脂类和补体联合检测在肺结核鉴别诊断中的应用价值*

邹 琛,张 洁,曹 芸,张 泓,张舒林,徐润灏△

1.上海交通大学医学院附属儿童医院检验科,上海 200062;2.上海交通大学医学院附属仁济医院检验科,上海 200001;3.上海交通大学医学院免疫学与微生物学系,上海 200025;4.上海市公共卫生临床中心结核病研究中心,上海 201508

结核病是威胁人类健康的主要传染病之一,据世界卫生组织发布的《2022年全球结核病报告》显示,2021年约160万人因结核病死亡[1]。我国的结核病发病总数位居全球第二,国家卫生健康委员会发布的《2021年全国法定传染病疫情概况》中指出,在我国的乙类传染病中,肺结核发病人数、死亡人数均位居第2[2]。由此可见,结核病尤其是肺结核的早诊早治仍是我国面临的巨大挑战。

肺结核患者临床表现及影像学检查缺乏特异性,早期不易与肺炎、肺癌等其他肺部疾病区分[3-4]。血液中各类成分众多,其中不少蛋白、代谢物、微小RNA在肺结核发生过程中发生显著变化[5-6],因此血液学检查被认为在肺结核辅助诊断和鉴别诊断中有着巨大潜能。依托于前期进行的血浆蛋白组学分析,在本研究中,笔者进一步检测了肺结核患者血浆中的载脂蛋白(Apo)A1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、脂蛋白a[Lp(a)]、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)、游离脂肪酸(NEFA)这12个脂类项目,以及补体C1q(C1q)、补体C3(C3)、补体C4(C4)、总补体活性(CH50)这4个补体项目,共16项临床常用指标,以探索其在肺结核鉴别诊断中可能存在的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年5月至2021年10月在上海市公共卫生临床中心及上海交通大学医学院附属仁济医院就诊的肺部疾病患者252例为研究对象,其中肺结核初治患者85例(TB组),非小细胞肺癌(NSCLC)初治患者87例(NSCLC组),社区获得性肺炎(CAP)初治患者80例(CAP组)。TB组中男48例、女37例,年龄25～80岁,平均(59.51±13.08)岁,纳入标准:通过患者的临床表现、影像学诊断、病原学诊断,根据《肺结核诊断》标准[7],确诊为肺结核,并排除肺外结核、肺部恶性肿瘤、合并其他严重感染的可能。NSCLC组中男53例、女34例,年龄27～82岁,平均(62.76±10.59)岁,纳入标准:经影像学和组织病理学检查确诊为NSCLC,排除同时伴有肺结核的可能;CAP组中男44例、女36例,年龄25～83岁,平均(62.23±14.47)岁,纳入标准:临床诊断为肺部感染,排除同时伴有肺结核的可能。同时选取上海市公共卫生临床中心及上海交通大学医学院附属仁济医院的90例体检健康者作为对照组,其中男52例、女38例,年龄25～82岁,平均(60.48±12.74)岁,纳入标准:排除肺部肿瘤及感染,且肝、肾功能等指标无明显异常。各组均排除血脂异常者、并发其他部位肿瘤者、自身免疫疾病患者等。各组年龄和性别比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究通过上海市公共卫生临床中心伦理委员会批准(2019-S009-02)。

1.2方法

1.2.1样本前处理 使用乙二胺四乙酸抗凝管收集各组患者的空腹全血标本3 mL,2 685×g离心10 min,分离得到血浆,置于-80 ℃超低温冰箱中保存待测,避免反复冻融。

1.2.2样本检测 采用H7600全自动生化分析仪(日本Hitachi公司)对ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、Lp(a)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、sdLDL-C、NEFA、C1q、CH50进行检测。其中ApoA1、ApoB、Lp(a)试剂盒购于四川迈克生物股份有限公司;ApoA2、ApoC2、ApoC3试剂盒购于北京利德曼生化股份有限公司;C1q试剂盒购于宁波美康生物科技有限公司,检测方法均为免疫比浊法。TC、TG、HDL-C、LDL-C、CH50试剂盒购于日本富士胶片和光纯药株式会社,TC的检测方法为胆固醇氧化酶法,TG的检测方法为去游离甘油法,HDL-C的检测方法为抗体阻碍法,LDL-C的检测方法为选择保护法,CH50的检测方法为脂质体免疫测定法。sdLDL-C试剂盒购于北京柏定生物工程有限公司,检测方法为过氧化氢酶法。NEFA试剂盒购于德赛诊断系统有限公司,检测方法为酶比色法。采用BNII全自动特定蛋白分析仪(德国SIMENS公司)及其配套试剂盒对C3、C4进行检测,检测方法为免疫比浊法。

2 结 果

2.1各组不同指标水平比较 TB组血浆ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平低于对照组(P<0.05),Lp(a)、C3、C4水平高于对照组(P<0.05);TB组血浆ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、TC、TG、HDL-C、LDL-C、NEFA、C3水平低于NSCLC组和CAP组(P<0.05),此外sdLDL-C、C1q水平仅低于NSCLC组(P<0.05),CH50水平高于CAP组(P<0.05),见表1。

表1 各组不同指标水平比较或M(P25,P75)]

2.2各项指标鉴别诊断肺结核效能的评估 ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、TC、TG、HDL-C、LDC-C、NEFA、C3这11项指标在TB组与NSCLC组,TB组与CAP组中的比较,差异均有统计学意义且变化趋势一致,将NSCLC组、CAP组合并为非结核病组(NTB)组,采用ROC曲线分析其对肺结核的鉴别诊断效能。鉴别诊断效能最佳的指标是ApoB,其曲线下面积(AUC)为0.799,灵敏度为74.12%,特异度为77.84%。见表2。

表2 各项指标及模型鉴别诊断肺结核的效能分析

2.3肺结核鉴别诊断模型的构建和验证

2.3.1模型的建立 随机抽取80%的标本,即TB组68例及NTB组133例(其中NSCLC组69例、CAP组64例),组成训练标本。将上述11项指标纳入逐步法二元Logistic回归分析,最终得到了由ApoB、C3、HDL-C和NEFA构成的鉴别诊断模型Y=1/[1+eLogit(P)],式中Logit(P)=-5.29×ApoB-1.954×C3-2.333×HDL-C-1.903NEFA+9.32,见表3。模型系数综合检验(χ2=183.06,P<0.05)和Hosmer-Lemeshow检验(χ2=9.427,P<0.05)结果显示,模型拟合度良好。见表3。

表3 逐步法二元logistic回归分析结果

2.3.2模型的效能分析 以模型Y作为新变量进行ROC曲线分析,其鉴别诊断肺结核的AUC为0.868(95%CI0.813～0.911),灵敏度为70.59%,特异度为89.47%,符合率为83.08%,见表2。

2.3.3模型的验证 将剩余标本(TB组17例、NTB组34例)作为验证标本,代入模型Y进行验证。验证标本中,TB组13例和NTB组29例判断正确,灵敏度为76.47%,特异度为85.29%,符合率为82.35%。与训练样本的诊断符合率基本相同。

2.4鉴别模型与部分现有检测方法的比较 将TB组68例及NTB组133例(其中NSCLC组69例、CAP组64例)患者的痰涂片抗酸染色结果、结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)结果与本研究得到的4项指标鉴别模型(ApoB+HDL-C+NEFA+C3)结果进行比较,其中抗酸染色的特异度最高(100.00%),其次为鉴别模型(88.62%);T-SPOT.TB的灵敏度最高(89.41%),其次为鉴别模型(71.76%)。此外,鉴别模型有着最高的总符合率(82.94%)。见表4。

表4 鉴别模型与部分现有检测方法的比较

3 讨 论

目前,高误诊率仍是我国肺结核诊治中的难点,尤其是在部分社区医疗单位中,肺结核易被误诊为肺癌及肺炎。这是由于越来越多肺结核患者的病灶形态不典型,在胸部CT和X光检查时缺乏特异性征象所致,且其早期临床表现多为咳痰、发热、咯血等,与其他肺部疾病极为相似[8-9]。结核分枝杆菌培养虽然是诊断结核病的金标准,但其灵敏度低,培养时间长,给疾病的诊断、治疗带来了较大难度[5]。血液学检查有着简便、快速、无创、高效的特点,T-SPOT.TB等γ-干扰素释放试验作为常用的肺结核血液学检查手段,有着较高的灵敏度,但其诊断肺结核的特异度较低[10],而多项血液指标联合检测能够提升诊断的灵敏度及特异度,可能成为肺结核辅助诊断与鉴别诊断的新方向。

本研究显示,与对照组比较,TB组血浆TC、HDL-C、LDL-C水平均降低,与HAN等[11]的研究结果一致。胆固醇在血液中常以脂蛋白的形式存在,主要为HDL-C和LDL-C。目前的研究结果显示,肺结核的发生、发展与胆固醇代谢有着密切联系[11-12]。有研究发现结核分枝杆菌感染的巨噬细胞内胆固醇酰基转移酶水平会明显升高,导致细胞内有更多的游离胆固醇酯化,形成过多脂滴,这些脂质在巨噬细胞内大量堆积,打破了机体脂代谢的动态平衡,这被认为是肺结核患者血浆各类胆固醇水平降低的原因[12-13]。也有观点认为胆固醇代表着个体免疫力水平,胆固醇水平低下导致感染肺结核的风险增加,而结核感染后机体免疫力的下降,会使得血液中胆固醇进一步减少[14],郑秀丽等[15]的研究结果显示,高胆固醇饮食辅助治疗后,肺结核患者的血清白蛋白水平升高,痰液结核杆菌转阴率和肺部病灶吸收率也升高,病情逐步好转。

本研究发现TB组患者血浆ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3这5项Apo水平降低,与CHEGOU等[16]及LIU等[17]的部分研究结果一致。Apo的主要功能是运输脂类到各组织进行代谢,具有水平稳定、进食后变化小、个体变异性低的特点[18]。其中ApoA1和ApoA2等是HDL-C中蛋白质的主要组成部分,ApoB则是LDL-C中蛋白质的主要组成部分,由于HDL-C及LDL-C等胆固醇在TB组患者血浆中水平降低,各类Apo水平亦同步降低。另据研究报道,机体在营养不良时,血浆Apo水平降低明显[19],可见肺结核继发的营养不良也可能是各类Apo水平较低的原因。值得注意的是,与TB组相反,ApoB在NSCLC组和CAP组血浆中水平升高(P<0.05),因此其在本研究纳入的所有指标中有着最大的AUC,据此笔者认为ApoB在鉴别诊断肺结核中有着较大的潜能。

此外,本研究还发现TB组患者NEFA水平降低。脂肪酸是结核分枝杆菌的重要营养物质之一,人体内被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞可以通过清道夫受体介导的Apo内化作用摄取血液来源的脂肪酸,胞内的结核分枝杆菌借机利用这些脂肪酸维持其在细胞中的生存,而细胞外的结核分枝杆菌则很可能从血液中的各类Apo处获得脂肪酸[20-22]。这被认为是宿主血浆中的NEFA水平降低的原因。

越来越多的补体因子被认为和肺结核的发生有着明显联系,有学者认为某些基因突变会导致C3等补体因子水平升高,从而增加结核易感性[23],同时随着结核患者组织损伤、肉芽肿和空洞形成等疾病进程的出现,血浆C3、C4等补体因子水平会进一步升高[24-25],这与本研究结果相符。需要指出的是,虽然本研究发现血浆C3、C4等补体因子在TB组血浆中水平升高,但这些补体因子在NSCLC组和CAP组中亦呈高表达,最终本研究发现只有C3对肺结核有一定的鉴别诊断价值。

本研究基于现有的标本,通过逐步法二元Logistic回归建模并消除多重共线性,最终得到由ApoB、C3、HDL-C、NEFA组成的辅助鉴别诊断模型(AUC为0.868),相较于现有的肺结核血液学检测方法T-SPOT.TB,上述4项指标组成的鉴别诊断模型有着更高的特异度和总符合率。目前,在肺结核与其他肺部疾病的鉴别诊断中,一些常见血液学指标的变化往往没有引起人们的重视。就目前的诊断技术而言,单一的血液学指标确实难以对肺结核等疾病进行精确判断,而最佳指标组合的概念弥补了这一缺陷,通过不同的算法将各类差异指标联用,能够得到由最佳指标组合构成的诊断模型,纳入的指标类型越全面,模型的诊断效能则越出色,这可能是肺结核等疾病未来诊断的趋势。在脂类和补体方面,本研究纳入了16项指标,发现脂类指标ApoB、HDL-C、NEFA及补体指标C3参与组成的模型有着辅助鉴别诊断肺结核的潜能,这4项指标的检测有着成熟的试剂盒,在临床较为普及,或许可以与影像学检查、病原学检查互补,提高诊断的准确性。不过,脂类、补体指标的类型较为单一,其诊断效能存在一定的上限,若期望在诊断效能上继续突破,还可加入细胞因子类、氨基酸类、微小RNA类等已被证实在肺结核患者血液中异常表达的指标,笔者也将对此进行深入探索。另一方面,血液指标联用对肺结核辅助鉴别诊断的价值在国内外均处于探索阶段,因此,本文结论还需大样本、多中心研究加以验证。