一株二型蜡蚧菌的鉴定及其对烟蚜的致病性和防效

罗毅红，刘明科，胡 刚，李茂业，刘 苏*

1.安徽农业大学植物保护学院 作物有害生物综合治理安徽省重点实验室，合肥市蜀山区长江西路130号 230036

2.中国烟草总公司四川省公司科技处，成都市高新区世纪城路936号 610041

烟蚜（Myzuspersicae）又称桃蚜，是为害烟草的重要害虫［1］。烟蚜通过刺吸烟草汁液、引发煤污病以及传播多种病毒病等方式严重影响烟叶的产量和品质［2-3］。目前对烟蚜的防治主要依赖化学杀虫剂，但化学农药的不合理使用，造成了烟蚜的抗药性逐年增强［4-6］。因此，亟需开发针对烟蚜的高效生物防治技术，以减少化学农药的使用量。昆虫病原真菌（又称虫生真菌）是能够从体表侵入昆虫体内寄生并使昆虫发病致死的真菌，已被作为一种生物防治手段用于控制害虫种群数量［7］。前人已经开展了一系列有关昆虫病原真菌对烟蚜致病性的研究。田佳等［8］分离了1株球孢白僵菌（Beauveriabassiana）BQ-63菌株，该菌处理烟蚜无翅成蚜7 d 后的校正死亡率为90.1%。孟豪等［9］研究了玫烟色棒束孢（Paecilomyces furmosoroseus）IF-1106菌株对烟蚜的致病力，发现试虫的累计死亡率达到91.7%。邓建华等［10］发现粉拟青霉（Paecilomycesfarinosus）Pf-27 菌株处理烟蚜5 d 后的感染率达到98.0%。

蜡蚧菌是一类寄主范围广泛的昆虫病原真菌［11］，其中的一些种类如蜡蚧轮枝菌（Verticillium lecanii）［12］、刀孢蜡蚧菌（Lecanicilliumpsalliotae）［13］和长孢蜡蚧菌（L.longisporum）［14］等均对烟蚜具有较强的侵染力。但目前二型蜡蚧菌（L.dimorphum）对烟蚜致病性的研究鲜见报道。为此，从野外采集的染菌烟蚜上分离了1 株二型蜡蚧菌（编号HFLD1），并通过生物测定分析该菌株对烟蚜的致病性，同时通过田间试验评价了该菌株对烟蚜的防效，以期为利用该菌株开发烟蚜生物防治新产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

于2020年5月在安徽省合肥市大杨镇农业园采集染菌烟蚜。将其置于75%乙醇中消毒10 s，再置于灭菌蒸馏水中清洗3 次。用接种针从其体表上挑取孢子，采用划线法接种于萨氏培养基（SDAY）平板，于（25±1）℃、相对湿度75%±2%条件下全黑暗环境培养7 d，再挑取少量孢子至新的SDAY平板纯化培养。纯化后的菌株转接到SDAY 斜面上，置于-20 ℃保存备用。

1.2 供试虫源

供试烟蚜为本实验室饲养种群［15］。将无翅胎生雌蚜单头接于烟草（品种为云烟87）植株上，在（25 ±1）℃，光周期L∶D=16∶8，相对湿度65%±2%条件下饲养，获得单克隆系种群。选取羽化2 d内体型大小一致的健康无翅胎生雌蚜作为供试虫源。

1.3 菌株形态观察

将供试菌株接种于SDAY平板，在（25±1）℃、相对湿度75%±2%、全黑暗环境下培养10 d。利用光学显微镜［DS-Ri2 型，尼康精机（上海）有限公司］观察菌丝和孢子等形态特征。将灭菌玻璃纸贴在新的SDAY 平板表面，将供试菌株涂布接种于玻璃纸上，培养7 d后将玻璃纸揭下并剪成小块放入2.5%戊二醛溶液中固定12 h。固定后的样品用梯度乙醇溶液（体积浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%）逐级脱水10 min，再用叔丁醇置换样品中的乙醇。将样品用CO2临界点干燥仪（K850型，英国Quorum 公司）干燥2.5 h，再经高速离子溅射仪（E-1010 型，日立科学仪器有限公司）在样品表面喷镀一层金属导电膜后，在扫描电镜（TM-1000 型，日立科学仪器有限公司）下观察并拍照。

1.4 菌株ITS序列扩增

使用UNIQ-10 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取菌株基因组DNA，利用通用引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGG-3'）扩增其ITS 序列［16］。使用KOD FX 高保真DNA 聚合酶［东洋纺（上海）生物科技有限公司］进行PCR 反应，反应体系50 µL。其中，2×PCR buffer 25 μL，dNTPs 10 μL，上、下游引物各1.5 μL（0.3 μmol/L），KOD FX 聚合酶1 μL，DNA 模板1 μL（50 ng），无菌水10 μL。反应条件：94 °C 预变性2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，35 个循环；68 ℃延伸5 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒［康宁生命科学（吴江）有限公司］回收目的DNA片段。将扩增产物连接pMD18-T载体［宝生物工程（大连）有限公司］，转化大肠杆菌DH5α菌株后，送通用生物系统（安徽）有限公司测序。

1.5 系统发育分析

将菌株ITS 序列提交至NCBI 数据库，使用BLAST 在线程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源性比对。下载同源性较高的蜡蚧菌不同菌种ITS 序列，先利用ClustalW 程序（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）进行序列连配，连配结果导入MEGA X 软件，使用邻接法（neighbor-joining method）构建系统发育树，发育树各分支置信度经过Bootstrap 1 000次重复检验［17］。

1.6 菌株致病性测定与侵染症状观察

从SDAY 平板上收集分生孢子，在灭菌的0.05% Tween-80水溶液中充分分散，配制成5个不同浓度（1×104、1×105、1×106、1×107和1×108个/mL）的孢子悬浮液。采用浸虫法对烟蚜进行致病性测定，用毛笔尖挑取无翅成蚜浸入孢子悬浮液中，5 s 后取出。待试虫体表液体自然风干后，将其转接到新鲜烟草叶片上（叶柄处棉球保湿）并置于洁净的玻璃培养皿中，放入（25±1）℃、光周期L∶D=16∶8、相对湿度65%±2%的光照培养箱中饲养。每个处理30 头试虫，以0.05% Tween-80 无菌水溶液作为对照，设置3次生物学重复。每天观察菌株侵染试虫的症状，并记录死虫数。用毛笔尖碰触试虫，足与触角皆不动者视为死亡。将死亡的试虫保湿培养，并观察虫体表面菌丝生长情况，以确定是否被真菌侵染致死。

1.7 田间试验

田间试验在安徽农业大学农萃园实验基地进行。供试烟草品种为云烟87，株行间距为100 cm × 80 cm，采用常规水肥管理，整个生育期内未使用任何杀虫剂、杀菌剂和除草剂。试验设3 个处理，分别喷施1×106、1×107和1×108个/mL的悬浮液（0.05% Tween-80水溶液配制）。对照仅喷施0.05% Tween-80。处理和对照均重复3次，共12个小区，每小区面积20 m2。使用电动喷雾器（3WBD-16 型，台州市嘉能植保机械厂）进行整株喷雾，保证叶片正反面液滴分布均匀。喷雾前采用五点取样法从每个小区固定选取10株烟草，每株固定选取3片叶，用标签标记后调查虫口基数。分别于喷雾后3 d、5 d 和7 d 调查各处理植株叶片上的活虫数，并计算虫口减退率和防效。

计算公式：

1.8 数据处理

数据输入WPS Office 2019版软件，使用DPS软件［18］的Probit 模块求得毒力回归方程和致死中时间（median lethal time，LT50），用单因素方差分析法和Tukey’s HSD法分析不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 菌株形态特征

HFLD1 菌株在SDAY 平板上培养10 d 后，菌落直径约6.8 cm，整体呈薄絮状，质地较密，菌丝不蓬松。菌落正面乳白色，孢子粉白色（图1A），菌落背面乳黄色（图1B）。分生孢子梗自菌丝上直接长出，单生、对生或3～4 个轮生；分生孢子梗较长，且向上逐渐变细，形成瓶梗（图1C、D）。分生孢子在瓶梗顶部黏附、聚集，形成分生孢子头（图1E），分生孢子圆柱形，两端圆（图1F）。在适宜的培养环境下，菌株产生大量结晶（图1G）。基于以上特征，初步判断HFLD1为蜡蚧菌属真菌。

图1 HFLD1菌株的培养形状与形态特征Fig.1 Shape and morphological characteristics of HFLD1 strain

2.2 菌株分子生物学鉴定

以HFLD1 菌株的基因组DNA 为模板，扩增出一段577 bp 的ITS 序列（已提交至GenBank，登录号：MZ572198）。将该序列与GenBank 数据库中其他真菌物种的序列进行BLAST 比对，发现HFLD1菌株的ITS 序列与多个蜡蚧菌物种的ITS 具有较高的同源性。选取GenBank 数据库中蜡蚧菌属（Lecanicillium）共12 个代表性菌种的ITS 序列并构建系统发育树。结果（图2）表明，HFLD1 菌株与二型蜡蚧菌CBS 363.86（NR_111101）的亲缘关系最近，因此鉴定HFLD1为二型蜡蚧菌。该菌已于2022年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.40114。

图2 基于ITS序列的HFLD1菌株和其他蜡蚧菌的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of HFLD1 strain and other Lecanicillium species based on ITS sequences

2.3 菌株对烟蚜的致病性及其侵染过程

配制HFLD1菌株不同浓度孢子悬浮液，分析其对烟蚜的致病性。结果（表1）显示，孢子悬浮液浓度越大，试虫死亡率越高。孢子悬浮液浓度为1×108个/mL 时，处理后7 d 试虫累计校正死亡率达到95.06%，显著高于其他浓度处理的累计校正死亡率。使用Probit模型计算HFLD1菌株不同浓度孢子悬浮液致死烟蚜的LT50，结果（表2）表明，1×108个/mL浓度下的LT50最短，为3.28 d。

表1 HFLD1菌株侵染导致的烟蚜死亡率①Tab.1 Mortality rate of Myzus persicae after infection with HFLD1 strain

表2 HFLD1菌株对烟蚜的致病性回归分析Tab.2 Regression equations of pathogenicity of HFLD1 strain against Myzus persicae

使用1×108个/mL悬浮液接种烟蚜，观察HFLD1菌株侵染过程。接种1 d后，试虫未见明显变化；2 d后，试虫行动逐渐变得迟缓，3 d后，头部和胸腹部变为红褐色至褐色，4 d后，虫体干瘪皱缩，胸腹部和足变为深褐色，体表开始出现白色菌丝，之后菌丝逐渐布满整个虫体，见图3。

图3 烟蚜无翅成蚜感染HFLD1菌株后的外部症状Fig.3 Morphological characteristics of wingless adults of Myzus persicae after inoculation with HFLD1 strain

2.4 菌株对烟蚜的田间防效

不同浓度HFLD1 孢子悬浮液对烟蚜的田间防效如表3所示。从表3 中可见，使用1×108、1×107和1×106个/mL 悬浮液处理后3 d，对烟蚜的防效均较低，分别为34.10%、27.67%和24.64%。处理后5 d，3个处理组的防效均有所提高。其中以1×108个/mL悬浮液处理组的防效最高，为69.57%。处理7 d后，1×108个/mL 悬浮液处理组的防效仍为最高，达到79.87%，且显著高于1×107个/mL 处理（67.50%）和1×106个/mL 处理的防效（56.01%）。总体来看，HFLD1菌株对烟蚜的防效随着孢子浓度和处理时间的增加而提高。

表3 HFLD1菌株对烟蚜的防治效果Tab.3 Control efficacy of HFLD1 strain against Myzus persicae

3 讨论

昆虫病原真菌能够迅速侵染昆虫并致其死亡，因此可以利用其开展害虫生物防治，以减少化学农药使用量［7］。昆虫病原真菌对害虫的侵染包括体表附着、体壁穿透、体内定殖等阶段［19］。本研究中发现HFLD1菌株侵染烟蚜后，试虫行动逐渐迟缓，虫体颜色变深且干瘪皱缩。这一现象可能是由于HFLD1菌株已经侵入烟蚜血腔，破坏细胞和组织，消耗虫体养分，导致烟蚜活力减弱，直至死亡。当HFLD1 菌株在烟蚜体内生长一定时间后，则从虫体薄弱处穿出，因此本研究观察到试虫体表出现大量菌丝并产生大量孢子。这些新生的孢子可作为侵染源，持续控制烟蚜的种群数量［11］。

评价昆虫病原真菌是否具有应用于害虫生物防治的潜力，致病性是重要的评价标准之一。前人研究发现，使用蜡蚧轮枝菌和刀孢蜡蚧菌处理烟蚜7 d后，试虫的校正死亡率分别为84.99%和83.56%［12-13］；而使用长孢蜡蚧菌处理烟蚜10 d 后，试虫校正死亡率为74.5%［14］。本研究中还发现，HFLD1 菌株接种烟蚜7 d 后，试虫校正死亡率达到95.06%。因此，HFLD1菌株对烟蚜的致病性强于前人报道的其他蜡蚧菌种类。导致差异的原因可能是HFLD1 菌株分离自染菌烟蚜具有较强的寄主专化性，一般认为源自寄主的病原真菌对该寄主的致病性要高于来自其他寄主的病原真菌［20］。另一方面，烟蚜对不同种类病原真菌的免疫防御机制具有差异，可能也是导致真菌致病性不同的原因之一［21］。

本研究中HFLD1 对烟蚜的田间防效随着孢子浓度和处理时间的增加而提高。当HFLD1 浓度为1×108个/mL 时，处理7 d 后对烟蚜的防效达到79.87%。表明HFLD1 菌株对烟蚜具有较好的控制作用，可用于开发防治烟蚜的生物防治产品。但本研究中仅分析了单独使用HFLD1 菌株对烟蚜的防效，未考察HFLD1菌株与其他防治措施对烟蚜的协同防治效果。已有文献报道昆虫病原真菌与低剂量杀虫剂联用，不仅能提高杀虫效率，还有助于农药减量化［22］。因此，后续研究将联合使用HFLD1菌株和高效低毒杀虫剂，并评价其对烟蚜的防效。另一方面，在田间环境中，昆虫病原真菌对害虫的防治效果会因为低湿度的影响而下降［23］。有学者发现，通过喷施水雾增加环境湿度，能够将昆虫病原真菌的田间防效提高30%以上［24］。因此，后续试验将根据烟草品种的特性合理调控环境湿度因子，最大化地发挥HFLD1菌株对烟蚜的控制作用。

4 结论

从自然染菌的烟蚜上分离出1 株二型蜡蚧菌HFLD1。室内条件下，使用浓度为1×108个/mL 的HFLD1孢子悬浮液侵染烟蚜7 d后烟蚜死亡率达到95.06%，LT50仅为3.28 d；田间条件下，使用1×108个/mL 的HFLD1 孢子悬浮液处理7 d 后对烟蚜的防效为79.87%。HFLD1菌株对烟蚜具有极高的致病性，具有用于烟蚜生物防治的潜力。