基于网络药理学和分子对接技术分析川楝子致肝毒性机制

何山，欧水平，叶林虎，王森*，吴大章,

1.遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563000

2.遵义医科大学附属医院 药剂科，贵州 遵义 563000

3.华南理工大学附属第六医院，广东 佛山 528000

4.太极集团重庆桐君阁药厂有限公司，重庆 401366

川楝子又名川楝实，是楝科植物川楝Melia toosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果实，主要分布在我国的四川、湖南、湖北、贵州等地区，因入药以四川产为道地药材，故名为川楝子[1]。川楝子中富含萜类、黄酮类、有机酸以及多糖等多种活性成分[2]，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、消炎镇痛、驱虫等广泛药理作用[3]。随着对川楝子的研究，发现其除了具有药理作用，还具有一定的毒性作用，在川楝子毒性方面的研究中，早期有报道称，在用川楝子进行驱虫时，发现有28 例发生中毒现象，10 例死亡病例[4]。近年来，通过对其毒性研究发现其具有肝毒性、妊娠毒性、肌无力、神经肌肉毒性[5]、消化系统[6]等，主要表现在胃肠道刺激和肝毒性方面。胃肠道刺激方面，有报道称服用川楝子的患者通常在服药后1～2 h 内就会发生胃肠刺激反应[7]。肝毒性方面，近年来，越来越多的文献研究表明川楝子确实可导致肝毒性，在报道的92 例中药致药物性肝损伤的病例中，其使用的有大部分中药及制剂含有川楝子等成分[8]；赵筱萍等[9]快速筛查川楝子肝毒性成分并鉴定发现，川楝子中的meliasenin B、trichilinin D、1-O-tigloy-1-O-debenzoylohchinal 可能引起肝毒性，王昆阳等[6]研究中报道这3 者是川楝子致肝毒性的物质基础。大多数认为毒性蛋白和川楝素类化合物是川楝子的毒性来源[10]，但目前针对川楝子毒性物质基础和毒性机制尚未完全明确，因此，本研究通过网络药理学[11]及分子对接技术探讨川楝子致肝毒性的物质基础和机制，以期为临床研究提供理论依据。

1 方法

1.1 川楝子候选毒性化合物的筛选

在中药药理数据库及分析平台（TCMSP）中输入“川楝子”进行搜索，获取川楝子活性化合物，并通过设置口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，对川楝子活性成分进行筛选，然后将从TCMSP 数据库中筛选出的化合物在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中下载候选成分的化学结构。并将其上传至Swiss ADME 平台（http://www.swissadme.ch），以肠胃吸收为“high”和类药性五原则（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中至少有2 个结果是“Yes”为标准进行筛选，得到川楝子的活性成分，将活性成分输入CTD 数据库进行毒性筛选，结合文献报道[9,12,13,14]的毒性成分补充，最终确定川楝子潜在毒性成分。

1.2 川楝子潜在毒性成分靶点的预测

通过 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）数据库下载毒性成分的2D 结构的sdf 格式文件，并将下载的毒性成分的2D 结构式或标准的Smiles 号导入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库中，属性设置为“homo sapiens”，分别进行不同毒性成分的靶点基因预测，并用TCMSP 中已有的靶点进行补充。

1.3 肝脏相关靶点的获取

在 GeneCards 数据库中输入主题词“liver toxicity”进行检索，以score 值中位数为标准，筛选score 值大于中位数的靶点，即为肝脏相关靶点。

1.4 川楝子肝脏毒性潜在作用靶点预测

将川楝子毒性成分的靶点与肝脏损伤相关靶点上传到在线韦恩图（www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html），以川楝子毒性成分靶点和肝毒性靶点进行作图，二者的交集即为川楝子的肝脏毒性潜在作用靶点。

1.5 川楝子“毒性成分–预测靶点”“毒性成分–潜在作用靶点”网络的构建

整理川楝子毒性成分与对应靶点信息及1.4 项下的交集靶点信息，利用软件Cytoscape 3.8.2 版构建川楝子“毒性成分–预测靶点”“毒性成分–潜在作用靶点”网络图。

1.6 潜在作用靶点基因的蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将川楝子毒性成分靶点基因与肝脏损伤相关靶点基因的交集导入String 数据库（https://stringdb.org/）中，选定研究物种为“Homo Sapiens”，设置连接评分值＞0.7，隐藏相互没有链接的蛋白，得到PPI 网络图。并应用软件Cytoscape 3.8.2 版对网络进行可视化处理和分析。

1.7 靶点蛋白的基因功能和通路分析

应用生物学信息注册数据库DAVID（https://david.ncifcrf.gov）对川楝子毒性成分肝脏潜在作用靶点进行基因本体（GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，获得川楝子毒性成分对肝脏作用的主要生物过程和主要信号通路。并利用微生信数据库（www.bio informatics.con.cn）在线构建GO 功能富集网络图，再利用软件Cytoscape 3.8.2 版以KEGG 分析结果中的显著通路数据信息构建川楝子致肝毒性的“毒性成分–潜在靶点–核心通路”网络图，对该网络进行拓扑学性质分析，筛选川楝子致肝毒性的核心成分及核心靶点。

1.8 分子对接

将待对接成分从PubChem 数据库中下载结构的sdf 格式文件，通过Open Babel（https://openbabel.org）软件将sdf 文件格式转化为pdb 格式文件，采用AutoDock Tools 1.5.6 软件对分子进行加氢和结构优化，并输出其格式为pdbqt 文件格式作为分子对接中的配体。从PDB（http://www.rcsb.org/）数据库下载带对接靶点3D 结构，对其结构进行预处理，去除水分子和配体残基，采用AutoDock Tools 1.5.6软件进行和加氢等操作，输出其pdbqt 格式作为分子对接中的受体。将受体与配体的pdbqt 格式文件导入AutoDock Tools 1.5.6 软件中获得相应毒性口袋，设置Gridbox 做标及大小，运行AutoDock Vina脚本进行分子对接，得到其结合情况评估参数affinity 值，并通过开源软件Pymol 对其对接结果进行可视化。

2 结果

2.1 川楝子的潜在毒性化合物的筛选

在TCMSP 数据库中共检索到33 个川楝子活性化合物，按照OB≥30%和DL≥0.18 筛选后得到9 个活性化合物，见表1。通过CTD 数据库和文献搜索共搜集到6 个毒性化合物（通过筛选发现表1中的9 个活性成分均没有肝毒性，因此，表2 中的6 个毒性成分均来自于文献报告，并通过CTD 数据库验证），见表2。

表1 TCMSP 数据库中川楝子的9 个活性成分Table 1 Nine active components of Toosendan Fructus in TCMSP database

表2 川楝子的毒性成分Table 2 Toxic components of Toosendan Fructus

2.2 川楝子“毒性成分–预测靶点”网络的构建

川楝子的毒性成分预测出350 个作用靶点，将毒性成分、靶点导入软件Cytoscape 3.8.2 版中，删除未连线靶点，从而得到川楝子“毒性成分–预测靶点”网络图，见图1。在该网络图中，共有263 个节点，686 条边，其中圆形节点代表川楝子毒性成分的预测靶点，棱形节点代表川楝子的毒性成分，中间“V”节点代表川楝子。degree 值代表与该节点相连的边的数量，在该网络图中，degree 值＞2 倍中位数的靶点中前10 位的靶点有花生四烯酸5-脂氧合酶（ALOX5）、羧酸脂酶2（CES2）、羟基类固醇11-β 脱氢酶1（HSD11B1）、双微粒体2（MDM2）、脾酪氨酸激酶（SYK）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、大麻素受体1（CNR1）、大麻素受体2（CNR2）、磷酸二酯酶10A（PDE10A）。

图1 川楝子“毒性成分–预测靶点”网络Fig.1 “Toosendan Fructus toxic component-predictive target” network

2.3 川楝子致肝毒性“毒性成分–潜在作用靶点”网络的构建

在GeneCards 中检索到关于肝脏损伤的基因，并筛选出score 值≥中位数的靶点，得1 295 个肝脏损伤靶点，与川楝子毒性成分预测靶点取交集，得到103 个交集靶点，即为川楝子致肝毒性的潜在作用靶点，见图2。

图2 川楝子毒性成分预测靶点与肝脏损伤靶点交集Fig.2 Intersection of predicted targets of Toosendan Fructus toxicity components with liver injury targets

根据103 个川楝子肝毒性潜在作用靶点，将其导入软件Cytoscape 3.8.2 版中构建得到川楝子“毒性成分–肝脏潜在作用靶点”网络图，见图3。在该网络图中，共有110 个节点，包括103 个靶点和6 个毒性化合物，301 条边，图中棱形节点代表川楝子毒性成分，方形节点代表川楝子毒性成分致肝脏毒性潜在作用靶点。节点的degree 值代表与该节点相连的边的数量，节点的大小与其degree值呈正比，该网络中degree＞2 倍中位数即degree＞2 的靶点有CES2、HSD11B1、MDM2、SYK、MAPK14、髓样细胞白血病蛋白1（MCL1）、表皮生长因子受体（EGFR）、磷脂酰肌醇激酶-3 催化亚单位α 基因（PIK3CA）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。

图3 川楝子“毒性成分–肝脏潜在作用靶点”网络图Fig.3 Network diagram of “toxic constituents-potential liver targets” of Toosendan Fructus

2.4 川楝子致肝脏毒性潜在作用靶点的PPI 网络的构建

将筛选出的川楝子肝脏毒性103 个潜在作用靶点导入STRING 数据库在线分析，将分析结果数据导入Cytocape 3.8.2 软件中构建PPI 网络，见图4。该网络中共有96 个节点，1 652 条边，网络中degree排名前10 位的靶点为热休克蛋白90α 家族A 类成员1（HSP90AA1）、MAPK3、转录因子AP-1（JUN）、EGFR、MAPK1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、PIK3CA、肿瘤坏死因子（TNF）、雌激素受体α（ESR1）、MAPK8，见表3。

图4 川楝子致肝毒性潜在作用靶点PPI 网络Fig.4 PPI network of potential targets of Toosendan Fructus hepatotoxicity

表3 PPI 网络中毒性潜在作用靶点degree 值排名前10 位的靶点Table 3 Top 10 targets in the PPI network in terms of degree value for toxicity potential effect targets

2.5 川楝子致肝毒性潜在靶点的GO、KEGG 富集分析

川楝子致肝毒性的103 个潜在毒性靶点在GO富集分析（P＜0.05），其中生物功能（BP）共富集394 个条目，前20 个条目涉及凋亡过程的负调控、对激酶活性的正向调控、蛋白质磷酸化、基因表达的正向调节、MAPK 级联的正调节、对MAP 激酶活性的正向调节等过程；细胞组分（CC）共富集60个条目，前20 个条目涉及受体复合体、胞质、核质体、浆膜、大分子复合体、内质网腔体等部位；分子功能（MF）共富集108 个条目，前20 个条目包括蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酸激酶活性、ATP 结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、酶结合等功能，见图5。川楝子致肝毒性的103 个潜在靶点在KEGG 富集中共富集到154 条信号通路，前20 条通路包括癌症通路、前列腺癌通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抗性、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路、卡波西肉瘤相关的疱疹病毒感染、乙型肝炎、癌症中的碳代谢、催乳素信号通路、白细胞介素-17（IL-17）信号传导等通路，见图5。

图5 川楝子致肝毒性潜在作用靶点GO 和KEGG 分析Fig.5 GO and KEGG analysis of potential targets of Toosendan Fructus hepatotoxicity

2.6 川楝子致肝毒性“毒性成分–潜在作用靶点–核心通路”网络的构建

以KEGG 富集分析中富集程度显著的通路构建川楝子致肝毒性“毒性成分–潜在作用靶点–核心通路”网络。该网络中共有128 个节点，1 004 条边，网络中四边形节点代表潜在作用靶点；圆形节点代表核心通路；棱形节点代表毒性成分，节点大小与其degree 值呈正比，见图6。

图6 川楝子致肝毒性“毒性成分–潜在作用靶点–核心通路”网络Fig.6 Toosendan Fructus hepatotoxicity “toxic component-potential target-core pathway” network

在“毒性成分–潜在毒性作用靶点–核心通路”网络中，毒性成分及degree 值见表4，网络中靶点degree 值排列在前10 位的靶点为MAPK1、MAPK3、PIK3CA、MAP2K1、EGFR、MAPK14、MAPK8、mTOR、MAPK10、JUN，见表5。

表4 关键毒性成分Table 4 Key toxicological components

表5 关键靶点Table 5 Key targets

2.7 分子对接

将“毒性成分–潜在毒性靶点–核心通路”网络中degree 值前5 位的靶点作为受体，得到受体靶点为MAPK1（degree＝21）、MAPK3（degree＝21）、PIK3CA（degree＝19）、MAPK8（degree＝18）、MAPK10（degree＝17），其PDB ID 分别是2y9q、4qtb、7jiu、2xrw、3oy1，并将与受体对应的毒性成分作为对接的配体，应用软件AutoDock 1.5.6 版进行分子对接，对接信息见表6。其中PIK3CA 和MAPK8 均分别与2 个毒性成分进行对接，5 个受体与trichilinin D 对接，以分子对接结合能作为评价对接结果验证的指标，在所有对接结果中，结合能均＜-1.5 kcal/mol（1 kcal＝4.2 kJ），表明关键毒性成分与关键靶点有较好的结合能力，可以在不需要外界能量的条件下进行对接。

表6 对接结合能Table 6 Docking binding energy

使用PyMOL 软件对对接结果进行可视化示例，图中主要显示为小分子配体和于其相结合的受体结合位点氨基酸，均选用棍状结构显示，见图7。

图7 核心节点对接结果的可视化处理Fig.7 Visualization of core node docking results

3 讨论

近年来，关于川楝子及其制剂肝毒性的文献报道越来越多，在动物实验、细胞实验、以及不同的炮制工艺等实验中均验证了川楝子具有肝毒性。乌日汉等[15]通过设计剂量差异验证了川楝子高剂量（2.571 4 g/kg）组导致小鼠肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）显著升高，肝细胞发生明显的水胀以及出现大小不同的水泡；中剂量组的甘油三酯（TG）显著升高，个别肝细胞发生水胀、胞质疏松，提示川楝子具有一定的肝脏毒性且毒性作用存在一定的剂量相关性，随剂量的增加而毒性增强。通过代谢组学验证了川楝子肝毒性机制可能与ABC 转运蛋白紊乱，氨基酸、嘌呤、嘧啶代谢有关[16]；刘伟等[17]和Yu 等[18]报道川楝子可能通过PI3K/Akt 信号、p53 信号和PTEN 信号3 种途径介导肝细胞凋亡而引起肝毒性；齐双岩等[19]报道川楝子的肝毒性机制可能与炎症因子有关。川楝子因其存在的肝脏毒性作用，导致其临床应用受到一定的限制。

本研究通过建立川楝子毒性成分–预测靶点、毒性成分–潜在作用靶点、蛋白质相互作用、生物功能和通路网络、毒性成分–潜在毒性作用靶点–核心通路网络以及分子对接技术探讨川楝子的肝毒性机制。本次筛选共得到6 个毒性相关成分，川楝素（toosendanin）、meliasenin B、trichilinin D、1-O-tigloy-1-O-debenzoylohchinal、丁烯酸内酯（butenolide）、5-羟甲基糠醛（5-hydxoy methylfurfural）。其中，对川楝素的肝毒性机制研究已有较多文献报道，目前已被报道的毒性机制包括（1）蛋白共价结合和修饰：Yu 等[12]的报道称，川楝素在体内的代谢途径主要是酯解和与氨基酸结合，川楝素被细胞色素P450 家族中的CYP3A4 酶激活后会生成顺丁烯-1,4-双环中间体，该中间体易与氨基酸中的氨基和谷胱甘肽发生加成反应，这可能是川楝素产生肝毒性的原因。（2）线粒体功能障碍：线粒体是合成能量物质ATP 的主要场所，ATP 在细胞的生长、繁殖、代谢过程中起着关键作用，Zhang等[20]的研究称，川楝素通过使线粒体发生功能障碍，使线粒体膜电位和细胞内ATP 水平降低，以及激活caspase-8、9、3，进而诱导大鼠原代肝细胞死亡。（3）细胞凋亡：细胞凋亡是由丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的激活所介导发生的，有报道称，MiRNAs 可能是反映川楝素致肝毒性的潜在毒理学标志物[17]。以此为依据，Zheng 等[21]分析川楝子水提物染毒小鼠外周血中的miRNAs 探讨川楝子致肝毒性机制，分析表明，川楝子诱导的肝脏毒性可能与细胞凋亡、细胞周期紊乱和线立体功能障碍有关。（4）氧化应激：齐双岩等[19]通过川楝子大鼠给药与正常大鼠肝组织进行比较发现，川楝子给药大鼠的肝组织中的超氧化物歧化酶（SOD）显著下降，丙二醛（MDA）显著上升，γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）显著上升，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）显著降低，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量升高，细胞间黏附分子-1（ICAM-1）阳性表达显著增强，提示川楝子的肝毒性机制可能与氧化应激和炎症反应有关。（5）溶酶体功能障碍：Luo 等[22]的研究报道称，川楝素通过抑制TFEB 介导的溶酶体功能障碍抑制自噬通量可能是导致肝脏毒性的机制。近期Chang等[23]的研究发现，肝细胞坏死、脂质代谢问题和线粒体功能障碍是川楝素致肝毒性的主要因素。除川楝素外，对其他毒性成分的机制研究较少，彭双清等[13]的研究报道称丁烯酸内酯可能导致粒细胞增加，血浆蛋白减少而引发肝损伤。El Bohi 等[14]的研究发现5-hydxoy methylfurfural 不仅会产生遗传毒性和细胞凋亡，还能抑制小鼠的抗氧化机制，从而改变肝脏的结构和功能。

关键靶点MAPK1、MAPK3、PIK3CA、MAPK8、MAPK10 涉及多条通路，其中MAPK1、MAPK3 和PIK3CA 均主要涉及PI3K/Akt 信号通路。PI3K/Akt信号通路可被细胞刺激或毒性损伤而激活，PI3K/Akt 通路与调控细胞生长增殖、细胞凋亡、代谢有关，PI3K 被激活后活化下游的Akt 磷酸化，进一步促进肝损伤[24-25]。MAPK3、MAPK1、MAPK8、MAPK10 均是MAPKs 家族的重要成员，在调控细胞生长、增殖、凋亡等生物过程中起着重要作用，倪佳等[26]通过克隆MAPK3 证明MAPK3 对肝、癌细胞的增殖、迁移以及侵袭具有促进作用。MAPK1与MAPK3 常共同组成MAPK1/3，研究表明，MAPK1/3 不仅与细胞的生理功能有关，还与细胞的生物过程（生长、增殖、分化、凋亡等）有关。MAPK8又称JNK1，Li 等[27]研究称，MAPK8（JNK1）在肝细胞癌中可以通过促进c-Myc 基因的表达和降低增值抑制因子p21 的表达来肿瘤的生长。MAPK10（JNK3）是多种生化信号的结合点，通过广泛影响细胞过程而在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用，Li 等[27]的研究报道称，MAPK10 的表达是肝癌病人生存的重要预后因素；Li 等[28]证实了Circ-0000515 通过降低MAPK10 的表达进而加重肝癌的恶性表达。PIK3CA 是PI3K 的α 亚基，是一种促癌基因[29]，近年来，研究发现PIK3CA 在肝癌、胃癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中发生突变，是目前发现的在促癌基因中发生突变频率最高的基因之一[30]。提示川楝子中毒性化合物可能通过对PI3K/Akt 信号通路中相关靶蛋白的调控而引发肝毒性。

分子对接验证选择5 个关键靶蛋白分别于对应的潜在毒性化合物进行分子对接，结果显示，川楝子潜在毒性成分川楝素、trichilinin D、1-O-tigloy-1-O-debenzoylohchinal 与MAPK1、MAPK3、PIK3CA、MAPK8、MAPK10 具有较好的结合能力，结合文献对川楝子肝毒性和毒性成分的研究以及部分机制研究，提示网络药理学与分子对接预测川楝子致肝毒性的可靠性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突