液体活检在直肠癌新辅助治疗中的研究进展

赵韵琳 黄 诗 柯舒慧 林丹丹

武汉大学人民医院肿瘤中心，湖北武汉 430060

液体活检是指从体液中检测各种指标，主要是采集血液样本，检测指标包括细胞游离DNA（cell free DNA，cfDNA）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、微RNA（microRNA，miRNA）等。血液样本较组织样本更易获取、侵入性更小、监测更便捷，且液体活检为分子层面的检测，较肿瘤标志物更具特异性，能制订个性化的检测策略。

对于中低位局部晚期直肠癌（locally advanced rectal cancer，LARC），新辅助治疗后达临床完全缓解（clinical complete response，cCR）的患者甚至可行观察和等待（watch and wait，W&W）方案，与行全直肠系膜切除术的患者生存预后基本无差异[1]。评估LARC 患者新辅助治疗效果、监测疾病的复发及预测生存预后对患者治疗方案的选择及其重要，常用的血液学指标癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）特异性不高且结果较为单一[2]，因此，故探索创伤性更小、更简便且特异性更高的指标尤为重要。

研究证实液体活检在结直肠癌相关的多项研究中与疾病的早期发现、疗效预测及复发监测等多个节点相关[3]。

1 循环肿瘤DNA

1.1 ctDNA 在监测肿瘤复发中的应用

肿瘤细胞向血液中分泌单链或双链DNA 片段，此片段称为ctDNA。ctDNA 的半衰期（约2 h）使其能够用于动态和实时监测癌症进展，且ctDNA 的检测减少了肿瘤内基因异质性相关的偏倚，能从微观层面特异性监测肿瘤发生与发展[4]。早在2015 年就有研究者对接受nCRT 的LARC 患者进行ctDNA 的连续监测，发现患者治疗后ctDNA 下降，在CEA、影像学及病理监测到疾病复发前ctDNA 进行性升高[5]。对于目前LARC 中尚未大规模推行的W&W 策略，及时检测到疾病复发并接受抢救性手术尤为重要，Boniface 等[6]长期监测接受W&W 的LARC 患者，发现ctDNA 的升高早于临床检测的疾病复发，且其中1 例患者因局部复发行抢救性手术后ctDNA 下降。

这些研究显示ctDNA 能用于LARC 的复发监测，灵敏度比血液指标CEA 更高[5-6]。因此可在监测到患者ctDNA 升高时密切关注病情变化，有助于尽早发现肿瘤复发，进一步改善患者预后。

1.2 ctDNA 在评估患者nCRT 后最小残留病灶中的应用

LARC 患者经放化疗或手术后ctDNA 的检测率会有所下降，提示ctDNA 可能是由原发肿瘤释放[7]。而Liu 等[8]通过收集LARC 患者基线、nCRT 治疗过程中、nCRT 后及手术前的血样预测最小残留病灶（minimal residual diseases，MRD），发现ctDNA 状态和病理完全缓解（pathologic complete response，pCR）之间并没有关联。尽管有研究在术前48 h 内采集血样，但也得到了相同的结论[7]。现有研究支持了ctDNA 分析无法区分LARC 患者新辅助治疗后最小和无残留局部病灶的观点，目前不能用于选择患者进行非手术治疗（W&W 策略）[9-11]。但可通过ctDNA 的变化预估LARC 患者nCRT 疗效，有望与其他检测技术共同判断MRD 存在与否，为患者制订个性化治疗策略[12-13]。

1.3 ctDNA 与肿瘤分期及生存时间的关联

在LARC 患者中治疗前ctDNA 定量或者是否存在ctDNA 均与肿瘤TNM 分期无关，不同的检测技术得到的结论是相同的，但较高的ctDNA 定量与较高的死亡风险和大概率的远处转移相关[14-16]。术后可检测到ctDNA 的LARC 患者无复发生存时间显著短于术后不可检测到ctDNA 的患者[9]。在LARC 患者新辅助治疗后，NAR 评分通过治疗前后T 和N 的分期计算，能间接反映接受新辅助治疗的LARC 患者的最终生存结局，NAR 分值越低患者无病生存期越长[17]。Mcduff 等[15]采用NAR 评分将LARC 患者分组，并分析入组的29 例患者监测基线、nCRT 后及术后1～5 个月的ctDNA 变化，判断ctDNA 变化与NAR 关系，发现nCRT 后未检测到ctDNA 与检测到ctDNA 的患者比较，具有更高比例的NAR 低分和NAR 中分，进一步证实了ctDNA 能预估接受nCRT 治疗的LARC 患者的生存预后。

2 其他液体活检指标

2.1 细胞游离DNA

cfDNA 是指循环血液中的核酸类物质，在正常人血样中也存在[18]。有项研究证实LARC 新辅助放化疗（neoadjuvant radiochemotherapy，nCRT）前cfDNA 水平有利于鉴别高低危患者，基线cfDNA 水平高于第75个四分位数的患者与低于第75 个的四分位数患者比较，局部或远处复发的风险更高，无复发生存时间更短[19]。由于cfDNA 本身特异性不高，在LARC 患者评估中发挥作用较小，单用cfDNA 总量无法准确判断患者生存预后，判断nCRT 疗效亦存在一定困难[20]。

2.2 循环肿瘤细胞

CTC 为患者体液中的肿瘤细胞，部分研究采取测定mRNA 状态判定CTC 的存在，而主要检测方法仍是通过特异性靶点，着重于CTC 检出与预后的关系，进一步分析CTC 上表达靶点对pCR 的预测作用[21]。

2.2.1 CTC 与患者生存预后 对肿瘤患者而言，CTC 检出率越高往往提示疾病预后不佳[21]，与以往研究结果不同，Magni 等[22]通过CellSearch System 识别接受nCRT的LARC 患者血液中有细胞核且胞质表达CD45 靶点的CTC，CTC 阳性并没有达到统计学意义上的与预后相关。但该研究中CTC 的检测效率较低，检测效率是否影响了实验结果无法评估，所以CTC 能否预估LARC 患者nCRT 后的生存状态仍存在争议，未来需大量实验验证。

2.2.2 CTC 评估nCRT 后反应 多项研究表明，CTC 检出率及RAD23B/TYMS 是否缺失与肿瘤疗效相关，在LARC 患者nCRT 中也得到了相同的结果，即CTC 检出率越高、RAD23B/TYMS 缺失者疗效更差[23-25]。为了进一步评估CTC 能否辅助检测LARC 患者的MRD，有研究将PET、高分辨率MRI、CT 灌注成像及CTC 综合检测MRD，表明当与CT 灌注成像的全肿瘤通透性和平均通过时间测量相结合时，CTC 可能有助于提高治疗反应评估的准确性[26]。由于CTC 的检测技术不同，效率也不尽相同，进一步提高CTC 检测效率或是寻找更多的靶点能更好识别MRD，为nCRT 后达到cCR 的LARC 患者是否接受手术治疗提供支持依据。

2.3 微RNA（microRNA，miRNA）

通过检索发现miRNA 在新辅助治疗LARC 中的应用集中在对nCRT 反应状态的评估，miRNA检测中多选用特异的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），研究发现miRNA 相关SNP-SMAD3-rs744910、SMAD3-rs745103 和TRBPrs6088619 与nCRT 后pCR 率增加相关，而DROSHA rs10719 和SMAD3-rs17228212 提示更差的治疗反应[27]。还有研究比较了LARC 患者中对nCRT 敏感及不敏感的组别中的miRNA，确定miRNA-345 为检测指标，发现基线血样中miRNA-345 低表达与nCRT 高应答显著相关[28]。另有研究提取LARC 患者外泌体中的miR NA，发现对新辅助治疗不敏感的患者中miR-29a-3p高表达和miR-301a-3p 低表达，此外，miR-141-3p、miR-375、miR-423-5p 和miR-431-3p 在LARC 肝转移患者（4 例）中的表达均较高[29]。

不同的miRNA 及miRNA 突变位点能预测LARC 患者nCRT 疗效，但现有研究缺乏miRNA 评估LARC 患者的长期生存预后的数据，有待进一步探索。

3 总结与展望

本文综合阐述液体活检在LARC 新辅助治疗中的现状及应用前景，有关研究探索集中在ctDNA、cfDNA、CRC 和miRNA。目前与LARC 新辅助治疗效果预测及长期预后监测密切相关的主要是ctDNA，术前ctDNA 联合影像学可提升pCR 检出率[30]，术后ctDNA 可预测手术残存的MRD，较传统MRI 及CEA检测能更及时监控并预测肿瘤复发，特别是在达到病理完全缓解从而等待观察的LARC 患者中，能辅助患者尽早发现肿瘤病灶，及时进行补救性手术。

由于液体活检中基线和新辅助治疗后ctDNA 的状态无法预估pCR，限制了单独使用ctDNA 选择器官保留方法。ctDNA 的检测还未标准化，各项实验中时间节点、采集部位、检测方法等方面存在差异。未来研究可以将液体活检补充至预测LARC 新辅助治疗反应的传统方法中，判断结合传统指标能否更好地预测患者达到pCR，或在新辅助治疗甚至全程治疗中，监测疗效、评估预后及监测复发，同时对于术后及等待观察的患者，更好地寻找下一步干预节点及辅助治疗手段，评估液体活检的应用是否能进一步提高接受新辅助治疗的LARC 患者生存时间和生存质量。