瞬时受体电位离子通道TRPA1 和TRPV4 在骨关节炎中的研究进展*

廖志东曾道福 陈业平韦桂政吕维加陈 炎△

（1 广西医科大学第一附属医院骨关节外科，南宁 530021；2 广西医科大学再生医学与医用生物资源开发应用省部共建协同创新中心，南宁 530021；3 香港大学李嘉诚医学院矫形及创伤外科学系，香港 999077）

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是最常见的关节炎形式，会导致关节僵硬、慢性关节疼痛和身体残疾，严重影响病人的生活质量。全球有超过3.03 亿例髋关节和膝关节OA 病例，在中国OA 患病率高达8.1%，OA 已成为一个严重的健康问题[1,2]。由于遗传因素、年龄、性别、生物力学因素和肥胖等因素的影响，OA 发病率不断上升，造成了巨大的社会经济负担[3]。OA 的发病机制尚不明确，但许多研究表明OA 的病理变化涉及整个关节，其中包括关节软骨退化、慢性滑膜炎症和软骨下骨硬化。同时，关节组织病理改变会导致促炎症因子的产生，这会进一步刺激伤害感受器，从而产生痛觉过敏[4]。目前，OA 的治疗包括非药物治疗措施（病人教育、物理治疗、体重控制和手术）和药物治疗，以缓解疼痛、控制症状和改善关节功能为主要目的。非甾体抗炎药、阿片类药物等药物发挥着关键作用，但长期使用这些药物会引起严重不良反应并且镇痛效果有限[5]。膝关节置换是治疗OA 的一种重要方法，能有效缓解膝关节疼痛、恢复关节功能和改善病人的生活质量。但是晚期膝关节OA 病人必须承担关节置换手术的高费用和高风险[6]。因此，迫切需要一种治疗OA 的新策略。

近年来，越来越多的研究表明瞬时受体电位阳离子通道(transient receptor potential cation channel, TRP)在关节中发挥抗炎和镇痛作用，同时参与维持关节的正常生理功能。随着研究的不断深入，已经发现瞬时受体电位锚蛋白1 (transient receptor potential ankyrin-1, TRPA1)和瞬时受体电位香草素受体4 (transient receptor potential vanilloid-4, TRPV4)作为化学、炎症性和神经病理性疼痛信号的重要转导器，在各种神经元、非神经元组织和器官中表达，包括软骨细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)。最近，TRPA1 和TRPV4 通道的功能变化被认为是OA 的危险因素，其表达和功能异常会引起细胞坏死和凋亡、软骨细胞外基质降解、滑膜炎症反应和痛觉过敏[7～10]，提示TRPA1 和TRPV4 在OA 疼痛的产生以及疾病进展中发挥重要作用。因此，TRPA1 和TRPV4 有望成为治疗OA 的新型治疗靶点，研究其在OA 中的作用机制，并寻找TRPA1 和TRPV4 相关药物抑制OA 疼痛和结构破坏，对OA 的治疗具有重要意义。本文总结了TRPA1 和TRPV4 在OA 中对软骨、滑膜和疼痛的作用，以及TRPA1 和TRPV4 通道相关药物在OA 治疗中的进展，为今后临床治疗OA 提供新的见解和思路。

一、TRPA1 和TRPV4 通道概述

TRP 蛋白家族是一类位于细胞膜上的非选择性门控阳离子通道，参与转运Ca2+、Na+、K+和Mg2+等离子。TRP 家族由28 个成员组成，根据氨基酸序列的同源性可将其分为7 个亚家族，其中包括TRPA(ankyrin)、TRPC (canonical)、TRPM (melastatin)、TRPML (mucolipin)、TRPP (polycystin)、TRPV(vanilloid) 和TRPN (nomp C-like)。TRP 通道的表达广泛且分布于果蝇、蠕虫、小鼠和人类，但未在哺乳动物中发现TRPN 通道的表达[11]。TRPA1 是TRPA亚家族的唯一成员，通常以6 个跨膜结构域的同源四聚体发挥作用，在其N 末端结构域中存在大量的锚蛋白重复序列。TRPA1 激动剂可与其N 末端锚蛋白重复序列的半胱氨酸残基结合，导致这些半胱氨酸残基之间形成二硫键，从而触发N 末端构象变化和TRPA1 通道的开放，因此这些重复序列为寻找TRPA1 相关疾病的治疗靶点提供了重要线索[12]。TRPA1 可以感受冷 (< 17℃)、热、机械刺激、异硫氰酸丙烯酯(allyl isothiocyanate, AITC)和薄荷醇等伤害性刺激，同时还参与血管扩张、氧化应激以及神经源性炎症的发生[13]。其中低浓度的薄荷醇可以激活TRPA1，高浓度则抑制TRPA1[14]。此外，TRPA1 基因变异还与几种人类疾病的发生有关，包括家族性发作性疼痛综合征、哮喘和咳嗽[15]。TRPV4 是TRPV 亚家族的成员之一，由S1至S6的6 次跨膜结构域组成的四聚体结构，其C 端和N 端均位于细胞膜内，可以被多种刺激激活，包括低渗、热、PH、机械刺激、花生四烯酸代谢物和佛波醇衍生物。其中，蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)和蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)可以介导TRPV4通道的磷酸化，增强TRPV4 通道功能的表达[16]。TRPV4 还参与骨骼发育不良疾病、热痛觉过敏、哮喘和神经病理性疼痛等疾病的发生[17]。敲除TRPV4 基因的小鼠表现出高渗刺激引起的伤害性行为减少、有害压力刺激的敏感性降低以及逃逸到温暖表面的潜伏期延长[18]。此外，TRPV4 和TRPA1通道在DRG 和三叉神经节的感觉神经中共定位表达，参与炎症和神经病理性疼痛的发生[19]。TRPA1或TRPV4 通道可以通过调节细胞内外Ca2+浓度和胞内Ca2+信号通路的改变，从而调控细胞的增殖、凋亡及细胞因子分泌。同时，TRPA1 和TRPV4 通道还参与介导OA 引起的热和机械性疼痛过敏，在不同的细胞和信号通路中都发挥着关键的作用。

二、TRPA1 和TRPV4 通道在OA 发病和疼痛中的作用

OA 被认为是一种长期关节磨损的疾病，其中软骨细胞是OA 发病机制中主要参与者。滑膜和软骨下骨产生的炎症介质会诱导软骨退化，加重OA的结构损伤。通常情况下，OA 疼痛通常与病人的关节损伤有关。除关节软骨外，受损或发炎的关节组织会引发外周和中枢神经致敏，是导致OA 疼痛的主要因素。尽管目前OA 痛觉过敏的机制尚不清楚，但TRPA1 和TRPV4 通道作为关节生物力学信号和神经纤维的传感器，可以通过调节其活性以响应关节腔炎症微环境的刺激，从而介导疼痛的产生。因此，深入了解TRPA1 和TRPV4 通道在OA 发病和疼痛方面的作用，将有助于OA 的诊断和治疗。

1.在软骨中的作用

TRP 通道在软骨发育和稳态中起着关键的调节作用。Ca2+作为细胞内的第二信使，与软骨细胞的存活和功能表达有关。在人OA 软骨细胞中，炎症因子如白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 可以促进TRPA1 mRNA、蛋白质的表达以及通道的开放，这会引起大量Ca2+流入细胞，但由于胞内钙超负荷和线粒体功能障碍最终导致软骨细胞凋亡[14,20]。TRPV4 通道的激活可以通过Ca2+/钙调蛋白 (calmodulin, CaM)信号通路促进软骨标志物SRY 盒子转录因子9 (SRY-related high mobility group-box 9,Sox9)、聚集蛋白聚糖 (aggrecan, ACAN) 和蛋白胶原II (collagen II, COL-II) 的表达[21]。SOX9 在软骨细胞的形成、分化以及功能维持过程中发挥重要作用，因此TRPV4 作为软骨生成的关键调节因子。更好了解TRP 通道活性在软骨细胞凋亡中的作用机制，对于开发新型的OA 靶向疗法具有重要意义。

软骨退化是OA 的特征性改变，主要由于受累关节中软骨细胞外基质的合成、分解代谢和炎症因子分泌异常所致。软骨细胞产生的炎症因子促进基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和其他促炎症因子的产生，其中IL-1β、IL-6 和TNF-α等炎症因子是OA 引起软骨退化的关键介质。研究表明TRPV4 通道的激活可以通过激活CaMKK/AMPK/NF-κB 通路来抑制OA 的炎症反应，并保护IL-1β 诱导的软骨细胞免于损伤[22]。IL-6 在OA 的发生和发展中发挥着至关重要的作用，TRPA1 通道在OA 软骨细胞中表达增加与软骨细胞中IL-6 的产生有关[23]。在TRPA1 基因敲除的小鼠软骨细胞中成纤维细胞生长因子2 (fibroblast growth factor 2,FGF-2) 的表达减少[24]。FGF-2 是成纤维细胞生长因子成员之一，其在软骨细胞中的表达上调可促进细胞外基质降解酶MMP-1 和MMP-13 的产生，降低ACAN 和COL-II 的表达[24]，这表明TRPA1 的激活被认为是OA 的一个危险因素，是引起关节炎症和细胞外基质降解的重要原因。

生物力学因素在OA 发病机制中起着关键作用，尤其是机械应力。TRPV4 通道作为软骨细胞渗透压和机械刺激的传感器，通过改变信号级联途径的活动从而调控软骨细胞外基质代谢和软骨发育。有害的机械刺激会导致机械敏感离子通道的异常活动，这可能会加速软骨细胞退化。在关节软骨细胞中TRPV4基因的敲除与年龄相关的OA 严重程度有关[25]。分化抗原44 (cluster of differentiation 44, CD44)作为一种透明质酸的跨膜蛋白受体，参与维持透明质酸的正常生理功能，在防止关节软骨细胞外基质降解和润滑关节上发挥着重要作用。过度的循环拉伸应变会促进解整合素金属蛋白酶10 的表达，进而增加CD44 的裂解，导致关节软骨细胞外基质的分解代谢[26]。循环拉伸形式的机械负荷可以激活关节软骨细胞中的TRPV4 通道，从而抑制IL-1β 诱导的一氧化氮(nitric oxide, NO)和前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2) 释放[27]。炎性介质，如NO 和PGE2 的产生会导致OA 软骨变性，因此TRPV4 在软骨细胞炎症信号转导中发挥重要的调节作用。

2.在滑膜中的作用

在OA 中成纤维细胞样滑膜细胞 (fibroblast-like synoviocyte, FLS) 分泌的因子，其中包括TNF-α、IL-1β 和MMPs，会加剧滑膜和软骨的炎症反应。研究表明，在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的人OA-FLS 中抑制TRPA1 的基因表达可以下调IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-1 和MMP-3 的 表 达，从而减少OA 滑膜炎症和软骨变性[28]。此外，炎症因子也可以促进TRPA1 通道功能的表达，形成恶性循环，加速OA 的发展[28]。在细胞因子TNF 诱导的滑膜成纤维细胞中激活TRPA1 通道会增加细胞内Ca2+浓度，导致细胞活力下降或死亡[29]。值得注意的是，在较低浓度范围内TRPA1 激动剂可以靶向TNF 诱导的滑膜成纤维细胞并促进其死亡[29]。因此，TRPA1 对滑膜炎起重要的调节作用，具有潜在的治疗价值。

在免疫细胞中TRPV4 通道的活性与OA 炎症反应密切相关。其中，巨噬细胞是人体滑膜免疫系统的重要组成部分。在不同的刺激作用下，巨噬细胞可极化成经典活化型（M1 型）巨噬细胞和选择活化型（M2 型）巨噬细胞。一般情况下，M1 巨噬细胞具有加重炎症反应和清除凋亡细胞的作用，而M2 巨噬细胞则具有抗炎和促进组织修复的作用。研究表明，M1 巨噬细胞被认为是OA 组织病理改变的主要原因，其中包括骨赘生成和滑膜炎[30]。在巨噬细胞中TRPV4 通道的激活可以影响巨噬细胞的极化并调节机体的免疫反应。滑膜细胞中TRPV4通道的激活导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，在OA 中ROS 会氧化蛋白质和脂质成分并引起滑膜细胞凋亡，同时ROS 生成过多会促进白介素和MMPs 的产生从而加速细胞外基质的降解[31]。Sun 等[31]研究表明，在大鼠OA 模型中抑制TRPV4可以有效缓解软骨损伤、滑膜炎和骨赘形成，还能降低滑膜中M1 巨噬细胞的数量，在体外研究中还发现阻断RAW264.7 细胞中的TRPV4 通道可以抑制ROS/NLRP3 信号通路，从而降低M1 巨噬细胞的极化来抑制OA 的进展。此外，激活经典瞬时受体电位通道5 (transient receptor potential canonical-5,TRPC5)可以通过调节Akt/IκB/NF-κB 信号通路来抑制M1 巨噬细胞的极化[32]，这表明TRPC5 在巨噬细胞中具有一定的调控作用。然而，目前尚未有研究报道TRPC5 对OA 巨噬细胞的影响。在未来的研究应进一步阐明在OA 病人滑膜中其他TRP 通道对巨噬细胞的作用，这有助于更全面地了解靶向TRP通道对OA 治疗的效果。

3.在OA 疼痛中的作用

OA 疼痛是一个复杂的病理过程，涉及关节病变部位的软骨、滑膜、软骨下骨以及外周和中枢神经系统的结构或功能改变。在正常情况下，关节软骨是没有神经和血管分布的。然而，在OA 中软骨细胞分泌炎症因子和血管生成因子，导致血管生成和感觉神经的生长，最终导致OA 疼痛的发生。Bacon 等[33]研究发现滑膜炎的变化介导关节软骨厚度减少和OA 之间的联系，并且在2 年内关节软骨每减少0.1 mm 会引起西安大略和麦克马斯特大学(Western Ontario and McMaster universities, WOMAC)OA 疼痛评分增加0.32。在OA 发生和发展过程中，血管和神经的生长通常是相互伴随的，因此应该将OA 中的血管生成与关节疼痛联系起来。此外，一些炎症介质（如IL-1、IL-6 和TNF-α）会导致外周痛觉过敏，从而降低伤害性感受器的阈值。同时，在DRG 中一些离子通道的表达（如TRPA1、TRPV4），其激活可导致疼痛相关物质如降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)、神经生长因子和P 物质等释放，诱发疼痛过敏[19,34]。大量神经肽从感觉神经末梢会释放到关节腔中，会增强血管生成和炎症反应。软骨下骨中异常的骨重塑与骨硬化、血管生成以及感觉神经支配有关，可以导致软骨破坏和疼痛[35]。神经支配异常也是引起OA 持续疼痛的主要原因。当关节传入神经元持续受到伤害性信号刺激时，脊髓背角神经元的功能发生改变从而产生疼痛超敏反应，最终产生中枢敏化。总之，OA疼痛的发生和发展不仅与关节组织病变有关，还与外周和中枢敏化相关（见图1）。

图1 TRPA1 和TRPV4 通道在骨关节炎痛觉敏化中的作用机制图

TRPA1 和TRPV4 通道可以在感觉神经系统中表达，作为伤害性化学感受器介导痛觉过敏和神经源性炎症。在OA 动物模型中TRPA1 的激活可以增强脊髓背角伤害性神经元的机械超敏反应，这表明TRPA1 被机械刺激和炎症因子激活，并在OA 疼痛中起着至关重要的作用[36]。研究表明，膝OA 病人对外界环境温度变化或者冷刺激的敏感性远高于正常人，并且低温环境易导致膝关节肌肉收缩和血管痉挛，进而诱发或加重关节疼痛，提示OA 病人存在冷痛觉过敏[7]。邢润麟等[37]的动物实验证实了膝关节OA 大鼠的冷刺激疼痛阈值明显下降，在特异性阻断TRPA1、TRPM8 通道时，冷刺激疼痛阈值会出现相应的提高，提示TRPA1 和TRPM8 通道蛋白的表达及开放水平与OA 的冷痛觉过敏存在关联。在碘乙酸钠 (monosodium iodoacetate, MIA) 诱导的大鼠膝关节OA 中TRPV4 在DRG 神经元中的磷酸化增加，同时其内源性配体5,6-环氧二十碳三烯酸的表达也升高[9]。在MIA 诱导的OA 中，敲除TRPV4 基因的大鼠在37℃刺激下DRG 神经元动作电位数量减少且未观察到OA 疼痛的相关行为，TRPV4 拮抗剂可以抑制OA 大鼠的DRG 神经元动作电位频率增加[38]。然而，敲除TRPV4 基因的大鼠和野生型大鼠的滑膜炎和软骨损伤程度相同，这表明敲除TRPV4 基因的OA 大鼠疼痛减轻的主要原因在于抑制了DRG 神经元的去极化作用，而不是OA 引起的膝关节损伤或炎症减轻所致的[38]。综上所述，这些研究结果都证明了TRPA1 和TRPV4 通道在伤害感受器和中枢神经敏化方面起着重要作用。

三、TRPA1 和TRPV4 通道药物在OA 治疗中的进展

随着对TRP 通道在OA 中作用机制认识的不断深入，TRPA1 和TRPV4 通道相关靶点药物在治疗OA 的研究也逐渐兴起，为新药研究提供理论支持。目前，大量研究发现TRPA1 和TRPV4 通道相关药物主要是通过抑制OA 炎症反应、软骨退化和缓解OA疼痛的方式来延缓OA 疾病的进展和症状（见表1）。

1.抑制OA 炎症反应和软骨退化

TRPA1 和TRPV4 已被确定在人OA 软骨细胞和FLS 中功能性表达，参与调节滑膜炎症和软骨退化[8,39]。Yin 等[28]研究表明，TRPA1 拮抗剂Chembridge-5861526 (CHEM) 通过抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-1 和MMP-3 的 产 生 来 降 低LPS 处 理的OA-FLS 的炎症反应，从而抑制滑膜炎和软骨退化。TRPM8 和TRPA1 激动剂薄荷醇促进软骨细胞中MMP-1、MMP-3 和MMP-13 的表达，表明该效应少部分是通过TRPA1 通道的激活所介导的[14]。异硫氰酸烯丙酯(allylisothiocyanate, AITC)是一种TRPA1 的激动剂，在较软的水凝胶上AITC 激活软骨细胞中的TRPA1 通道，既可以促进II 型胶原、pSOX9 和IL-10 的表达，同时也会导致IL-6 表达的增加，对关节软骨的形成具有双向调控作用[40]。而在较硬的塑料培养板中培养时，AITC 治疗的有害影响会增强，而积极作用则减少，表明AITC 治疗或TRPA1 激活所发挥的积极作用取决于软骨细胞生长的基质弹性的改变[40]。在OA 的进展过程中，细胞外基质弹性对细胞的合成代谢的调节作用可能是由TRPV4 的活性介导的。与正常水凝胶上的细胞相比，在模拟OA 和严重OA 水凝胶上的软骨细胞合成代谢下降，而用GSK101（TRPV4 激动剂）处理细胞则消除了这种细胞对基质弹性的反应[39]。在MIA诱导的OA 大鼠模型中TRPA1 拮抗剂ALGX-XC20治疗组的软骨损伤的组织学评分显著改善，减少了MIA 引起的关节软骨损伤，这表明ALGX-XC20 对关节软骨具有保护作用[41]。在OA 中关节内给予选择性TRPV4 拮抗剂HC067047 可以减少软骨细胞外基质的丢失、软骨的磨损以及骨赘的形成[31]，这是由于通过抑制TRPV4 可以减少M1 巨噬细胞的浸润从而减轻滑膜炎症和软骨退化。在成年小鼠的软骨细胞中敲除TRPV4 基因降低了关节滑膜炎、骨总量和关节骨赘的形成[25]。在大鼠OA 前交叉韧带横断模型中TRPV4 抑制剂GSK2193874 抑制钙调蛋白和caspase-8的上调以及软骨细胞的凋亡[42]。然而，有研究表明敲除TRPV4 基因可以加速OA 衰老和肥胖动物模型中OA 的进程，这表明TRPV4 在软骨的正常生长发育中起着关键作用[43,44]。关节内注射TRPV4 激动剂喹唑啉-4(3H)-酮衍生物36·氯化氢(quinazolin-4(3H)-one derivative 36·HCl, 36·HCl) 可以增强OA 大鼠关节软骨中ACAN 和SOX9 mRNA的表达，表明36·HCl 促进软骨细胞合成代谢从而抑制OA 的进展[45]。此外，TRPV4 激活剂4α-佛波醇12,13-二癸酸酯 (4α-PDD) 作用于关节炎滑膜细胞以抑制炎性细胞因子的产生，有助于预防OA 的发生或进一步恶化[46]。

2.缓解OA 疼痛

目前，有许多TRPA1 和TRPV4 通道相关药物在OA 动物模型中进行了测试，这些药物表现出了良好的镇痛效果。在OA 和OA 对照组的大鼠中，静脉注射选择性TRPA1 受体拮抗剂A-967079 降低脊髓广动力范围(wide dynamic range, WDR)神经元对膝关节高强度机械刺激的反应，提示在正常和病理条件下TRPA1 受体在向脊髓传输有害机械信号方面发挥着重要作用[47]。在另一项研究中，与MIA治疗组相比，口服TRPA1 拮抗剂ALGX-XC20 治疗14 天后大鼠OA 诱发的后肢负重不均有所改善[41]，这些数据表明ALGX-XC20 对TRPA1 的药理学抑制在OA 模型中产生积极的镇痛作用，可作为治疗OA 疼痛的新型镇痛药物。关节内注射TRPV4 拮抗剂RN-1734 减少了正常关节中的C 纤维对有害性机械刺激的反应，同时也可以降低在急性炎症性关节中致敏C 纤维对无害和有害性机械刺激的反应，这表明在传入神经上的TRPV4 通道可能与OA 机械性痛觉过敏有关[48]。此外，TRPV4 拮抗剂HC067047 和GSK2193874 部分逆转了大鼠OA 模型中握力的降低[9]。在OA 中病变滑膜组织TRPA1和TRPV4 的表达显著上调，选择性TRPA1 拮抗剂TCS5861528 和TRPV4 拮抗剂GSK2193874 可以有效提高OA 引起的机械撤退阈值，提示TRPA1 和TRPV4 的表达与OA 机械性痛觉过敏的发生机制密切有关[10]。因此，TRPA1 和TRPV4 是缓解OA 疼痛的潜在治疗靶点。

四、结论和展望

TRPA1 和TRPV4 离子通道广泛分布于机体内，其异常表达与OA 疾病的发展密切相关。抑制TRPA1和TRPV4 的表达或活性不仅可以抑制OA 引起的炎症反应，还可以缓解疼痛，为治疗OA 提供了新的见解。目前针对TRPA1 和TRPV4 通道在OA 领域的研究仍然不充分，一些重要的问题仍需要更多的研究进行阐明和验证。首先，作为非选择性阳离子通道，TRPA1 和TRPV4 通道除了介导Ca2+还可以参与Na+和 K+等离子的转运。因此，未来应该阐明TRPA1 和TRPV4 通道在OA 疼痛或发病机制中介导Na+和 K+流动的作用。其次，OA 疼痛所引起的机械性和热痛觉过敏可能并非是由单一的机制所导致的，痛觉过敏的产生和维持过程也可能是由一种或者几种TRP 通道共同参与的。虽然已有大量关于TRPA1 和TRPV4 通道在OA 疼痛中的研究，但仍有许多其他TRP 通道尚未涉及，其具体的作用机制还需进一步的研究。未来使用高通量测序等先进的检测和分析技术也是必不可少的。最后，由于TRPA1 和TRPV4 在关节中不同类型细胞中的调控机制不同，口服TRPA1 或TRPV4 通道的药物在缓解OA 的同时常出现诸多药物不良反应和药代动力学并发症，如何精确调控TRPA1 和TRPV4 通道的变化显得尤为重要。此外，靶向TRPA1 或TRPV4通道药物在OA 动物模型与实际临床疾病中的应用也是有差异的，未来还需进行大量基础实验和临床试验来保证其安全性和有效性。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。