黄酮类化合物抗骨关节炎机制研究进展

杨泓毅，林龙飞，刘宇灵，李 慧,4,5*，黄璐琦

1. 江西中医药大学 院士工作站，江西 南昌 330004

2. 中国中医科学院中药资源中心，北京 100700

3. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700

4. 中国中医科学院中医药健康产业研究所，江西 南昌 330006

5. 江西中医药健康产业研究院，江西 南昌 330000

骨痹又称骨关节炎（osteoarthritis，OA），是一种常见退行性关节疾病，尤其多发于膝、髋、手和足等关节。中国目前骨关节炎患病率已达到每10 万人9 337.15 例，相较于1990 年的患病率，增长率达到了113.53%[1]，骨关节炎在不同程度上影响患者的生活质量，并具有高致残率的特点。目前产生骨关节炎的原因仍有待明确，多使用非甾体抗炎药及透明质酸制剂进行保守治疗，但现有的治疗方法无法逆转骨关节炎的发展。骨关节炎的发病可能与关节损伤、年龄、家族遗传、肥胖以及性别相关，是一种多因素导致的全关节疾病。与骨关节炎相关的病理检查结果包括关节软骨的破坏以及关节间隙狭窄、滑膜炎、软骨下骨硬化和囊肿形成[2]。随着中国老龄化程度的加深，未来骨关节炎患病人群将会不断增加。

黄酮类化合物是以色酮环和苯环为基本母核的一类化合物的总称，是广泛存在于植物内的次生代谢产物。现代药理学研究表明黄酮类化合物具有抗炎[3]、心脏保护作用[4]、抗癌[5]、抗菌[6]、抗抑郁[7]等多种药理作用。黄酮类化合物可以调节疾病过程中的各种分子靶点和信号通路，在预防和治疗骨关节炎中发挥积极作用。黄酮类化合物治疗骨关节炎的主要作用机制包括抑制炎症介质、抑制软骨降解和凋亡、促进软骨细胞增殖和基质合成以及调节氧化应激等。近年来黄酮类化合物抗骨关节炎的研究取得了一定进展，但仍需要更多的研究来充分证明黄酮类化合物在骨关节炎中的作用机制，并为其临床应用提供参考。

目前黄酮类化合物在骨关节炎发病机制及临床治疗中的作用和价值尚不明确，因此本文综述黄酮类化合物抗骨关节炎机制的研究进展，探讨其防治骨关节炎的潜力。

1 抑制炎症反应

骨关节炎患者经常出现滑膜炎的症状，表现为滑膜增生和滑膜内层低度炎症浸润以及血管的生成[8]。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6是骨关节炎出现的主要促炎细胞因子，在关节软骨退化的过程中起着重要作用[9-10]。IL-1β 由关节中软骨细胞、成骨细胞及脂肪细胞等多种细胞产生，可强烈诱导蛋白水解酶的表达和释放，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和聚集蛋白聚糖酶（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS）[11]。MMP-13 和ADAMTS-5 是2 种分别负责降解II 型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的关键分解代谢酶，目前认为ADAMTS-5 是治疗骨关节炎的突破口之一，ADAMTS-5 抑制剂GLPG1972/S201086 可显著且高选择性抑制大鼠和人ADAMTS-5[12]。而中药小分子成分是骨关节炎新药开发与研究的重要来源[13]。大多数黄酮类化合物可抑制关节软骨中促炎细胞因子诱导的MMPs 表达和分解代谢活性起到抗炎作用。

1.1 抑制NF-κB 通路

NF-κB 是人体中重要的炎症信号传递的转录因子，在骨关节炎的病程中也起到重要作用[14]。在骨关节炎中，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解产物与关节软骨细胞表面受体、纤连蛋白片段、机械力、机体老化、促炎因子等共同作用，可激活NF-κB 信号通路。NF-κB 信号通路可单独或与其他信号通路联合作用，抑制软骨细胞合成代谢，并触发几种基质降解蛋白酶的表达，如 MMPs 和ADAMTS，导致关节软骨侵蚀。此外，骨关节炎软骨细胞会产生大量NF-κB 介导的分解代谢细胞因子和趋化因子，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-8 和核因子受体激活因子-κB（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL），其增加MMPs 的分泌，减少胶原蛋白和蛋白多糖的产生，并以正反馈循环的方式增强NF-κB 的激活[9,15]。NF-κB 信号通路通过诱导NO、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）促进关节损伤，从而增加分解代谢细胞因子的产生，促进软骨炎症。NF-κB 信号通路还可参与软骨细胞凋亡，影响凋亡相关蛋白的表达[16]。NF-κB 通过介导Toll 样受体2（toll like receptor 2，TLR-2）表达抑制软骨细胞的生长并促进细胞凋亡[17]。此外，在骨关节炎软骨细胞中，NF-κB 介导一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）过表达并促进NO 增加，可促进ECM 和蛋白多糖的降解、Caspase-3/9 的上调、B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的下调以及诱导软骨细胞凋亡来导致骨关节炎的发展[18-19]。

Hu 等[20]研究发现异牡荆素可在体外通过核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/NF-κB 轴调节IL-1β 诱导的骨关节炎软骨细胞中炎症因子含量并维持ECM稳态。Yang等[21]发现在小鼠胚胎瘤成软骨细胞ATDC5 中IL-1β可诱导MMPs 含量升高和ECM 降解，灯盏花乙素（25～50 μmol/mL）可剂量相关性通过NF-κB 通路抑制IL-1β 诱导的总核因子κB 抑制因子α（inhibitor of NF-κB α，IκBα）蛋白含量下降和p-IκBα 和磷酸化核因子κB 激酶α（phospho-inhibitor of kappa B kinase α，p-IKKα）的上调，阻断p-p65 进入细胞核，并在大鼠体内也显示出了关节保护作用。Luo 等[22]使用IL-1β 干预小鼠关节软骨细胞，导致细胞中NFκB 异常激活和ECM 降解，而预先使用15～60 μmol/mL 灯盏花乙素处理的细胞可以抑制这一过程，灯盏花乙素可剂量相关性地抑制NF-κB 活性，并通过Nrf2/血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信号通路减弱ECM 降解，小鼠骨关节炎模型也证明灯盏花乙素可通过降低关节软骨破损程度起到关节保护作用。柚皮苷是一类广泛存在于植物中的黄酮类物质，具有广泛的药理作用。Xu 等[23]发现柚皮苷可抑制碘乙酸钠诱导的SD 大鼠骨关节炎症状，且对脂多糖处理的RAW264.7 细胞中PGE2、NO、IL-6 和TNF-α 的产生有显著抑制作用。彭侃等[24]发现柚皮苷可在体内外抑制软骨中NF-κB 和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎性体信号通路，降低SW1353 细胞中IL-1β 诱导的NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-6、IL-18、MMP13和ADAMTS-5的mRNA 表达量升高达到抗炎作用。

1.2 抑制MAPK 信号通路

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）信号通路是参与炎症反应调控的重要信号通路，其参与调控关节软骨细胞增殖、分化、凋亡，炎症因子以及疼痛递质的产生，在骨关节炎发展中起着重要作用。此外，该通路还能调节软骨细胞的增殖分化和MMPs 的合成。王象鹏等[25]发现100 μmol/L 槲皮素可抑制由IL-1β 诱导的雄性SD大鼠膝关节软骨细胞中炎性因子TNF-α、IL-1β 表达量升高，并且可阻断p38 MAPK 通路中p38、pp38 等相关因子表达，进而起到保护关节软骨的作用。苏友新等[26]通过IL-1β 诱导新西兰兔膝关节软骨细胞退变建立体外骨关节炎模型，研究显示5 μg/mL 柚皮苷能显著抑制IL-1β 引起的兔膝关节软骨细胞中窖蛋白（caveolin-1，Cav-1）、p-p38 及磷酸化激活转录因子2（activating transcription factor 2，p-ATF-2）的升高，表明柚皮苷可通过调控caveolinp38 MAPK 通路对骨关节软骨细胞的炎症反应和损伤起到保护作用。

1.3 调控Wnts 信号通路

Wnts 通路在骨关节炎中的作用体现在其影响骨形成、软骨内骨化、骨生长和修复以及关节发育的能力[27]。经典Wnt 信号通路主要与卷曲蛋白（Frizzled）受体结合，导致β-连环蛋白（β-catenin）的积累并且向细胞核内聚集[28]。Corr[29]在软骨退化的过程中观察到Wnt 蛋白和β-catenin 水平升高。过表达的Wnt 会促进骨形成，这一过程可能与骨赘的形成有关。此外，还有2 种Wnt 调节蛋白sFRP-3和Dkk-1 的血清水平可能与骨关节炎的发病和加深相关。而Wnt/β-catenin 过高或过低的表达均可导致软骨细胞病变和软骨丢失[30-31]，这表明Wnt/βcatenin 可能在骨关节炎发病机制中发挥双重作用。Lietman 等[32]使用Wnt 抑制剂处理人滑膜成纤维细胞和经膝关节内侧半月板失稳术（destabilization of the medial meniscus，DMM）造模的骨关节炎大鼠膝盖，发现Wnt 通路可影响体外滑膜成纤维细胞的增殖并降低胶原蛋白水平，并在体内实验中显示出关节保护作用。Wnt/β-catenin 可调控蛋白聚糖 4（proteoglycan 4，Prg4），Prg4 是一种维持关节表面层润滑和体内平衡所必需的细胞外基质分子，与骨关节炎的发展相关[33]。已有研究表明Prg4 的表达可产生关节保护作用[34]，此外Prg4 还可上调缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-3α 水平而抑制软骨分解代谢和软骨细胞肥大[35]。

Wu 等[36]研究表明使用25～100 mg/kg 5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮可显著降低骨关节炎大鼠关节液中IL-1β、TNF-α 和PGE2的含量，改善关节软骨破损程度，5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮可以剂量相关性地抑制Wnt/β-catenin 通路及其下游COX-2基因的表达，从而减轻炎症反应，从而发挥抗骨关节炎的作用。Liu 等[37]在IL-1β 处理人骨关节炎软骨细胞后，使用5～20 μmol/mL 灯盏花乙素处理，发现其能抑制MMPs、ADAMTS-5、Wnt3a 和Frizzled 7 的表达并阻止β-catenin 向细胞核易位。此外，灯盏花乙素还能调节Wnt/β-catenin 和MAPK 信号通路，并增加II 型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的产生，延缓骨关节炎的发展。

黄酮类化合物通过抗炎作用防治骨关节炎的机制见表1 和图1。

图1 黄酮类化合物抗炎机制Fig. 1 Anti-inflammatory mechanism of flavonoids

2 抑制氧化应激

氧化应激是指体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）成分与抗氧化系统之间稳态失衡所引起的一系列反应。失衡将导致炎症细胞因子表达上升，从而导致细胞大分子如蛋白质、脂质和DNA的氧化，使其改变或丧失功能。ROS 主要产生的位点包括线粒体、过氧化物酶体和其他含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶、黄嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶的膜结构。软骨细胞中ROS 的过量产生所诱导的氧化应激是骨关节炎的主要发病机制之一[60]。在ROS 产生增加的条件下，针对氧化应激的细胞机制被激活，包括过氧化氢酶、过氧化还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，从而从细胞中有效地去除ROS。有研究表明IL-1β可促进铁内流并导致软骨细胞铁过载，加剧ROS 的产生，导致线粒体功能障碍。Qiu 等[61]对采用半月板切除术（meniscal transection，MNX）进行骨关节炎造模的SD 大鼠使用100 mg/kg 槲皮素治疗，发现槲皮素可以抑制ROS 的产生并上调软骨细胞NAD-依赖性去乙酰化酶Sirtuin-1（NAD-dependent deacetylase sirtuin-1，SIRT1）/AMPK 信号通路，增加谷胱甘肽及其合成酶谷胱甘肽过氧化物酶的表达，并逆转骨关节炎模型小鼠的线粒体功能障碍来减轻骨关节炎严重程度。黄酮类化合物防治骨关节炎的抗氧化应激作用机制见表2。

表2 黄酮类化合物防治骨关节炎的抗氧化应激作用机制Table 2 Anti-oxidative stress mechanism of flavonoids in prevention and treatment of osteoarthritis

3 抗细胞凋亡

细胞凋亡主要通过3 种途径进行诱导：（1）死亡受体介导的凋亡，主要通过受体与配体相互结合传递凋亡信号来介导细胞凋亡；（2）线粒体依赖性凋亡途径，可由ROS 等多种因素诱导；（3）内质网应激凋亡，可由内源性或外源性因素诱发内质网稳态异常并导致凋亡。软骨细胞负责ECM 的合成代谢和分解代谢平衡，保持关节软骨的稳态。在晚期骨关节炎中，软骨细胞数量减少并伴有腔隙产生。有研究表明，软骨细胞的凋亡与骨关节炎的发展相关[63-64]。Wang 等[62]使用25 μmol/mL 的槲皮素对经过氧化氢叔丁醇处理的雄性SD 大关节软骨细胞进行培养，发现槲皮素可以在体外通过激活SIRT1/AMPK 通路抑制ROS 引起的内质网应激和细胞凋亡，且对进行了DMM 的小鼠的关节退变与糜烂有缓解作用[62]。Hu 等[45]使用硝普钠诱导软骨细胞凋亡，发现8 μmol/mL 槲皮素可显著降低软骨细胞中ROS 含量，并通过抑制B 淋巴细胞瘤-2 相关X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）和Caspase-3 等促凋亡因子的表达和恢复线粒体膜电位来减轻软骨细胞凋亡程度。黄酮类化合物防治骨关节炎的抗细胞凋亡作用机制见表3。

表3 黄酮类化合物防治骨关节炎的抗细胞凋亡作用机制Table 3 Anti-apoptotic mechanism of flavonoids in prevention and treatment of osteoarthritis

4 抗铁死亡

铁死亡（ferroptosis）是2012 年发现的一种新型细胞死亡，在细胞死亡过程中通常伴有大量的铁积累和脂质过氧化[70]。Miao 等[71]发现在人骨关节炎细胞中谷胱甘肽过氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的降低可直接诱发铁死亡，且可通过MAPK/NF-κB 信号通路引发ECM 降解，这是首次证明铁死亡与骨关节炎发展直接相关的报道。骨关节炎患者关节液中的铁浓度会增加[71]，而过量的游离铁可作为催化剂产生大量ROS，使得脂质过氧化物不断积累并最终引起铁死亡[73]。

Luo 等[74]通过使用脂多糖处理的人滑膜细胞HUM-CELL-0060 建立的滑膜炎模型来研究淫羊藿苷对滑膜炎细胞的影响，发现2、5、10 μmol/mL 淫羊藿苷能浓度相关性降低丙二醛水平和铁含量，增加GPX 水平，通过激活胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白（system Xc-，Xc-）/GPX4 轴抑制铁死亡以减少细胞死亡和减轻滑膜炎。目前铁死亡与骨关节炎的相关研究正处于起步阶段，具体机制有待进一步阐明。

5 抗细胞焦亡

细胞焦亡是一种由炎症小体诱发并由消皮素（gasdermin，GSDM）蛋白引发的程序性细胞死亡。典型的细胞焦亡由炎性小体介导，伴随GSDMD 蛋白切割和IL-1β 和IL-18 释放。炎症小体主要有NLRP3、核效应蛋白4（NLR family caspase activation and recruit⁃ment domain Containing 4，NLRC4）、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）、NLRP1 等几种[75]，已有研究表明NLRP1 和NLRP3炎性小体与关节纤维化滑膜炎以及细胞焦亡的发生有密切联系[76-77]，骨关节炎滑膜巨噬细胞中的炎症小体进入到滑液中使得炎性小体在关节液和周围组织中的浓度升高，这将导致IL-1β 的含量上升并刺激关节中的一系列炎症反应，释放更多的促炎因子，导致软骨细胞焦亡和软骨退化。

缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）是由α（HIF-1α、HIF-2α 和HIF-3α）和β（HIF-1β、HIF-2β 和HIF-3β，也称为ARNT1、ARNT2 和ARNT3）亚基组成的异二聚体转录因子[78]。关节软骨处于低氧环境中[79]，这使得HIF-1α 的表达和活性加强，保障关节软骨稳态，并抑制ECM 降解，使软骨基因（SOX9、COL2A1、ACAN）、基质沉积、硫酸化糖胺聚糖、II 型胶原蛋白上调。生理性缺氧还可以降低肥大标记物的表达[80]，从而抑制分解代谢反应并缓解关节软骨破坏。Li 等[81]使用碘乙酸钠进行大鼠膝关节炎造模，发现每日ig 0.2 mg/kg 紫花牡荆素可抑制大鼠HIF-1α/NLRP3 炎性体的激活，减轻碘乙酸钠诱导的大鼠滑膜炎症状。Zu 等[82]使用脂多糖诱导大鼠膝关节软骨细胞损伤和细胞焦亡，发现5～20 μmol/mL 淫羊藿苷可以抑制脂多糖激活的NLRP3 和Caspase-1 信号通路，抑制细胞焦亡并发挥骨关节保护作用。

6 结语与展望

随着中国老龄化带来的影响日益明显，骨关节炎人群的不断增长将给社会和医疗体系带来沉重负担。中药治疗骨关节炎的历史悠久，但目前仅有少量的天然化合物处于抗骨关节炎的临床前研究阶段，黄酮类化合物作为一类广泛存在于中药中的天然化合物，可通过多途径发挥抗骨关节炎和关节保护作用，与传统抗骨关节炎药物相比具有更高的安全性，具有巨大潜力。本文从黄酮类化合物抑制炎症反应、减轻氧化应激及抗细胞凋亡、铁死亡和细胞焦亡方面进行总结，归纳黄酮类化合物抗骨关节炎的作用机制。黄酮类化合物通过干预炎症相关通路，减轻体内炎性反应，降低体内ROS 水平，减少ECM 降解，影响抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 的平衡及各蛋白的表达以抑制细胞凋亡，影响GPX 水平，并通过激活Xc-/GPX4 轴降低软骨细胞铁死亡率和减轻滑膜炎，通过抑制多种炎症小体抑制细胞焦亡，减少IL-1β 在软骨细胞的含量，从而达到抑制骨关节炎发展的作用。

黄酮类化合物大多为天然成分，对机体亲和性高，毒副作用相对低，对提高患者用药依从性和长期安全性具有积极作用。随着对医学的认识不断加深，越来越多的信号通路和靶点被纳入与骨关节炎发病相关的范畴，人们已经认识到骨关节炎是一种复杂的全关节退行性疾病，但由于黄酮类化合物治疗骨关节炎的作用机制研究较为分散，缺乏系统整理，虽已发现众多黄酮类成分显示出抗骨关节炎的潜力，但对黄酮类化合物抗骨关节炎的研究多集中于其抗炎作用，未能体现出黄酮类化合物在骨关节炎治疗中的多信号通路、多分子靶点优势。与许多天然产物一样，大多数黄酮类化合物的水溶性较差，这限制了其在临床的应用。目前已有研究尝试通过制剂的手段解决这一问题，如Ouyang 等[83]制备出了软骨亲和肽修饰的纳米粒子包载橙皮素，获得了具有良好控释能力和生物相容性的材料，可达到靶向给药的目的，提高生物利用度和稳定性。未来的研究应在深入挖掘黄酮类化合物抗骨关节炎潜力的同时，加强药物设计及临床试验方面的研究，这对开发出安全有效的抗骨关节炎药物具有重要意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突