TLR9启动子区基因多态性与柯萨奇病毒A16感染手足口病患儿的相关性研究

郑晨晨,散 琴,王字卉

(湖北省十堰市妇幼保健院 检验科,湖北 十堰442000)

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一类肠道病毒(enterovirus,EVs)感染引起的传染性疾病,儿童是该病的易感人群,引发手足口病的肠道病毒有多种(型),其中以肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)最为常见。随着近几年EV71型灭活疫苗的接种,EV71感染的儿童手足口病占比减少。虽然Cox A16病毒感染后大部分患儿临床症状较轻,但是发病率较高,引起越来越多的关注[1-2]。Cox A16感染的患儿临床表现轻重不一,轻症者仅为发热、皮疹、口腔黏膜散在疱疹等,重症者可出现中枢神经系统损害、心肺功能衰竭等[3-4],Cox A16病毒感染的发病机制至今没有完全阐明,可能与其感染导致的异常免疫反应有关[5-6]。机体的天然免疫系统在抗感染过程中发挥重要功能,它通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)识别具有病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),快速启动机体的免疫反应从而抵抗病原微生物的进一步感染[7-9]。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是模式识别受体(PPRs)的一种,TLR具有单个的跨膜的蛋白,可识别来源于微生物的具有保守结构的PAMP分子,是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子,也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[10-11]。有研究认为,TLR基因多态性与多种病毒的免疫激活过程密切相关,并对患者病情预后有一定的影响[12-13]。本研究旨在探索Cox A16感染儿童手足口病患者外周血IL-6、IFN-α水平及其与Toll样受体9基因多态性的相关性,为Cox A16型手足口病的诊疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2018年4月至2021年10月湖北省十堰市妇幼保健院收治的Cox A16病毒感染的儿童手足口病患者201例为实验组,纳入标准:(1)患儿肛拭子标本Cox A16核酸检测为阳性,诊断参照2018年版《手足口病诊疗指南》[14]。(2)入院前患儿无药物治疗史。排除标准:(1)患儿合并其他的病毒感染所致疾病。(2)患儿有自身免疫缺陷症疾病或者先天性疾病。根据患儿是否出现中枢神经系统并发症,将实验组分为轻症组(158例)和重症组(43例),对照组为132名健康儿童。本研究通过十堰市妇幼保健院伦理委员会审查,所有受试者均签署知情同意书。

1.2 试剂及材料IL-6、IFN-α测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,TLR9测定试剂盒购自上海安为生物科技有限公司、DNA提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,PCR试剂盒购自购自宝生物工程(大连) 有限公司,总RNA提取试剂盒及RT-PCR试剂盒及实时荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)均购自宝生物大连公司,低温离心机购自Thermo Scientific公司,PCR仪购自Bio-Rad公司,DYY-6C电泳仪购自北京六一仪器厂,引物设计及合成购自上海生工生物工程公司,凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1标本的采集及处理 收集纳入患者的年龄、性别等一般资料,于患者入院24 h内采集患者外周血3 ml于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)真空抗凝管,混匀,离心(3 000 r/min)10 min,分离血浆和细胞,-80℃低温冰箱保存备用。

1.3.2IL-6、IFN-α水平的测定 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆中的白细胞介素-6(IL-6)、α干扰素(IFN-α)水平,测定的方法严格按照Biorbyt公司产品试剂盒说明书进行操作。

1.3.3TLR9、IL-6、IFN-αmRNA相对表达量的检测 按照试剂盒说明书提取样本的外周血提取总RNA。分光光度计检测RNA浓度及A260 /A280,A260/A280介于1.8～2.0,应用SYBR GreenⅠ染料法的实时荧光PCR技术检测TLR9、IL-6、IFN-αmRNA的相对表达量,内参基因为β-actin,引物由上海生物技术有限公司设计合成。从样本的外周血提取的总RNA,逆转录为cDNA,然后以cDNA作为模板进行PCR扩增,根据SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒说明书进行操作。PCR扩增条件:95℃预变性5 min,95℃变性5 s、58℃退火15 s、72℃延伸15 s,共39个循环。相对基因表达分析采用2-ΔΔCt法,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参)实验组-(Ct目的基因-Ct内参)对照组。

1.3.4TLR9基因多态性的检测 按照DNA快速抽提试剂盒说明进行操作,快速抽提全血基因组DNA,NanoDrop分光光度计检测提取样本的吸光度值,A260/A280介于1.6～1.8,将提取的样本DNA于-80℃低温冰箱保存,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RELP)技术对TLR9基因多态性的检测分析,上下游引物见表1。PCR扩增条件:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环30次,之后72℃延伸5 min。PCR扩增产物用限制性内切酶酶进行酶切,酶切产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,然后通过Bio-Rad凝胶成像系统观察结果,判断样本的基因型。

表1 TLR9 rs352140、rs164640、rs187084引物序列

2 结果

2.1 各组一般资料比较对照组、轻症组、重症组在性别、年龄方面比较无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 各组间一般资料比较

2.2 各组研究对象TLR9、IL-6、IFN-α mRNA表达水平Cox A16病毒感染的手足口病患儿TLR9 mRNA、IL-6 mRNA及IFN-αmRNA相对表达水平均高于对照组(P<0.05),且重症组手足口病患儿的上述mRNA表达水平均高于轻症组,差异具有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 各组研究对象TLR9、IL-6、IFN-α mRNA 相对表达水平

2.3 各组研究对象炎性因子TLR9、IL-6、IFN-α表达水平Cox A16病毒感染的手足口病患儿炎性因子TLR9、IL-6及IFN-α表达水平均高于对照组(P<0.05),且重症组手足口病患儿的上述因子表达水平均高于轻症组,见表4。

表4 各组研究对象炎性因子TLR9、IL-6、IFN-α表达水平

2.4 TLR9基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验及分布频率的比较TLR9基因rs352140、rs164640、rs187084 位点的SNPs的预期基因型频率均处于哈迪-温伯格平衡(HWE;P>0.05);各研究组在rs352140、rs164640位点的基因型和等位基因分布差异不明显(P>0.05),但rs187084的基因型和等位基因分布存在显著差异(P<0.05),其中对照组及轻症组手足口病患儿的C等位基因分布频率明显低于重症组(P<0.05),见表5。TLR9基因rs187084位点PCR-RFLP电泳图谱,见图1。

图1 TLR9基因rs187084位点PCR-RFLP电泳图谱

表5 各组TLR9基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验及分布频率的比较

Lane1为TC基因型(356 bp、209 bp、147 bp);Lane2、Lane4为TT基因型(209 bp、147 bp);Lane3、Lane5为CC基因型(356 bp)

2.5 二元Logistic回归分析TLR9基因rs187084位点基因型与儿童手足口病的相关性共显性模型中,CC基因型人群是TT基因型人群患病风险的2.552倍(OR=2.552,P<0.05);显性模型中,TC+CC基因型人群是TT基因型人群患病风险的1.997倍(OR=1.997,P<0.05);隐形模型中,CC基因型人群是TT+TC基因型人群患病风险的1.824倍(OR=1.824,P<0.05)。见表6。

表6 Logistic回归分析TLR9基因rs187084位点与Cox A16型手足口病的关系

3 讨论

Cox A16病毒感染的发病机制至今没有完全阐明,有学者[15-16]认为,可能与Cox A16感染后导致的异常免疫反应和免疫损伤有关。TLR具有单个的跨膜的蛋白,是参与天然免疫的重要分子。研究表明[17-18],TLR9途径可触发NF-κB信号通路的活化,进而释放炎性介质如干扰素IFN-α及IL-6等,IFN-α、IL-6是重要的炎性介质,二者与感染密切相关,其表达情况受基因水平、转录水平及转录后水平的调控[19]。

本研究结果显示,Cox A16病毒感染的手足口病患儿TLR9、IL-6、IFN-α的mRNA表达水平和炎性因子蛋白表达水平均高于对照组,且重症组手足口病患儿高于轻症组患儿,差异具有统计学意义。表明在Cox A16病毒感染过程中,炎症反应在手足口病的进展中有着重要的作用,TLR9、IL-6、IFN-α可能是Cox A16感染由轻症进展成重症的关键因子。通过进一步研究TLR9基因rs352140、rs164640、rs187084单核苷酸多态性发现,TLR9基因rs352140、rs164640位点基因型分布及等位基因分布差异均无统计学意义,rs187084基因位点基因型及T、C等位基因分布比较差异具有统计学意义,且对照组及轻症组手足口病患儿的C等位基因分布率明显低于重症组,进一步用二元Logistic回归统计分析,结果表明rs187084位点CC基因型是儿童手足口病Cox A16感染的独立危险因素,CC基因型人群是TT基因型人群患病风险的2.552倍,是TT+TC基因型人群患病风险的1.824倍,表明TLR9基因rs187084位点基因多态性与Cox A16型手足口病存在较大关联。但本研究纳入的病例样本较少,且并未进行多因素的分层分析,后续还有待增加样本量,同时进一步探索不同因素对TLR9基因多态性与Cox A16感染手足口病相关性的影响。

综上所述,TLR9、IL-6、IFN-α参与Cox A16型手足口病的过程,并可能是Cox A16感染由轻症进展成重症的关键因子,且TLR9基因在rs187084位点的基因多态性与Cox A16型手足口病存在较大关联。