基于化学模式识别的益智仁盐炙前后高效液相色谱指纹图谱研究

张馨予，周韫曦，范娟，卞艺萍，魏艳萍，周丽苹，李生茂（川北医学院药学院，四川南充 637000）

益智是姜科植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟果实，经炮制去壳后以益智仁入药，性温，味辛，具有温脾止泻摄涎、暖肾固精缩尿的功效，主治肾虚遗尿，小便频数，遗精白浊，脾寒泄泻，腹中冷痛，口多唾涎[1]。研究[2-4]显示，益智含有二苯基庚烷类、倍半萜类、黄酮类、挥发油类、苷类和甾体等化学成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、增强免疫力及神经保护等药理作用。中医认为，益智仁生品有较大燥性，归脾经，温脾止泻、收摄涎唾的作用较强[5]。盐炙可缓和其燥性，主入肾经，温肾固精缩尿的作用增强[6]。现代研究[[7-13]显示，益智仁盐炙后挥发油的含量和组成，以及白杨素、圆柚酮、益智酮甲、益智酮乙、益智醇等含量会发生明显变化，并产生5-羟甲基糠醛等成分。但采用指纹图谱结合化学模式识别法分析比较益智仁盐炙前后整体化学成分差异及其潜在质量差异标志物的研究报道较少。

中药化学指纹图谱可比较全面地反映中药及其制剂中内在化学成分的种类和数量，进而对其质量进行整体描述和评价[14]。其中，高效液相色谱（HPLC）指纹图谱具有分离效率高、分析速度快、选择性高、灵敏度高及稳定性好等特点，已成为构建指纹图谱的最常用方法之一[15]。故本实验采用HPLC 法分别建立了益智仁盐炙前后的指纹图谱，并结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLSDA）法比较益智仁盐炙前后化学成分的差异，并筛选出益智仁盐炙前后的潜在差异标志物，为益智仁的盐炙机理及质量控制研究提供一定的参考。

1 仪器和试药

1.1 仪器Agilent1220 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Ohaus Discovery十万分之一电子天平（美国奥豪斯公司）；KQ-300DE台式数控超声波清洗器（东莞市科桥超声波设备有限公司）；TGL-18 台式高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）。

1.2 试药5-羟甲基糠醛（批号：wkq22051703）、原儿茶酸（批号：wkq22011301）、原儿茶醛（批号：wkq22041904）、表儿茶素（批号：wkq22081611）、白杨素（批号：wkq22060108）、杨芽黄素（批号：wkq22021608）和圆柚酮（批号：wkq22051807），四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均不小于98%；山奈素，四川省成都市曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-18040502，纯度≥98%；乙腈、甲醇，均为色谱纯，美国诺尔施公司，批号：2020041301、2020040701；甲醇、冰乙酸，均为分析纯，成都市科隆化学品有限公司，批号：2022011802、2018071701；实验用水为娃哈哈纯净水。

1.3 药材益智饮片经川北医学院药学院李毅主任中药师鉴定为姜科植物益智（AlpiniaoxyphyllaMiq.）的干燥成熟果实，经人工剥壳，得到其种子团（益智仁）。12 批益智仁饮片（S1～S12，购自成都市荷花池药材批发市场，其中S1～S3 产自广东省；S4～S6 产自广西省；S7～S11 产自海南省；S12 产自云南省），按照2020 年版《中华人民共和国药典》通则“0213 盐炙法”制成盐益智仁（YS1～YS12）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Agilent C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相：0.05% 乙酸水（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脱：13%→17%B（0～5 min），17%→20%B（5～10 min），20%→30%B（10～12 min），30%→38%B（12～18 min），38%→55%B（18～25 min），55%→60%B（25～28 min），60%→62%B（28～30 min），62%→65%B（30～34 min），65%→70%B（34～36 min），70%→80%B（36～40 min）；80%B（40～45 min）；进样量为15 μL；流速为0.4 mL·min-1；柱温为25 ℃；检测波长为250 nm。

2.2 供试品溶液配置精密称取益智仁药材粉末（过3 号筛），约0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇20 mL，称定质量；超声（功率250 W，频率40 kHz）提取40 min，放冷；再称定质量，并用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液。

2.3 对照品溶液配置精密称取对照品5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、原儿茶醛、表儿茶素、白杨素、山奈素、杨芽黄素和圆柚酮适量，精密加入60%甲醇配制成浓度分别为0.059 8、0.0272 4、0.0473 4、0.304 8、0.080 2、0.043 4、0.095 3和0.219 1 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1精密度考察 精密称取益智仁药材（YS6）粉末（过3 号筛），约0.5 g，按“2.2”项下提取方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，计算各主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，以圆柚酮为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.6%，相对峰面积的RSD 均小于4.6%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2稳定性试验 精密称取益智仁药材（YS6）粉末（过3 号筛），约0.5 g，按“2.2”项下提取方法制备样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算各主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，以圆柚酮为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.8%，各共有峰相对峰面积的RSD 均小于4.7%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.4.3重复性试验 精密称取益智仁药材（YS6）粉末（过3号筛）6份，每份约0.5 g，按“2.2”项下提取方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算各主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，以圆柚酮为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.7%，各共有峰相对峰面积的RSD 均小于4.9%，表明该方法的重复性良好。

2.5 益智仁生品及盐炙品HPLC 指纹图谱的建立及相似度评价

2.5.1益智仁生品及盐炙品HPLC 指纹图谱建立 取益智仁生品及盐炙品，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录12批益智仁盐炙前后样品的HPLC 色谱图。将12 批益智仁生品和盐炙品的HPLC色谱图数据分别导入国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 年A 版）》软件进行分析评价。分别以S1 和YS1 为参照图谱，选择中位数法，设置时间窗为0.1，经多点校正自动匹配后生成共有模式对照指纹图谱。生品和盐炙品指纹图谱分别确定了30和32个色谱峰，经与对照品比对，指认出8个成分，分别为X2 峰（5-羟甲基糠醛）、1 号峰（原儿茶酸）、2 号峰（原儿茶醛）、4 号峰（表儿茶素）、21 号峰（白杨素）、22 号峰（山奈素）、25 号峰（杨芽黄素）和26 号峰（圆柚酮）。盐炙品相较于生品多两个共有色谱峰，分别是峰X1 和峰X2。12 批益智仁生品及其盐炙品HPLC指纹图谱及混合对照品HPLC色谱图见图1～图3。

图1 益智仁生品高效液相色谱（HPLC）图Figure 1 HPLC Chromatograms of the raw Alpiniae oxyphyllae Fructus（AOF）samples

图2 益智仁盐炙品高效液相色谱（HPLC）图Figure 2 HPLC chromatograms of the salt-processed AOF

图3 混合对照品溶液高效液相色谱（HPLC）图Figure 3 HPLC chromatograms of mixed reference substances

2.5.2相似度评价 计算12 批益智仁生品和12 批盐炙品与各自对照图谱的相似度。结果见表1。12批益智仁生品和12 批益智仁盐炙品的指纹图谱相似度均良好，均在0.9以上。26号共有峰（圆柚酮）分离度及峰形较好，且峰面积较大，故将26 号峰作为参照峰（S）。以26 号峰为参照峰（S）计算各主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果12 批益智仁生品和盐炙品的HPLC指纹图谱中各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.1%，各共有峰相对峰面积的RSD 分别为3.37%～43.23%及3.99%～42.53%，共有峰峰面积之和占总峰面积的70.07%～75.83%及71.98%～77.14%。

表1 12 批益智仁生品和12 批盐炙品指纹图谱相似度比较Table 1 Fingerprint similarity results of 12 batches of raw and salt-processed AOF

2.6 HPLC 指纹图谱的化学模式识别

2.6.1主成分分析（PCA） 采用SPSS 23.0软件对12批益智仁生品及12批盐炙品的HPLC指纹图谱共有峰峰面积进行主成分因子分析，得到主成分特征值、贡献率、累计贡献率和主成分碎石图。见表2 和图4。结果表明当主成分为5 时，累计贡献率达到90.15%，特征值均大于1，提示益智仁盐炙前后的指纹图谱中共有峰的大部分信息可以被这5个新变量替代。将12 批益智仁生品及12 批盐炙品的HPLC 指纹图谱共有峰峰面积导入SIMCA-P14.1 软件进行PCA分析，采用中心化模式，得到PCA 得分图。结果见图5。益智仁生品和盐炙品大致被分别聚为一类。表明益智仁盐炙前后化学成分有一定的差异。

表2 益智仁生品和盐炙品主成分因子的特征值、贡献率及累计方差贡献率Table 2Eigenvalues， variance contribution rates and cumulative variance contribution rates of principal components factor of raw and salt-processed AOF

图4 益智仁生品和盐炙品主成分分析的碎石图Figure 4 The score plot of principal component analysis（PCA）of raw and salt-processed AOF.

图5 益智仁生品和盐炙品PCA 得分图Figure 5 PCA score plot of raw and salt-processed AOF

2.6.2正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA） 将12 批益智仁生品及12 批盐炙品的HPLC 指纹图谱共有峰峰面积导入到SIMCA-P14.1 软件，采用OPLSDA 模式进行分析。结果显示，监督模型对X矩阵的解释率R2X（cum）、对Y矩阵的解释率R2Y（cum）和模型的预测能力Q2（cum）分别为0.893、0.950和0.835，均大于0.5，说明建立的模型准确稳定，可用于区分益智仁生品及其盐炙品。由图6可知，益智仁生品和盐炙品被分别聚为一类。采用变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）法筛选出具有统计学意义的差异标志物，VIP值越大，对区分组的贡献越大[15]。结果见图7。以VIP＞1为筛选标准，共筛选出12 个影响益智仁生品与盐炙品分组的成分，其影响程度依次为峰X1＞峰26（圆柚酮）＞峰16＞峰3＞峰X2（5-羟甲基糠醛）＞峰25（杨芽黄素）＞峰15＞峰12＞峰8＞峰10＞峰17＞峰20。表明这些成分对区分益智仁盐炙前后样品具有较大的贡献，可作为潜在标记物来评价益智仁盐炙前后的质量差异。将以上模型进行200 次置换检验，结果见图8。由图8可知，R2和Q2截距值分别为0.613和-1.06，所有R2和Q2的左边的点都低于最右边的点，说明建立的OPLS-DA 模型未出现过拟合现象，具有较好的预测能力。

图6 益智仁生品和盐炙品OPLS-DA 得分图Figure 6 OPLS-DA score plot of raw and salt-processed AOF

图7 益智仁生品和盐炙品VIP 值图Figure 7 VIP value plot of raw and salt-processed AOF

图8 益智仁生品和盐炙品OPLS-DA 模型置换检验图Figure 8 Permutation test chart of OPLS-DA model of raw and salt-processed AOF.

3 讨论

3.1 样品前处理与色谱条件选择本实验考察了不同提取方式（冷浸、超声提取）、不同提取溶剂（水、不同浓度的甲醇和乙醇）以及不同提取时间（20、40 和60 min）对益智仁样品提取效果的影响。结果发现60%甲醇超声提取时色谱峰最多，峰形较好；超声提取40 min，即可基本提取完全。故本试验选择以60%甲醇超声提取40 min 作为样品溶液制备方法。同时还考察了不同流动相系统（甲醇∶水、乙腈∶水、乙腈∶不同浓度乙酸水）、梯度洗脱条件、流速（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和0.9 mL·min-1），柱温（20、25、30、35 ℃）和检测波长（240、250、260 和270 nm）等影响HPLC分离效果的因素。最终确定本研究的色谱条件。该色谱条件下色谱峰数量多，主要色谱峰峰形较好、分离度高。

3.2 益智仁盐炙前后的HPLC 指纹图谱分析本实验建立了益智仁生品及盐炙品各12 批样品指纹图谱，两者相似度都在0.9以上，表明各批次的益智仁生品及盐炙品都具有较好的一致性。益智仁生品及盐炙品各共有峰相对峰面积的RSD 分别为3.37%～43.23%及3.99%～42.53%，共有峰峰面积之和占总峰面积的70.07%～75.83%及71.98%～77.14%，提示益智仁生品与盐炙品各批次间虽然化学成分组成相似，但所含的化学成分相对含量差异较大。除此之外，经对照品比对，指认出1、2、4、21、22、25 和26 号峰分别是原儿茶酸、原儿茶醛、表儿茶素、白杨素、山奈素、杨芽黄素和圆柚酮，并发现益智仁盐炙后新增两个色谱峰，经对照品比对，其中一个是5-羟甲基糠醛，这与李文兵的研究结果[13]相似，另一个色谱峰所代表的化学成分有待于进一步研究。PCA 及OPLS-DA 结果显示，益智仁生品及盐炙品被分别聚为一类，表明益智仁盐炙前后化学成分存在一定的差异。VIP 共筛选出12 个差异性标志物，分别是X1、26（圆柚酮）、16、3、X2（5-羟甲基糠醛）、25（杨芽黄素）、15、12、8、10、17、20 号峰，提示这些成分可能是益智仁盐炙前后主要的差异成分，可作为益智仁盐炙潜在差异性标志物。但本实验仅确定了其中的26、X2和25号色谱峰所代表的成分，其余9个差异性成分有待进一步确认。

3.3 潜在差异性标志物分析中医认为益智仁生品入脾，盐炙入肾，生熟有别。现代药理研究[6，16]显示，益智仁盐炙后肠道燥性效应降低，缩尿作用增加。本研究通过OPLS-DA 分析共筛选出圆柚酮、5-羟甲基糠醛和杨芽黄素等12 个潜在差异标志物。圆柚酮可以明显降低水负荷多尿大鼠模型尿量，延长模型大鼠首次排尿时间，可能是对益智仁缩尿功效有较大贡献的成分[17]。秦贞苗等[18]测定了大鼠灌胃缩泉方制剂后尿、粪中的益智活性成分及代谢物，并在大鼠尿液中检测到圆柚酮、益智酮甲和杨芽黄素，推测这3种成分可能是益智仁中发挥膀胱调节功能的活性成分，进一步为圆柚酮和杨芽黄素作为益智仁盐炙前后差异性标志物的提供了证据。5-羟甲基糠醛是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的糠醛化合物，存在于多种单味中药材中，也是许多中药材炮制过程中的产物[19]。研究[20-21]表明，5-羟甲基糠醛具有抗氧化、抗过敏、降低血糖和神经保护等药理作用，同时也有肾毒性、致敏性，对眼、皮肤及呼吸道黏膜有一定的刺激性。本研究结果显示，益智仁生品中仅有S1、S3和S5中测得5-羟甲基糠醛，而盐炙品中均测出5-羟甲基糠醛，且含量较高，这可能是益智仁在盐炙过程中温度升高使多糖类成分发生美拉德反应所产生或使其原有含量增加所致。有研究[22]报道，5-羟甲基糠醛含量变化与炮制程度具有一定关联性，可作为判断炮制终点的指标用于区分生品和炮制品。但目前关于5-羟甲基糠醛与益智仁盐炙前后功效相关的研究尚未有报道，还需做进一步的药效学研究。

本研究建立了益智仁盐炙前后HPLC 指纹图谱，所建立的方法有效、准确。同时结合PCA及OPLS-DA判别分析，初步筛选出益智仁盐炙前后变化的差异标志物。该方法可对益智仁生品及盐炙品质量进行综合评价，并为益智仁盐炙机制研究的提供参考。