苏云金芽孢杆菌生物制剂可以在昆虫肠道中产生伴孢晶体蛋白毒素从而杀灭害虫，主要用于防治鳞翅目昆虫；分离的芽孢杆菌能有效抑制多种茶树叶斑病；白僵菌等真菌生物农药可以通过制剂喷洒孢子侵染昆虫，从而抑制其生长代谢达到防治害虫的目的；病毒生物农药在防控茶毛虫、茶尺蠖上也具有相关制剂，可有效防控对应的病虫害[1-3]。

1.2 茶叶加工中的微生物应用

1.2.1 茶产品的微生物发酵

品种繁多的茶树是茶产品多样化的重要原因，产品制作工艺的不同大大丰富了茶叶产品的种类。微生物发酵长期应用于黑茶、红茶、茶饮料等产品的生产制作过程，大量微生物随着渥堆环境温、湿度等条件的变化与茶叶产生化学反应，形成茶叶特有的色、香、味[4]。茯砖茶的“发花”工艺则是茶叶生产中典型的微生物应用，在冠突散囊菌、黑曲霉、毛霉等微生物等作用下形成其特殊的风味[5]。在红茶及茶饮料的生产加工中，乳酸菌、酵母菌、真菌的应用也极为广泛。

微生物发酵极大程度丰富了茶叶的食品功能，在调节肠道菌群平衡、消食、解腻等多种保健功能上也取得一定成效。此外，茶产品生产过程中产生的茶渣废料通过微生物发酵作用可以制备成营养元素丰富的肥料、饲料等副产品，或通过提取其木质素纤维酶、葡萄糖、果胶酶等有效成分进一步扩大其经济价值[3]。

1.2.2 茶叶的储存及功能成分制备

良好的茶叶贮藏关键在于做好密封、防潮、防异味，贮藏环境宜远离污染源且无异味，有一定的防潮、防尘措施，避免日光照射以及合适的环境温度。目前，微生物在茶叶贮藏上已经得到应用，有研究发现将嫌气性蜡样芽孢杆菌经过低温处理成菌粉，按比例添加于茶叶中密封，存放在阴凉干燥处能够对茶叶起到隔氧保鲜的作用[3]。

茶叶中含有茶氨酸、茶多糖、茶多酚、氨基酸等对人体有益的功能成分，利用微生物发酵可产生用于合成茶氨酸的三种主要催化酶，即谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺转肽酶。有研究发现一种含有谷氨酰胺酶的细菌香茅醇假单胞菌，在特定碱性条件下能够快速催化合成茶叶功能成分茶氨酸[3]。

2 茶叶中微生物污染及检测方法

在茶叶的制作、储存、运输过程中有可能产生茶叶污染问题，不仅影响茶叶品质，严重会引起健康问题。污染问题除了出现在农药残留、重金属超标等领域，有害微生物污染也普遍存在。研究发现茶叶中的细菌污染主要包括一些肠道细菌如大肠杆菌、沙门氏菌，真菌污染主要是霉菌及其代谢出现的真菌毒素。

2.1 细菌污染

2.1.1 大肠菌群污染

大肠菌群与肠道致病菌有着密切的联系，一些特殊血清型的大肠杆菌已被列为典型的病原菌，能够导致腹泻、炎症、败血症等症状，对人体健康产生一定的危害。在食品微生物检测中的常规项目主要包括大肠菌群、总大肠菌群、耐热大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌等。由于大肠菌群广泛存在于环境和人体肠道中，具有较高的传播率及环境耐受力，因此容易在茶叶加工或储存过程中造成污染。近年来，研究人员在茉莉花茶、普洱茶、绿茶等多种茶叶中都检测到大肠菌群的存在[4-8]。

当前大肠菌群检测方法主要有平板法、乳糖管发酵法、LST肉汤发酵法、疏水栅格滤膜法、荧光实时PCR法、PCR试纸条快速检测法、环介导恒温扩增法（LAMP）、MPCR-DHPLC色谱法、酶联免疫吸附分析法（ELISA）等。虽然可用的检测方法种类较多，但考虑到技术难度以及检测成本问题，现有的食品检测还是以传统的平板法以及多管发酵法较为普及[9]。

2.1.2 沙门氏菌污染

沙门氏菌作为食源性疾病的主要诱发病原菌之一，能够引起肠胃炎型、败血症型、类伤寒型、类感冒型以及霍乱型等五种疾病，已经成为众多食品安全检测中的常规项目。研究表明，沙门氏菌在对抗恶劣环境下能够维持VBNC状态，这种状态为活态具有一定代谢活力但不可在常规培养基中培养，极可能逃避传统的检测方法[10]。因此，由于沙门氏菌可生长温度范围广，营养需求不高，具有较强的耐干、耐热性的特性，在茶叶生产过程中具有易污染、易存活的特点，且研究发现热水冲泡不能完全杀死茶叶中存活的沙门氏菌，存在较大的污染风险[10]。

目前沙门氏菌的检测方法有常规增菌法、聚合酶链式反应法、酶联免疫法、实时荧光PCR检测法、垂直膜过滤法、环介导恒温扩增法（LAMP）、免疫色谱反应法等。

2.2 霉菌污染

霉菌由于其孢子繁殖特性能够在环境中大面积传播，具有较强的污染性，不仅能够诱发茶树的病虫害，在茶叶加工、存放过程中也极易存活。数据表明，不论是包装成品茶还是散装茶都存在霉菌污染的情况，茶叶霉菌污染的优势属有曲霉属、青霉属、杂霉属等[11]。霉菌毒素是霉菌的次生代谢物，种类繁多难以分类，当被摄入吸收时可以导致动植物患病或死亡。研究发现，霉菌的这些有毒次生代谢物可以在茶叶生产的任一阶段开始积累，存在较大的健康危害。

当前针对食品微生物霉菌的计数检测方法主要参照国家推荐标准GB/T 4789.15—2016，也可采用实时荧光定量PCR针对特定种的霉菌进行分子检测，如黄曲霉、烟曲霉、环曲霉等，而液相色谱-串联质谱法能够对多种霉菌毒素进行测定。

3 茶叶微生物检测标准

我国食品安全检测技术已经形成较为完整的检测体系，与微生物相关检测项目覆盖了多种食品类别中，并设定了对应的定量或定性指标。国家食品安全监管部门针对茶产品质量安全问题出台了许多监管措施，包括一系列的检测标准。这些茶产品标准涵盖了多方面，其中，感官品质包括外形、汤色、香气、滋味、叶底，理化成分包括茶多酚、游离氨基酸总量、咖啡碱、儿茶素等，农药残留包括六六六、滴滴涕、三氯杀螨醇、氰戊菊酯等，营养元素包括钾、钙、钠、镁、铝等，污染物包括铅、铜、铬、镉、锡等。

相比之下，我国在茶叶微生物检测要求上尚未制定国家强制性标准，主要参照食品的相关检验方法。通过对检验标准的查询发现，现行的与茶有关检测推荐性国家标准中，有明确注明致病菌检测指标的标准有GB/T 21733—2008《茶饮料》、GB/T 22111—2008 《地理标志产品 普洱茶》，检测项目包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌，其中茶饮料的微生物检测指标还包括菌落总数、大肠菌群、霉菌、酵母以及商业无菌检测。涉及大肠菌群检测指标的国家推荐性标准有GB/T 18745—2006《地理标志产品 武夷岩茶》、GB/T 20354—2006《地理标志产品 安吉白茶》、GB/T 20360—2006《地理标志产品 乌牛早茶》。GB/T 9833.3—2013《紧压茶 第3部分：茯砖茶》中明确了茯砖茶的冠突散囊菌检测考核指标。此外，GB/Z 21722—2008《出口茶叶质量安全控制规范》中将出口茶叶微生物污染列为其他检验项目。

4 茶叶微生物检测展望

茶叶显然已经成为我国重要的发展产业，当前我国从茶园开垦、道路水利系统、施肥管理、茶叶生产、再到后期的茶叶储存都已出台较详细的茶叶生产技术规范，对于茶叶产品的农残、重金属等检测标准也较为完整，这些逐年完善的检测标准不仅加大了对茶企的监管力度，更为茶叶质量提升发挥了积极的作用，但我国对于茶叶有害微生物却尚未出台强制检测指标。

美国、日本及部分欧盟发达国家已经将茶叶有害微生物列为试验项目，有害微生物污染问题便成为我国茶叶出口的限制原因之一。数据显示，在我国出口茶叶中曾检出大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌及黄曲霉等有害微生物，在一定程度上限制了我国茶出口产业的发展[12]。基于绿色茶叶的标准在未来有逐渐提升的趋势，而茶叶的有害微生物污染危及人体健康，这一方面要求国家应该严格把控茶产业的每一环节，另一方面显示我国应该加快完善茶产业的微生物检测标准。而且茶叶微生物的检测能够在一定程度上反映茶叶生产加工过程中的规范程度。茶叶微生物检测标准的推行存在一定的必要性，应对具有典型污染的微生物设定检测指标，以推动茶产业的健康发展。