基于可培养技术的中国不同城市家用冰箱中真菌多样性研究

刘学孜,张晶晶,刘冲,白飞荣,赵贞尧,袁帅,庞玲玲,张永飞,张文赵,王喆*,姚粟*

1(合肥华凌股份有限公司,安徽 合肥,230601)2(中国食品发酵工业研究院有限公司,北京,100015)3(中标能效科技(青岛)有限公司,山东 青岛,266200)

冰箱是现代家庭不可或缺的家用电器之一,其所提供的低温环境在食品保鲜、延长食品存储期等方面起到了重要作用[1]。冰箱低温环境可抑制大部分微生物的活性,减缓微生物的生长速度,但一些嗜冷微生物在食品储藏过程中仍可引起食物的腐败变质[2]。因此,在冰箱的使用过程中,如果未进行定期清理,可能存在微生物交叉污染现象。

近年来国内外已陆续开展家用冰箱微生物卫生状况调研和群落多样性研究,如CATELLANI等[3]采集了293台冰箱冷藏室垂直侧壁、蔬菜框底部部位样品,发现冷藏室平均微生物总数为(1.2±1.2) lg CFU/cm2,其中最大值为3.6 lg CFU/cm2。沈瑾等[4]在家用冰箱霉菌和酵母菌的研究中发现,有86个标本每平方厘米表面的霉菌总数对数值≥1,有16个标本每平方厘米表面的酵母菌总数对数值≥2.5,微生物污染较为严重,存在安全隐患。YE等[5]采用扩增子测序的方法检测了中国国内16台冰箱的冷藏室空气和搁架、底部和内壁等接触表面,发现冰箱内环境的真菌在科水平上,酵母菌科占比在0～50.95%,是真菌中检出频率占比最高的菌科。羊宋贞等[6]从家庭冰箱中分离获得微生物158株,其中真菌74株,主要包括迈耶氏酵母属(Meyerozyma)、红酵母属(Rhodotorula)、枝孢菌属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)等类群,其中致病真菌4株,分别为黑色毛壳菌(Chaetomiumnigricolor)、威尼克何德霉(Hortaeawerneckii)、Lacazialoboi和Pseudozymaaphidis。2010年全球卫生理事协会公布的报告[7]显示,44%家庭的冰箱已有霉菌繁殖扩增的迹象。祝白春等[8]、辛克铭等[9]在研究中发现餐饮业冰箱中存在着严重的霉菌污染,但没有进一步对霉菌的种类做详细的分析。目前,针对我国不同地域来源冰箱中不同位点可培养微生物的系统性研究鲜有报道。

本研究选取了中国不同地域5个代表城市的15台冰箱作为研究对象,基于可培养技术系统研究了冰箱使用过程中冷藏和冷冻区域真菌多样性,分析了优势真菌类群的分布规律,探究了冰箱中真菌的污染状况,重点分析了关键特征微生物的致味、致腐和致病特性,为升级优化冰箱保鲜技术以及相关抗菌材料的开发提供了基础资源和数据参考。

1 材料与方法

1.1 样品信息

2021年11月至2022年5月,依据地理位置以及不同地域饮食习惯差异,选取哈尔滨、北京、青岛、成都和广东5个城市的15台冰箱作为研究对象,详细信息见表1。每台冰箱设置4个采样位点(包括果蔬篮、冷藏室门搁架、冷冻室内壁和冷藏室空气),共入户采集到60个样品。

表1 样品信息

1.2 试剂与仪器

麦芽提取粉琼脂(malt extract agar,MEA)培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基、0.85%生理盐水,北京陆桥技术股份有限公司;丙三醇,国药集团化学试剂有限公司;真菌DNA提取试剂盒,美国Omega Bio-Tek公司;PCR MasterMix、DL 2000 Marker,北京全式金生物技术有限公司;PCR引物,生工生物工程(上海)股份有限公司。

AC2-6S1 CLASS II TYPE A2生物安全柜,益世科(上海)企业发展有限公司;隔水式培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;微量可调移液器,德国Eppendorf公司;冰箱,海尔智家股份有限公司;电子天平,常熟市佳衡天平仪器有限公司;高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;生物样品均质器,奥然科技(北京)有限公司;PCR仪,美国应用生物系统公司;Gel DoCqM EZ凝胶成像仪、EC250-90电泳仪,伯乐生命医学产品(上海)有限公司;高压灭菌锅,日本HIRAYAMA公司;MA-100ST浮游菌采样器,西瓦卡精密量仪(东莞)有限公司。

1.3 采样方法

根据GB/T 18204.4—2013《公共场所卫生检验方法 第4部分:公共用品用具微生物》,在冰箱内接触表面冷藏室门搁架、果蔬篮、冷冻室抽屉内壁各选取5个位点,将无菌棉拭子于无菌生理盐水中浸润,在每个采样点(5 cm×5 cm)均匀涂抹5次后洗入同一管5 mL无菌生理盐水中,用灭菌剪刀剪去棉签与手接触部位,将剩余的棉拭子置于无菌生理盐水,封口并置于采样箱中,于2～8 ℃下保存并运输,每个采样区域收集2份样品。

根据GB/T 18204.3—2013《公共场所卫生检验方法 第3部分:空气微生物》,对冰箱冷藏室空气进行采样,将贴有玻璃纸的PDA培养基放入浮游菌采样器内,置于冰箱冷藏室进行采样,采样流量为100 L/min,采样时间10 min。采样完成后将培养皿用封口膜密封,于2～8 ℃下保存并运输。

1.4 真菌的分离纯化

冰箱接触表面采集的样品原液,以10倍梯度逐级稀释,制得1∶10(mL∶mL)的样品菌悬液。采集的冷藏室空气样品,将PDA培养基上的玻璃纸置于无菌培养皿中,用5 mL PBS缓冲液进行反复冲洗回收,制成样品菌悬液。吸取样品原液和稀释后的菌悬液100 μL分别涂布于PDA和MEA固体培养基上,每组2个平行,分别放置于28 ℃和6.5 ℃条件下培养7～10 d,每天观察不同条件下的菌落特征(包括大小、形状、颜色、质地、有无渗透液、有无可溶性色素等),选取不同形态的单菌落进行平板划线,纯化得到的菌株保存于甘油管中。记录不同菌株的菌落特征和数量,根据稀释梯度计算冰箱内接触表面每平方厘米和冷藏室空气每立方米的菌落数。

1.5 真菌的菌种鉴定

利用真菌DNA提取试剂盒提取实验菌株的基因组DNA,称取200 mg的菌丝体至1.5 mL的无菌研磨管内(内含0.1 mm石英砂,0.4 g 1.5 mm锆株,0.3 g 3.0 mm锆珠),加入200 μL的裂解液,置于生物样品均质器内破碎2 min,按照试剂盒说明进行DNA提取。参照ZHANG等[10]的方法,对实验菌株进行PCR扩增,通过核糖体翻译间隔序列(ITS rDNA)进行菌种鉴定,如果鉴定不到属水平,进一步通过核糖体rDNA大亚基序列(26S D1/D2)[11]鉴定,引物信息见表2。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共27个循环;72 ℃ 10 min。扩增后获得约600 bp的DNA片段,由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成测序。将测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对,搜索同源序列,以97%序列相似性做为判定标准完成菌种鉴定。

表2 引物信息

1.6 数据分析

使用WPS 2019进行数据统计分析,RStudio绘制主成分分析图和Venn图。

2 结果与分析

2.1 家用冰箱中真菌污染情况

15台冰箱共60个样品中可培养真菌总数的检测结果如表3所示。结果显示,15台冰箱的果蔬篮中真菌平均菌落数为115 CFU/cm2,嗜冷真菌平均菌落数为46 CFU/cm2;冷藏室门搁架中真菌平均菌落数为25 CFU/cm2,嗜冷真菌平均菌落数为12 CFU/cm2;冷冻室中真菌平均菌落数为32 CFU/cm2,嗜冷真菌平均菌落数为17 CFU/cm2;冷藏室空气真菌平均菌落数<1 CFU/m3,无嗜冷真菌检出。5个城市中,广东地区3台冰箱的平均真菌总数为260 CFU/cm2;北京地区3台冰箱的平均真菌总数为22 CFU/cm2;哈尔滨地区3台冰箱的平均真菌菌落总数较高为377 CFU/cm2;成都地区3台冰箱的平均真菌总数为72 CFU/cm2;青岛地区3台冰箱的平均真菌总数为125 CFU/cm2。因此,本研究在不同位点的冰箱样品中检测的真菌污染情况具有明显差异,其中果蔬篮的真菌污染情况最为严重,G3冰箱果蔬篮的真菌菌落总数最高,为6.22×102CFU/cm2;在不同城市的不同用户中均有不同程度的真菌污染,没有明显地域规律,其中广东G3冰箱的真菌菌落总数最高为699 CFU/cm2,哈尔滨H1中真菌菌落总数为686 CFU/cm2。已有不同国家研究表明,细菌和真菌均可在冰箱内表面大量生存,冰箱的内表面底部污染较为严重[14],并且微生物污染与冰箱清洁频率和方法之间存在相关性[15]。

表3 冰箱样品的真菌总数及嗜冷真菌总数

2.2 家用冰箱中真菌的分离鉴定结果

2.2.1 冰箱中真菌总体分离鉴定结果

在60个冰箱来源样品中通过可培养方法共分离获得39个属的216株真菌,分离株数>2的真菌如图1所示。在属水平上分离频次较高的真菌主要为青霉属(Penicillium),共44株,占分离总菌数的20.37%;枝孢菌属(Cladosporium)共41株,占分离总菌数的18.98%;曲霉属(Aspergillus)有28株,占分离总菌数的12.96%;红酵母属(Rhodotorula)有21株,占分离总菌数的9.72%;线黑粉酵母属(Filobasidium)有9株,占分离总菌数的4.16%。分离到的这些微生物系空气、土壤、植物中比较常见的微生物,如青霉属(Penicillium)以腐生方式生活,生长在腐烂的水果、蔬菜、肉类和各种潮湿的有机物上;曲霉属(Aspergillus)可导致果蔬面包类食物腐败;轮枝菌属(Gibellulopsis)为嗜冷微生物,常见于植物根茎的下部。

图1 分离株数>2的真菌

在28 ℃培养条件下,共分离到37个属,169株真菌,主要优势属为青霉属(Penicillium)、枝孢菌属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula),与总分离结果基本一致。6.5 ℃培养条件下,共分离获得嗜冷真菌13个属,47株,详见表4,占分离总菌数的21.76%,优势类群主要为枝孢粉菌属(Cystofilobasidium)、线黑粉酵母属(Filobasidium)、维希尼克氏酵母属(Vishniacozyma)、红酵母属(Rhodotorula),其中果蔬篮分离到的嗜冷真菌菌株最多(20株),冷藏室空气分离到的嗜冷真菌菌株最少(5株)。由图2可知,28 ℃与6.5 ℃培养条件下共分离获得11个属的共有菌属,其中枝孢菌属(Cladosporium)和青霉属(Penicillium)在2种培养条件下的分离频次均较高,表明这两类菌适应生长的温度范围较广,可以在4～28 ℃的范围下生长。28 ℃培养条件下共分离获得26个属的特有真菌,其中分离频次较高的有亚隔孢壳属(Didymella)、节菱孢属(Arthrinium)与耙齿菌属(Irpex)等。6.5 ℃培养条件下共分离获得2个属的特有真菌,为维希尼克氏酵母属(Vishniacozyma)和假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)。普通冰箱冷藏室的温度抑制绝大多数微生物的生长,但是一些嗜冷真菌能在低温环境中仍可生长繁殖[16],在加速食物变质的同时,还对人们的身体健康构成安全隐患,这类微生物在后续的抗菌、除菌技术的优化升级中需重点关注。

图2 28 ℃及6.5 ℃培养条件下分离的共有真菌及特有真菌

表4 冰箱中嗜冷真菌分布情况

2.2.2 不同城市家用冰箱中真菌分布情况

为探究地域因素对冰箱使用过程中真菌多样性的影响,对所选5个城市中冰箱分离株种类和数量在属水平上进行统计,分离频次>2的真菌分离株与其分离频次如图3所示。广东地区共分离获得19个属,58株真菌,分离频次较高的真菌为枝孢菌属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)等;北京地区共分离获得15个属,44株真菌,分离频次较高的真菌为枝孢菌属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)等;哈尔滨地区共分离获得17个属,53株真菌,分离频次较高的真菌为青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)等;成都地区共分离获得12个属,32株真菌,分离频次较高的真菌为红酵母属(Rhodotorula)、曲霉属(Aspergillus)、枝孢菌属(Cladosporium)、线黑粉酵母属(Filobasidium)等;青岛地区共分离获得9个属,29株真菌,分离频次较高的真菌为枝孢菌属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、红酵母属(Rhodotorula)等。通过主成分分析,如图4-a所示,北京、青岛、成都、哈尔滨可培养真菌群落结构具有较高的相似性,成都地区的群落结构相对聚集,表明成都地区的样品间差距较小,广州地区微生物集群聚集相对分离,表明广州地区受试样本的微生物群落结构相对独特。

图3 不同城市冰箱中分离频次>2的真菌分离株与其分离频次

a-不同采样城市样品可培养真菌的主成分分析;b-不同城市间家用冰箱样品的共有真菌分析(属水平)

在北京、哈尔滨、成都、广东、青岛5个城市中共分离获得5个共有菌属,分别为青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、枝孢菌属(Cladosporium)、红酵母属(Rhodotorula)和泡囊线黑粉菌属(Cystofilobasidium),详见图4-b,其中青霉属(Penicillium)分离频次最高,该属的种类很多,在蔬菜、粮食、肉类和食物上常有分布,多呈灰绿色,部分该属菌株有致病性,引起角膜、皮肤、外耳、呼吸道、泌尿系统感染和心内膜炎,可在严重免疫功能低下患者中引起播散性疾病,许多菌株产生真菌毒素。枝孢菌属(Cladosporium)主要分离自空气、植物、土壤和临床人体肺部组织,属于三类致病菌,能引起鼻窦炎和肺部感染。广东地区分离到的特有菌属最多,青岛地区冰箱中没有分离到特有菌属,成都地区分离到的红酵母属(Rhodotorula)的菌株较多,该属菌株以胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)为主,在28 ℃和6.5 ℃温度下均可生长。不同城市的冰箱内,有其独特的可培养真菌多样性组成,可能与城市气候、不同地区的使用习惯、室内空气环境质量等相关。

2.2.3 不同采样位点家用冰箱中真菌分布情况

为探究采样位置对冰箱使用过程中真菌多样性的影响,对所选4个位置中冰箱分离株种类和数量在属水平上进行统计,分离频次>2的真菌分离株与其分离频次详见图5。冷藏室门搁架共分离获得17个属,47株真菌,分离频次较高的真菌为青霉属(Penicillium)、枝孢菌属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)等;冷冻室内壁共分离获得18个属,44株真菌,分离频次较高的真菌为:枝孢菌属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)、红酵母属(Rhodotorula)、曲霉属(Aspergillus)、线黑粉酵母属(Filobasidium)等;冷藏室空气共分离获得13个属,57株真菌,分离频次较高的真菌为青霉属(Penicillium)、枝孢菌属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)等;果蔬篮共分离获得23个属,68株真菌,分离频次较高的真菌为枝孢菌属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)、红酵母属(Rhodotorula)、曲霉属(Aspergillus)、泡囊线黑粉菌属(Cystofilobasidium)等;通过主成分分析所示(图6-a),冷藏室空气、果蔬篮、冷藏室门搁架和冷冻室内壁4个采样位点的群落结构都相对分散,且彼此之间没有显著差异。

图5 不同采样位置冰箱中分离频次>2的真菌分离株与其分离频次

a-家用冰箱不同采样位点可培养真菌的主成分分析;b-家用冰箱不同采样位点的共有真菌分析(属水平)

在冷藏室门搁架、冷冻室内壁、冷藏室空气、果蔬篮4个采样位置中,共有真菌菌属为青霉属(Penicillium)、红酵母属(Rhodotorula)、曲霉属(Aspergillus)和枝孢菌属(Cladosporium),如图6-b所示。果蔬篮的特有菌株最多,冷藏室门搁架的特有菌株最少。不同采样位置的冰箱内,有其独特的可培养真菌菌属组成,可能与不同位置用户冰箱内储存食材种类、冰箱清洗习惯、室内空气环境质量等相关。

3 讨论与结论

冰箱作为家庭生活中必不可少的电器之一,在保鲜和预防食物变质等方面起到了重要作用。本研究通过可培养法共分离获得216株真菌,分布于39个属,57个种,其中嗜冷菌株有47株,分布于13个属,占分离总菌数的21.76%。青霉属(Penicillium)、枝孢菌属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)和线黑粉酵母属(Filobasidium)为优势类群,枝孢菌属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)、泡囊线黑粉菌属(Cystofilobasidium)、线黑粉酵母属(Filobasidium)、维希尼克氏酵母属(Vishniacozyma)、红酵母属(Rhodotorula)为主要的嗜冷菌真菌。本研究分离到的曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和枝孢菌属(Cladosporium)在文献中均有报道[1,3,5],而红酵母属(Rhodotorula)、线黑粉酵母属(Filobasidium)、泡囊线黑粉菌属(Cystofilobasidium)和维希尼克氏酵母属(Vishniacozyma)为本研究新发现的分离频次较高的菌株。已有文献中所报道的哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)和许旺酵母属(Schwanniomyces)并未在本研究中分离得到,可能与不同地区的使用习惯、城市气候、存放的食材和室内空气环境质量等相关。

本研究分析了冰箱使用过程中的真菌卫生状况,在不同城市中,广东的冰箱分离到的真菌菌株数最多,共58株真菌(26.85%),其中广东3台冰箱中G3中的真菌菌落总数最高(699 CFU/cm2),以青霉属(Penicillium)为主。哈尔滨地区分离到的真菌菌株数次之,共53株真菌(24.54%),其中哈尔滨3台冰箱中H1冰箱中真菌菌落总数较高(686 CFU/cm2),以迈耶氏酵母属(Meyerozyma)的菌株为主。真菌污染可能与用户使用频次和清洁方式有关,食物残渣未能及时清理,为微生物提供了生长环境,这可能是真菌污染的一个重要原因。不同采样位置中,果蔬篮的真菌污染较为严重,该采样位置分离到的真菌菌株数最多,共68株(31.48%),冷冻室分离到的真菌菌株数最少,共44株(20.37%),说明家用冰箱中存在丰富的微生物,长期低温的环境虽抑制了绝大多数微生物的活性,但微生物仍能存活。因此在食用冰箱储存的食物时应尽量避免直接生食,冰箱的定期清洁与消毒应引起重视。

青霉属(Penicillium)和枝孢菌属(Cladosporium)为本研究分离频次较高的2个菌群。青霉属(Penicillium)在5个城市中均有分布,且在不同采样位置中均有分离到,根据文献报道,该属菌株具有分解纤维素、淀粉、蛋白质的能力,使苹果、梨等水果腐烂,能引起角膜、皮肤、呼吸道、泌尿系统感染[17];枝孢菌属(Cladosporium)在冰箱接触表面分离频次较高,属于暗色丝孢真菌,可导致皮肤和指甲感染,会引起鼻窦炎和肺部感染,孢子分布广泛,在户外的空气中含量丰富,而在室内,当湿度较大时,它们会在器具表面生长[18]。此外,在冰箱低温环境中存在一些嗜冷酵母菌,如泡囊线黑粉菌属(Cystofilobasidium)可在5 ℃生长[19]。维希尼克氏酵母属(Vishniacozyma)产低温酶活性高、稳定性好,最初在加拿大冰川上分布,土壤中也有分布,0 ℃下也可以生长,部分种可造成人和其他动物的皮肤和组织感染[20]。根据我国《人间传染的病原微生物名录》,本研究在冰箱中具有潜在风险的真菌有曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、枝孢菌属(Cladosporium)、镰刀属(Fusarium)、假丝酵母属(Candida)等,青霉菌(Penicillium)、曲霉菌(Aspergillus)都能产生毒素致人以慢性中毒并有致癌作用;镰刀属(Fusarium)的有些种可产生毒素,污染粮食、蔬菜和饲料,人畜误食会发生中毒。因此,冰箱中的嗜冷微生物需特别关注,加强冰箱抗除菌技术的提升是产业未来重要的发展方向。

综上所述,本研究基于可培养技术,初步对中国家用冰箱的真菌污染情况和菌株多样性进行研究,分析了不同地域、不同用户和不同采样位置的真菌情况。结果表明冰箱中分离到的真菌种类在不同地域、不同位点具有一定的相似性,青霉属(Penicillium)和枝孢菌属(Cladosporium)为主要优势菌群,并能在低温下生存。本研究为定向筛选冰箱中具有低温环境适应性的致污微生物奠定了基础,为保障冰箱食品安全提供了数据参考。