超声辅助美拉德反应对鲢鱼酶解产物风味特性的影响

王玉婷,肖乃勇,施文正,2

(1 上海海洋大学食品学院,上海 201306;2 国家淡水水产品加工技术研发分中心,上海 201306)

鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)是中国养殖产量较高的低值淡水鱼类,其蛋白质丰富、氨基酸种类齐全,具有较高的营养价值[1]。2021年鲢鱼总产量为383.66万t,约占中国淡水养殖鱼类总产量的15%[2]。然而,由于刺多、腥味重并且鱼体内部组织酶活跃,大量滞销的鲢鱼易发生腐败变质,造成了资源的浪费和环境污染。目前,鲢鱼主要以鲜销和初级加工产品为主(如腌制[3]、鱼排[4]和冷冻产品[5]等),但原料鱼肉风味、质构不佳,且在加工、运输过程中操作不当极易造成蛋白质的损耗或营养物质的流失,利用率低于60%[6],因此开发淡水鱼类深加工新技术以提高其附加值和营养价值已成为近年来的研究热点。对于鲢鱼的深加工,一般通过温和的酶解技术将鲢鱼蛋白转化为分子量较小的水解物或多肽,利用率高达90%[7],它优于传统的碱法或酸法,无有机溶剂的加入[8]。酶解法是一种从食用材料中提取风味物质的重要技术,但酶解产物一般不具有显著的风味特征。此外,有研究发现通过深度酶解得到的鲢鱼酶解产物大多会产生不好的味道(如鱼腥味和苦味)[9]。因此,需要探索一种有效、安全的方法来改善水解物的风味特征。

美拉德反应是还原糖和蛋白质、肽或氨基酸之间一系列复杂的非酶褐变反应[10],在初级阶段会形成各种各样的风味物质(如糠醛、乙醛和丙酮醛),而类黑精等褐色含氮物质来自美拉德反应终产物,决定了食品的色泽和风味[11]。这些美拉德反应产物是提高多肽或水解物风味特性的有效增强剂,在食品领域引起了广泛关注[12]。超声波是一种绿色、安全、高效的加工技术,其强烈的机械作用和空穴效应使蛋白质空间结构及构象发生改变[13],并且在较好地保留食品自身特性的基础上,可以提高反应产率。Yu等[14]在葡萄糖-甘氨酸模型体系中进行超声辅助美拉德反应技术的研究,可以生成更多的香味化合物,气味阈值更低,浓度更高。此外,有相关报道表明,超声处理也有助于酶解物中更多类型挥发性化合物的生成。Ong等[15]研究发现具有更长/更多侧链的吡嗪在超声-美拉德反应模型系统中生成量大于热反应。Dong等[16]研究得出经过超声预处理后贻贝肉水解蛋白的美拉德反应产物具有丰富的肉类和海鲜风味,但苦味较热处理后的样品低。目前,关于以鲢鱼酶解产物为基料的风味改良技术的研究较少。因此,寻找改善鲢鱼酶解产物风味的潜在加工方法是十分必要的。

本研究以鲢鱼为原料,采用超声辅助美拉德反应技术处理鲢鱼酶解产物制得超声-美拉德反应产物,以未经超声处理的美拉德反应产物和鲢鱼酶解产物作为对照,对其进行中间产物、褐变程度、荧光强度、游离氨基酸含量、电子舌以及挥发性成分等指标的测定,探索超声辅助美拉德反应对鲢鱼酶解产物风味的影响,以期为鲢鱼资源的高值化利用和淡水鱼调味基料的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白鲢,购于上海市浦东新区南汇新城镇黄卫兴水产店;碱性蛋白酶(200 000 U/g)、木瓜蛋白酶(100 000 U/g)、木糖、三氯乙酸(分析纯),购于北京索莱宝科技有限公司;2,4,6-三甲基吡啶,购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

H-2050R型高速冷冻离心机,长沙湘仪有限公司;SB-400DTY超声波多频清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;HH-6型数显恒温搅拌水浴锅,常州鸿泽实验科技有限公司;FE28型pH计,梅特勒-托利多仪器上海有限公司;DHG-9003鼓风干燥箱,上海向北实业有限公司;UV-1800PC紫外可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;LA-8080超高速氨基酸自动分析仪,日立高新技术有限公司;5975b热脱附气相色谱质谱联用仪,美国Agilent公司;TS-5000Z电子舌,北京盈盛恒泰科技有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

白鲢鱼经过宰杀、清洗、去头、去内脏、去皮等工序,取可食用部位鱼肉用绞肉机绞碎,用密封袋分装后置于-18 ℃冰箱冷冻,待用。

1.3.2 样品的制备

参照王紫薇[17]和刘伟[18]的方法进行超声-美拉德反应产物的制备并略做修改。酶解产物取冷冻碎鱼肉4 ℃下自然解冻,与蒸馏水(1∶3,w/v)混合均质后转移至100 mL锥形瓶中,按照酶添加量5 000 U/g加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶(复配比1∶3),密封后水浴55 ℃酶解4 h,待水解反应结束后,迅速置于95℃水浴中灭酶15 min,4℃条件下以5 000 r/min(离心半径r=10 cm)离心20 min,取上清液制得鲢鱼酶解产物。美拉德反应产物:将酶解产物与3%添加量的木糖混合,调pH至6,置于90℃烘箱中反应90 min,制得美拉德反应产物。超声-美拉德反应产物:将酶解产物与3%添加量的木糖混合,在320 W超声功率下处理30 min,其他操作同上,制得超声-美拉德反应产物。

1.3.3 美拉德反应中间产物的测定

参照于珍等[19]的方法并略做修改。各样品溶液用蒸馏水稀释50倍,用紫外分光光度计在294 nm处测定吸光度,表示中间产物量的变化。

1.3.4 美拉德反应褐变程度的测定

参照于珍等[19]的方法并略做修改。各样品溶液用蒸馏水稀释2倍,以420 nm处测定的吸光度表示美拉德反应晚期阶段的褐变程度。

1.3.5 内源性荧光强度的测定

在激发波长为260 nm时测量样品的荧光光谱,扫描波长范围为200～460 nm,狭缝为5.0 nm。

1.3.6 游离氨基酸的测定

根据陈实等[20]的方法并略做修改。将5 mL样液装与5 mL 15%的三氯乙酸溶液混合,漩涡混匀后冰浴静置2 h,在4 ℃、10 000 r/min(离心半径r=10 cm)下离心15 min后,过滤。取5 mL上清液,将pH用3 mol/L NaOH调至2,并定容到10 mL,经0.22 μm的膜过滤后,转移至进样瓶中上机待测。

1.3.7 挥发性风味成分的测定

参考唐翠翠等[21]的方法并略做修改。将5 mL样液装于15 mL顶空瓶中,再加入20 μL 2,4,6-三甲基吡啶(100 mg/L,溶剂甲醇)作为内标。将老化后的3个规格为2.9 mm×5 mm,孔径1 mm的Mono Trap RCC18(GL sciences 公司,日本)固定在顶空瓶上方,60℃水浴条件下萃取40 min,将吸附子装入衬管中进行GC-MS分析。

GC条件:DB-5MS 弹性毛细管柱(60 m×0.32 mm,1 μm);载气为He,流速1.0 mL/min;升温程序:起始柱温40 ℃,保持2 min;以4 ℃/min的速率升至160 ℃,不保持;最后以10 ℃/min的速率升至250 ℃,保持5 min。采用不分流模式,汽化室温度240 ℃。

MS条件:电子电离源;电子能量 70 eV,离子源温度 200 ℃;传输线温度280℃;质量扫描范围35～450 m/z。热脱附器条件:不分流模式,起始温度60 ℃,以 180 ℃/min 的速率升至240 ℃,保持6 min。冷却型进样口条件:液氮制冷,起始温度-40 ℃,平衡30 s,以 12 ℃/s的速率升至270 ℃,保持15 min。通过NIST 2005和Wiley质谱数据库检索对挥发性物质进行质谱分析,得到正反匹配度均大于800的物质。并计算其保留指数(RI)。

1.3.8 气味活性值(OAV)

未知挥发性化合物质量浓度以及每种化合物的气味活度值(odor activity value,OAV)的计算公式如下,当OAV≥1时,表明该化合物对样品的整体风味有贡献[22]。(1)

(1)

式中:C为挥发性风味物质质量浓度,μg/kg;T为气味阈值,μg/kg。

1.3.9 电子舌的测定

使用味觉分析系统进行电子舌测试。50 mL样品置于食品杯中,测定其酸味、苦味、涩味、咸味、鲜味、丰富性(新鲜的回味)、回味B(收敛的回味)和回味A(新鲜的回味)。每个样品测定4次。

1.3.10 数据处理

每个试验均重复3次,采用Excel 2010软件对数据进行处理,Origin 2021软件作图,采用SPSS 23.0进行试验结果的显著性分析及邓肯多重比较(P<0.05),结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 中间产物及褐变程度的变化

美拉德反应在中期阶段会形成无色化合物(酮、醛和醇类等),并在294 nm处具有较强吸收峰,通常在颜色形成之前而产生,其微小增量即可使吸光度剧烈增加,因此在294 nm处可间接反映中间产物的生成情况;而在晚期阶段会发生褐变反应形成棕色的类黑素等物质,并可在420 nm处测出[23]。从图1中可以看到不同处理组之间存在显著差异(P<0.05)。与酶解产物相比,美拉德反应产物在294 nm和420 nm处的吸光度明显更高,吸光度的增加表明中间产物和褐变化合物的形成[24]。由于氨基的消耗及有机酸的产生,体系的酸性状态也会引起褐变程度的略微增加。这与Chen等[25]的研究结果相似。此外,超声-美拉德反应处理组要高于未超声组。这可能是由于超声预处理产生的湍流和机械剪切力能加快溶液的高速混合,未反应的多肽链完全展开,大量氨基基团暴露出来,增大了底物与木糖的接触空间,提高了美拉德反应速率[26]。

注:不同小写字母表示各样品中中间产物的吸光度差异显著(P<0.05);不同大写字母表示各样品中褐变程度的吸光度差异显著(P<0.05)图1 不同处理方式下各样品中间产物及褐变程度的变化Fig.1 Changes in intermediates and browning degree of samples with different treatments

2.2 内源性荧光强度的变化

据报道,荧光化合物的生成与热诱导的美拉德反应有关[27]。图2展示了不同处理组样品内源性荧光光谱的变化。酶解产物在348 nm处显示出最大荧光强度,而美拉德反应产物的荧光强度有所下降。这一结果表明,鲢鱼蛋白质结构被破坏,蛋白酶裂解氨基酸之间的键,释放氨基酸残基。随着具有荧光吸收基团的氨基酸残基含量的增加,荧光强度也随之增加[28]。在有木糖参与的情况下,酶解产物的荧光强度下降,超声-美拉德反应产物的荧光强度低于未超声组。

图2 不同处理方式下各样品内源性荧光光谱的变化Fig.2 Changes in intrinsic fluorescence of different treated samples

这是由于木糖中的羧基与酶解产物中的氨基充分反应,从而通过超声处理加速了氨基和羧基的分子间运动。Liu等[29]在探究糖基化改性蛋白质构象的变化中,发现美拉德反应产物荧光强度的下降与氨基酸残基空间位点受阻有关,结果与本研究一致。

2.3 游离氨基酸分析

游离氨基酸不仅是重要的风味物质,而且是参与美拉德反应的风味前体化合物。游离氨基酸按呈味特性可分为鲜味(Asp、Glu)、甜味(Thr、Ser、Gly、Ala和Pro)和苦味氨基酸(Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His和Arg)[30]。不同处理方式样品的游离氨基酸含量如表1所示。本研究共检测了17种游离氨基酸,游离氨基酸含量在不同处理组样品间均存在显著差异(P<0.05)。与酶解产物相比,美拉德反应产物和超声-美拉德反应产物的总游离氨基酸分别降低了14.41%和23.18%。其中苯丙氨酸、精氨酸和苏氨酸的降低程度较大,说明这些氨基酸主要参与了美拉德反应过程中的斯特勒克(Strecker)降解反应。

表1 不同处理样品中游离氨基酸的含量 Tab.1 Content of free amino acids in different treated samples

不同处理样品呈味游离氨基酸含量的变化如图3所示。

图3 不同处理样品呈味游离氨基酸含量的变化Fig.3 Changes of free amino acid content in taste presentation of different treated samples

由图3可知,酶解产物经美拉德反应后的苦味氨基酸降低了9%,而超声-美拉德反应处理组降低了18%,表明美拉德反应能有效减少酶解产物中的苦味氨基酸生成,而超声预处理使产物粒径变小,美拉德反应速率加快,并使产物的苦味最小化。鲜味氨基酸中谷氨酸含量显著降低(P<0.05),表明谷氨酸参与美拉德反应的活性较高。美拉德反应产物中鲜、甜味氨基酸的含量有所下降,这些游离氨基酸与木糖发生缩合反应,并在一定程度上影响了酶解产物的口感。

2.4 MMSE-GC-MS分析

采用MMSE-GC-MS技术对挥发性风味成分进行提取,测定其挥发性化合物的含量如表2所示。共鉴定出49种挥发性化合物,酶解产物、美拉德反应产物和超声-美拉德反应产物中分别检测到44、47和46种挥发性化合物。其中包括18种醛类、7种醇类、3种酯类、5种酮类、10种烃类、3种杂环类和3种其他类化合物。各样品组产生的挥发性化合物主要为醛类和烃类化合物。酶解产物经超声处理后使粒径变小,易与木糖交联,形成醛类、烯烃、酮类等挥发性化合物,因此超声-美拉德反应产物中醛类含量最高。醛类因其较低的阈值而成为食品加工过程中最有价值的挥发性化合物[31]。醛类化合物是由氨基酸和多肽在加热过程中与木糖反应形成,多肽本身的脱水和缩合也会使其含量增多。由表2可知,己醛和苯甲醛在酶解产物中含量较高。苯甲醛是一种具有樱桃香的芳香醛,广泛应用于食品工业中[32]。己醛是由亚油酸氧化生成,具有淡淡的草香和脂肪味[33]。

表2 不同处理样品中挥发性风味物质的含量 Tab.2 Content of volatile flavor components in different treated samples

此外,美拉德反应前后有新的醛类物质生成。比如2-甲基丁醛,作为常用香料已广泛应用于食品工业中,具有可可香气、水果香等风味[34];糠醛是戊糖的相应分解产物,其生成量与美拉德反应程度有关[35];(E,E)-2,4-庚二烯醛呈鱼腥味,具有较低的阈值[36],并且在超声-美拉德反应产物中未检出,表明超声辅助美拉德反应可以有效改善酶解液的风味。饱和醇和烃类化合物通常阈值较高,对整体风味贡献不大但参与杂环物质生成[37]。

2-乙基呋喃等杂环化合物赋予酶解液烧烤、烤肉香或焦香味,经超声辅助美拉德反应后含量显著增加(P<0.05)。挥发性风味物质中还检测到呈酯香味的辛酸乙酯和呈花果香的乙酸乙酯。酮类和其他类挥发性物质对酶解液风味均有一定影响。此外,挥发性化合物的增加与氨基酸的减少相对应。

通过气味活性值(OAV)鉴定出13种对样品整体香气贡献较大的挥发性成分,如表3所示。OAV值常被用于评价气味在食品香气中的重要性。与GC-MS分析不同,OAV考虑了食物基质效应,因为所涉及的气味阈值取决于单个食物基质。食品香气中的显著气味被认为是OAV≥1的有效气味,通常被称为关键气味[38-39]。在超声处理和美拉德反应作用下,水解物中OAV≥1的挥发性化合物明显增多,且香味特征更为明显。与GC-MS分析结果相符合,低阈值的醛类OAV最大,对整体香味的也贡献最大。

2.5 电子舌分析

鲜味、苦味和丰富度整体的味觉响应值较高,酸味响应值最低,后味B(苦的回味)对不同处理样品的响应值基本一致。酶解产物经美拉德反应后酸味值增加,但苦涩味、鲜咸味和丰富度降低,这可能与呈苦味的游离精氨酸和苯丙氨酸、呈鲜味的谷氨酸降低有关。而超声-美拉德反应处理组的酸味、苦涩味和咸味的响应值低于未超声组。当蛋白质被蛋白酶水解产生肽和氨基酸时,未反应的短肽对咸味、苦味有贡献,经过超声预处理后未反应的短肽减少,这是使咸味和苦味响应值降低的主要原因。此外,超声辅助美拉德反应促进了其他呈味氨基酸的生成,酶解液中的苦味被掩盖。以上结果表明,超声辅助美拉德反应能够改善酶解液的风味。

电子舌雷达图如图4所示。

图4 不同处理样品的电子舌雷达图Fig.4 Electron tongue radar map of different treated samples

各样品电子舌的主成分分析如图5所示。PC1、PC2的贡献率分别为68.3%、24.4%,累积贡献率为92.7%(>85%),表明PC1和PC2能够很好地反映样本的总体特征信息。从图5中可以看出,各样品的滋味轮廓并无重叠部分,表明电子舌可以将不同样品很好的区分开,各样品之间的距离代表样品种间的整体滋味差异。酶解产物与美拉德反应产物处理组之间距离较远,滋味轮廓存在显著差异,而美拉德反应产物和超声-美拉德产物处理组之间距离较近滋味轮廓相似。

图5 不同处理样品的电子舌主成分分析(PCA)Fig.5 Principal component analysis (PCA) of electronic tongues of different treated samples

3 结论

通过超声-辅助美拉德反应技术对鲢鱼酶解产物进行处理,对比未超声处理组及酶解处理组发现:经美拉德反应后,中间产物和褐变程度增加,超声-美拉德反应产物高于未超声组,说明超声处理促进了美拉德反应速率。美拉德反应产物的荧光强度下降,超声处理组低于未超声组,表明超声处理加速了氨基和羧基的分子间运动,使具有荧光吸收基团的氨基酸残基含量下降。游离氨基酸和MMSE-GC-MS结果显示美拉德反应能够降低苦味氨基酸的生成,苯甲醛、糠醛和2-乙基呋喃等赋予酶解液良好气味的挥发性化合物含量增加。电子舌结果进一步证实了超声辅助美拉德反应能够有效改善酶解产物的风味,为淡水鱼风味基料的应用提供了理论依据。