轮作模式对冬小麦土壤氨氧化微生物群落多样性和组成的影响

侯喜庆,禹桃兵,王培欣,臧华栋,曾昭海,杨亚东

中国农业大学农学院,农业农村部农作制度重点实验室,北京 100193

华北平原是我国重要的粮食生产基地,集约化的冬小麦-夏玉米种植模式需要投入大量水肥资源来维持作物产量,引发了肥料利用率降低、温室气体排放加剧等农业生态环境问题[1]。由于温室气体排放的不断加剧,导致了极端天气频发,对农业生产造成了巨大的潜在威胁[2]。同时,农业生产又是环境温室气体产生的重要部分,来源于农田的氧化亚氮(N2O)排放约占全球人类活动N2O总排放的50%[3]。农田土壤的N2O排放主要由反硝化作用和硝化作用等途径产生,且施用氮肥会促进土壤N2O的产生和排放[4—5]。因此,农业生产中温室气体减排及其微生物调控成为农业绿色可持续发展和缓解气候变化的热点问题。

作为农田管理的重要措施,灌溉[10]、施肥制度[11]和种植制度[12—13]等均会引起氨氧化微生物群落组成和结构的变化。有研究表明,长期施肥增加了AOA群落泉古菌门(Crenarchaeota)和AOB群落硝化螺旋菌属(Nitrosospira)的相对丰度[14];而杨亚东等[15]的研究发现增施氮肥仅提高了AOB数量,对AOA数量没有显著影响。此外,Song等[16]发现种植模式影响氨氧化微生物群落组成,并且玉米根际土壤中AOB群落组成与蚕豆根际土壤中不同。Wattenburger等[12]发现玉米-大豆轮作土壤的AOB丰度高于其他轮作土壤,并在根际和非根际土壤中发现存在生态位分化现象。因此,不同作物种植历史及当前作物的根际效应均会对氨氧化微生物群落产生影响,引起氨氧化微生物群落组成和多样性发生改变。

研究表明,长期豆科作物与禾本科作物轮作不仅能够提高或维持作物产量,还能提高土壤微生物的群落多样性[17]。但豆科作物轮作对后茬作物土壤中氨氧化微生物群落的影响及其受后茬作物的根际调控机制尚不清楚。因此,本研究基于豆科作物与冬小麦轮作定位试验,测定了4种豆禾轮作模式及常规麦玉模式中冬小麦根际和非根际土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌群落组成和多样性,为华北平原豆禾轮作种植制度优化及温室气体减排提供微生物调控方面的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

田间定位试验起始于2016年6月,在河北省沧州市吴桥县中国农业大学吴桥实验站基地(37°41′N,116°36′E)进行。该地区位于黑龙港流域中部,属于暖温带半湿润大陆性季风气候,日照充足,年均降雨量562 mm,年均气温12.6 ℃,全年积温(≥0 ℃)为4826 ℃,无霜期为201 d。供试土壤为中壤质潮土,试验开始前0—20 cm土层土壤基础养分为:有机质16.09 g/kg,全氮1.02 g/kg,速效磷20.31 mg/kg,速效钾87.49 mg/kg,土壤pH值为8.0。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计,设置5种轮作种植模式,分别为夏红小豆-冬小麦(AW)、夏绿豆-冬小麦(MW)、夏花生-冬小麦(PW)、夏大豆-冬小麦(SW)和夏玉米-冬小麦(CW)轮作种植模式,其中CW作为对照。试验田自建立以来未改变种植模式。每种种植模式3次重复,共15个小区,小区面积为52 m2(8 m × 6.5 m)。

供试作物品种分别为红小豆“白红7号”、绿豆“白绿8号”、花生“豫花9719”、大豆“中黄35”、玉米“郑单958”和小麦“济麦22”。夏季作物于2018年6月15号播种,玉米采用机械播种,行距60 cm,株距22 cm;豆科作物采用人工播种,行距40 cm,株距15 cm。冬小麦于2018年10月20日播种,行距12 cm,播量为300 kg/hm2。为发挥豆禾轮作模式的氮效应作用,试验期间所有作物均采用不施肥管理。夏季作物播种前浇底墒水60 mm,生育期不再进行灌溉。冬小麦播种前浇底墒水60 mm,拔节期灌溉60 mm。豆科作物出苗后进行间苗,定期进行中耕除草和病虫害防治,其他农事管理根据生产实际需求操作。

1.3 土壤样品采集及土壤理化性质测定

于2019年4月23日冬小麦拔节期采集冬小麦根际和非根际土壤样品。采用抖土法收集冬小麦根际土壤,每个小区随机取20—30株冬小麦,整株拔出后轻轻抖动根部,抖落的土壤作为非根际土,随后用细毛刷将根系表面的土壤扫下来作为根际土。土壤样品装于封口袋中,封口时将空气排净,迅速放入装有干冰的保温箱内带回实验室。用无菌镊子除去碎石和细根等杂物后过2 mm筛,将土壤样品分成两部分,一部分自然风干,用于理化性质测定;另一部分放入-80 ℃冰箱保存,用于DNA提取。

土壤理化性质测定参照鲍士旦《土壤农化分析》[18]进行。土壤pH采用电位法测定(土∶水=1∶2.5),土壤有机碳采用重铬酸钾容量法测定,全氮采用半微量凯氏定氮法测定,速效磷采用碳酸氢钠提取法,速效钾采用原子吸收分光光度法,铵态氮和硝态氮用2 mol/L CaCl2溶液浸提,用流动分析仪测定。

1.4 土壤DNA提取及amoA基因的扩增

用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit For Soil(Omega,美国)试剂盒提取土壤总DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA,并用NANO Quant(Tecan,瑞士)检测DNA的浓度和纯度。选用引物Arch-amoAF(5′-STA ATG GTC TGG CTT AGA CG-3′)/Arch-amoAR(5′-GCG GCC ATC CAT CTG TAT GT-3′)[19]和amoA-1F(5′-GGG GTT TCT ACT GGT GGT-3′)/amoA-2R(5′-CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC-3′)[20]分别扩增AOA和AOB的aomA基因。聚合酶链式反应基因扩增(PCR)扩增体系为50 μL:5.0 μL 10 ×ExTaq缓冲液、4.0 μL dNTP、1.0 μL上游引物(10 μM)、1.0 μL下游引物(10 μM)、0.5 μLExTaqDNA聚合酶和2.0 μL DNA模板,最后加ddH2O至50 μL。PCR扩增条件为95 ℃预变性3 min,94 ℃变性45 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,循环35次。AOA和AOBaomA基因PCR扩增产物用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小和质量。

1.5 高通量测序及序列筛选

用NANO Quant(Tecan,瑞士)测定回收AOA和AOBaomA基因的PCR产物浓度,并将其稀释至同一浓度。采用Illumina MiSeq测序平台对AOA和AOBamoA基因进行双末端测序,由上海美吉生物医药科技有限公司完成。用QIIME软件1.8.0对不同样本AOA和AOBamoA基因测序的原始序列进行质控筛选,30个样本AOA和AOBamoA基因测序分别得到1518234和1383621条优化序列。根据标签和引物序列区分不同处理AOA和AOBamoA基因序列信息,利用UPARSE 7.0软件在97%相似水平下对操作分类单元(OTU)的代表序列进行聚类分析,利用基于核糖体数据库项目(RDP)的RDP-classifier贝叶斯算法在功能基因组数资源据库(FGR)中以97%的相似水平对AOA和AOBamoA基因的OTU代表序列进行注释。利用MOTHUR软件1.30.1按最小样本序列数(保留了在3个样本中序列数都≥5的OTU和序列数总和≥20的OTU)对各样本进行抽平分析[21]。经抽平后各样本分别得到25853条AOAamoA基因序列和29506条AOBamoA基因序列。以Shannon指数(多样性)、ACE指数和Chao1指数(丰富度)代表氨氧化微生物群落的Alpha多样性。

1.6 数据分析

对轮作模式和根际效应及其互作效应进行双因素方差分析,并用Duncan法对根际土和非根际土中不同轮作模式间的土壤理化性质和氨氧化微生物多样性及组成相对丰度差异显著性进行检验(P<0.05),所用软件为SPSS 25.0。群落Alpha多样性图和群落丰度图均由Origin 2021完成。利用主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)来分析不同处理微生物群落结构差异及其与土壤理化性质之间的关系,计算和作图用R 4.1.2中“vegan”包完成。

2 结果与分析

2.1 不同轮作模式冬小麦根际与非根际土壤理化性质

方差分析结果表明(表1),冬小麦根际和非根际土壤的理化性质存在显著差异,且轮作模式显著影响土壤理化性质,根际效应对土壤pH、有机碳、速效钾、铵态氮和硝态氮含量均有极显著影响(P<0.001)。根际土中,豆禾轮作(AW、MW、PW、SW)显著增加有机碳和硝态氮含量,但显著降低土壤pH(P<0.05)。豆禾轮作的土壤有机碳和硝态氮含量分别介于11.48—11.92 g/kg和1.78—3.96 mg/kg之间,而CW模式的有机碳和硝态氮含量分别为9.63 g/kg和0.38 mg/kg。MW模式的土壤速效钾和铵态氮含量均显著高于其他模式(P<0.05)。非根际土中,豆禾轮作显著增加土壤全氮和铵态氮含量,其中MW模式显著增加速效钾含量(P<0.05)。

表1 不同轮作模式冬小麦根际和非根际土壤理化性质

2.2 不同轮作模式冬小麦根际与非根际土壤氨氧化微生物群落Alpha多样性

方差分析表明(图1),除AOB群落的Shannon指数外,轮作模式对AOA和AOB群落的Alpha多样性均有显著影响(P<0.001),根际效应对AOA和AOB群落的Alpha多样性均有显著影响(P<0.05)。对于AOA群落而言(图1),根际土中,AW模式的Shannon指数最高,比CW模式高8.0%(P<0.05),而AW和MW模式的ACE指数比CW模式分别低11.9%和15.6%(P<0.05),且Chao1指数比CW模式分别低11.2%和16.1%(P<0.05)。非根际土中,Shannon指数与根际土中有相同趋势,AW模式最高,比MW和CW模式分别高16.4%和4.7%(P<0.05);AW和CW模式的ACE指数分别比MW和PW模式高14.5%—18.9%和11.9%—16.2%(P<0.05);AW和CW模式的Chao1指数比其他3种模式分别高11.7%—19.8%和8.3%—16.1%(P<0.05)。

图1 不同轮作模式冬小麦根际和非根际土氨氧化古菌和氨氧化细菌群落的Alpha多样性

对于AOB群落而言(图1),根际土中,CW模式的Shannon指数比其他模式高0.1%—5.7%;CW模式的ACE指数比AW、MW、PW和SW模式分别高29.3%、52.6%、16.0%和31.4%(P<0.05);CW模式的Chao1指数比其他模式高23.9%—48.4%,且AW、PW和SW模式的Chao1指数显著高于MW模式(P<0.05)。非根际土中,AW模式的Shannon指数比MW和PW模式分别高5.9%和6.6%(P<0.05),CW模式的Chao1指数比AW、PW和SW模式分别高15.8%、8.2%和10.0%(P<0.05)。

2.3 不同轮作模式冬小麦根际与非根际土壤氨氧化微生物群落组成

对AOA和AOBamoA基因序列进行OTU聚类分析后分别得到58和52个OTUs。根际土中AW、MW、PW、SW和CW模式分别获得55、55、55、54和57个AOAamoA基因OTUs以及39、42、43、38和47个AOBamoA基因OTUs;非根际土中AW、MW、PW、SW和CW模式分别获得56、50、53、56和57个AOAamoA基因OTUs以及39、40、38、40和42个AOBamoA基因OTUs。由图2所示,不同轮作模式AOA群落的优势类群主要由OTU57(Norank_Crenarchaeota)、OTU58(Norank_Crenarchaeota)和OTU59(Norank_Crenarchaeota)组成,其相对丰度分别为56.6%、15.4%和4.5%。根际土中,PW模式中AOA群落OTU57的相对丰度比CW模式低15.0%(P<0.05),而AW、MW、PW和SW模式中AOA群落OTU58的相对丰度比CW模式分别高70.2%、68.0%、109.3%和79.9%(P<0.05)。非根际土中,各轮作模式中AOA群落的优势类群及其相对丰度与根际土中相似,但仅OTU58和OTU5(Norank_Crenarchaeota)的相对丰度在不同轮作模式间存在显著差异,其中豆禾轮作模式中AOA群落OTU58和OTU5的相对丰度比CW模式分别高57.4%—90.8%和43.4%—134.7%(P<0.05)。

图2 不同轮作模式冬小麦根际和非根际土壤氨氧化古菌群落组成

如图3所示,AOB群落的优势类群主要由OTU143(Norank_AOB)、OTU139(Norank_AOB)、OTU3(Norank_Nitrosomonadales)、OTU52(Nitrosospira)、OTU56(Norank_Bacteria)、OTU22(Norank_AOB)、OTU95(Norank_Nitrosomonadales)、OTU153(Nitrosospira)和OTU76(Norank_Nitrosomonadales)组成,其相对丰度分别为13.8%、10.3%、8.9%、8.1%、6.5%、6.4%、6.2%、5.8%和4.9%。根际土中,AW模式中AOB群落OTU76的相对丰度比MW和CW模式分别高193.1%和372.1%(P<0.05),MW模式中AOB群落OTU95的相对丰度比SW模式高124.6%(P<0.05)。非根际土中,AW模式中AOB群落OTU76的相对丰度比SW和CW模式分别高192.0%和132.6%(P<0.05),MW模式中AOB群落OTU3的相对丰度比CW模式高161.6%(P<0.05)。

图3 不同轮作模式冬小麦根际和非根际土壤氨氧化细菌群落组成

2.4 不同轮作模式冬小麦根际与非根际氨氧化微生物群落Beta多样性及影响因素

主成分分析(PCA)结果如图4所示,根际土中主轴1(PC1)和主轴2(PC2)分别解释了72.1%和15.8%的AOA群落变异,以及34.4%和22.1%的AOB群落变异。非根际土中主轴1和主轴2分别解释了79.3%和8.8%的AOA群落变异,以及30.1%和20.5%的AOB群落变异。总的来看,不同轮作模式的AOA和AOB群落结构存在差异。其中,根际土中豆禾轮作模式的AOA和AOB群落与CW模式在主轴1和主轴2上有分离,而非根际土中豆禾轮作模式的AOB群落与CW模式在显著分离现象(P<0.05)。

图4 不同轮作模式冬小麦根际和非根际土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌群落的主成分分析

图5 不同轮作模式冬小麦根际和非根际土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌群落与环境因子的冗余分析

3 讨论

3.1 轮作模式对土壤养分的影响

本研究中,与麦玉轮作相比豆禾轮作增加了冬小麦根际土有机碳和硝态氮含量,但降低了土壤pH值,增加了非根际土全氮和铵态氮含量。有研究表明,将豆科作物掺入连续的禾本科作物轮作系统会增加表层土壤全氮、有机碳等养分含量[22—23]。豆科作物的秸秆C/N比较小,其残茬中的含氮量较非豆科作物(玉米)高,土壤氮素矿化程度更高,进而引起土壤中全氮含量的增加[22]。作物轮作影响土壤中碳循环过程,进而影响最终的土壤有机物(包括SOC)的形成。这是因为作物残茬、作物凋落叶以及根系分泌物为土壤提供较高的碳输入,进而导致有机碳含量的增加[23]。此外,豆科作物与禾本科长期轮作可以防止土壤疏水成分的过度降解,其机理是通过在土壤疏水结构域中掺入较不稳定的有机化合物保护其免受微生物的矿化作用,从而增加有机碳含量[24]。无机氮含量是体现土壤供氮能力大小的有效指标,豆科残茬能增加土壤无机氮并提高后茬作物的氮利用率[25]。豆禾轮作,尤其是AW和MW模式,土壤中铵态氮和硝态氮含量均高于麦玉轮作,表明其无机氮的比例高于麦玉轮作,这是由于豆科作物的固氮作用导致无机氮的积累、富氮残留物的矿化以及豆禾轮作过程中土壤累积了更多的矿物结合有机氮(MAOM-N),而MAOM-N是无机氮的重要来源[25—26]。结合来看,豆科作物加入轮作系统在上述情况下是可以增加土壤中养分含量的。

3.2 轮作模式对氨氧化微生物群落Alpha多样性和组成的影响

轮作模式中不同作物对土壤氨氧化微生物多样性和组成的影响不同,是由于不同作物的根系形态和根系分泌物有差异。有研究表明,种植玉米和种植大豆的土壤细菌群落有明显的差异,长期轮作也会导致这种差异[27]。前人利用OTU水平的物种组成来评估微生物群落组成的相对丰度和频率存在的差异,将其作为微生物群落结构和生理学之间的桥梁[28]。本研究也分析了不同种植模式下氨氧化微生物的OTU组成,发现不同轮作模式下AOA群落中占主导地位的OTUs属于泉古菌门(Crenarchaeota),AOB群落中占主导地位的OTUs属于亚硝化单胞菌目(Nitrosomonadales),并且在不同轮作模式下AOA和AOB群落OTUs的相对丰度是波动变化的,少数OTUs的相对丰度在不同轮作模式中表现出显著差异(图2和3)。这是由于作物会分泌不同的分泌物,招募了不同的微生物组[29],进而导致了轮作模式间氨氧化微生物群落组成的动态变化。

研究表明,豆科参与轮作系统会显著提高土壤微生物的多样性[17]。但在本研究中,豆禾轮作中夏绿豆-冬小麦模式根际和非根际土中AOA群落Alpha多样性指数均偏低,而其他豆禾轮作模式与夏玉米-冬小麦模式间没有明显差异,是因为轮作作物多样性低或轮作年限较短[30],不同豆科作物轮作模式间虽存在差异,但未体现出显著趋势。夏玉米-冬小麦模式中AOB群落ACE指数和Chao1指数高于其他轮作模式,说明夏玉米-冬小麦模式AOB群落多样性与豆禾轮作模式相似的情况下,其群落丰富度更高。有研究表明,与大豆根际土壤相比,玉米根际土壤有较高的微生物群落多样性,主要是因为豆科作物根部存在根瘤菌能够降低细菌的相对丰度[31]。另外,AOA和AOB群落的差异没有广泛反映在Shannon多样性和群落丰富度指标中,是由于这些指标不能完整地体现出微生物群落之间的差异[32]。

3.3 轮作模式对氨氧化微生物群落Beta多样性的影响

农田中AOA和AOB存在着生态位分化。有研究表明根际和非根际土壤的AOA和AOB群落存在差异,主要是因为作物根系活性和分泌物会造成根际和非根际土壤微环境的差异,进而驱动着土壤微生物群落的组装和系统发育[40]。本研究结果也表明AOA和AOB群落在根际和非根际土中存在差异,且其群落结构受到不同环境因素的影响。根际土壤中,AOA群落主要受土壤pH和有机碳的影响,而非根际土壤中AOA群落变化受有机碳和全氮驱动,说明在根际和非根际土壤中,每种生态位都有可能的独特作用[7]。不同轮作模式改变了冬小麦根际土和非根际土壤的有机碳、全氮和土壤pH,而这些因子也是影响AOA和AOB群落的重要因素[41],这进一步表明轮作模式中作物差异可以影响AOA和AOB的群落组成和结构。

4 结论

轮作模式驱动了冬小麦根际和非根际土壤中氨氧化微生物的群落组成及结构变化。豆禾轮作显著增加氨氧化古菌群落泉古菌门(Crenarchaeota)OTU58的相对丰度,夏红小豆-冬小麦和夏绿豆-冬小麦模式分别显著增加氨氧化细菌群落变形菌门(Proteobacteria)OTU76的相对丰度和OTU95、OTU3的相对丰度。根际土壤中土壤pH和有机碳含量增加是导致豆禾轮作模式与麦玉模式氨氧化古菌群落结构发生分离的重要环境驱动因子,而非根际土壤中全氮、铵态氮含量变化是引起豆禾轮作模式与麦玉模式氨氧化细菌群落结构发生分离的主要环境因子。综上所述,研究结果表明,豆禾轮作种植引起的土壤pH和速效氮含量变化驱动氨氧化古菌和氨氧化细菌群落结构发生演变,且根际与非根际土壤中氨氧化微生物存在生态位分离。