超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中灭草松及其代谢产物残留量

段联勃，柯顺川，符海霞，杨丽蓉，曹士先，徐杰

1.武夷星茶业有限公司，福建 武夷山 354300；2.福建省企业技术中心，福建 武夷山 354300

茶树是我国重要的经济作物，在我国栽种地域跨度大，分布广泛。茶园内草类庞杂，有名录的达到241种。这些杂草在茶园疯长，会抢夺茶树的营养物质，同时成为孕育茶园病虫害的温床，最终影响茶叶的产量和品质。因此，茶园杂草防控是茶园管理中一项重要的工作，随着人工成本的不断提高，使用化学除草剂已经成为茶园杂草控制的重要手段。但大量使用化学除草剂会导致水土流失，给茶园带来污染[1-3]。

灭草松（Bentazone，CAS 号：25057-89-0），是由巴斯夫公司研制的一种广谱、高效、低毒的苯并噻二唑类除草剂，兼具触杀性与内吸性，其在植物体内经过还原代谢后会生成对人体具有危害的6-羟基灭草松和8-羟基灭草松两种代谢产物。最新实施的《食品安全国家标准食品中2,4-滴丁酸钠盐等112 种农药最大残留限量》（GB 2763.1—2022）中明确规定，灭草松的残留物（灭草松与两种代谢产物之和）在茶叶中不得超过0.1 mg/kg，但未指明所使用的检测方法。

对灭草松分析检测方法当前已有较多研究，如刘军[4]采用气相色谱法测定饮用水中的灭草松含量，周继恩等[5]和程曼曼[6]用气相色谱质谱法（GC/MS）测定水中灭草松含量，陈杰等[7]用三重四极杆气质联用法（GC-MS/MS）检测水中的灭草松残留，段星春等[8]利用离子色谱法对水源中的2,4-D和灭草松进行了分析检测，还有许多研究者用三重四极杆液质联用法（HPLC-MS/MS） 对饮用水、玉米、小麦、水稻和大豆等基质中的灭草松进行检测[9-22]。然而对茶叶中的灭草松残留物检测的研究却鲜有报道，传统的检测方法是使用气相色谱-质谱法[23]，但其前处理过程复杂，费时且成本较高。本研究前处理阶段采用0.1%冰乙酸-甲醇溶液提取，石墨化碳黑（GCB）和N-丙基乙二胺（PSA）组成的混合填料净化。使用超高效液相色谱串联质谱仪进行分析检测，建立了茶叶基质样品中灭草松及其代谢物残留量的提取分析方法。方法前处理提取净化具有操作简单、速度快的特点，检测具有灵敏度高、精密度好的优点，适合用于不同品类茶叶基质样品中灭草松及其代谢物的分析测量。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

FZ102型微型茶叶粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），AL104型双量程电子天平〔梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司〕，KQ-400DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），H1850型台式高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司），UPT-Ⅱ-20T 型超纯水机（成都超纯科技有限公司），TRIPLE QUAD 4500 型超高效液相色谱串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）。

1.2 主要材料与试剂

甲醇、甲酸、醋酸铵（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯），瑞典欧普森公司；冰乙酸（优级纯），天津市永大化学试剂有限公司；无水硫酸镁（分析纯），天津市光复科技发展有限公司；无水乙酸钠（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司；GCB（粒度38～124µm），博纳艾杰尔公司；PSA（40～60µm），博纳艾杰尔公司；尼龙滤头（有机系0.22 µm），江苏绿盟科学仪器有限公司；灭草松、6-羟基灭草松、8-羟基灭草松标准物质（含量＞99.0%），德国Dr.Ehrenstorfer公司。

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1.3 色谱分析条件

液相色谱柱使用菲罗门的Kinetex@2.6 μm Biphenyl 100 A，型号为LC Column 100 mm×3.0 mm色谱柱；添加10 mmoL 醋酸铵0.1%甲酸水溶液为A 相，100%乙腈为B 相；流动相流速设定：0.5 mL/min；进样体积：5 μL；色谱柱温度控制：40 ℃。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.4 质谱分析条件

采用电喷雾电离离子源（ESI）；选用负离子扫描模式， 扫描方式选择多反应监测（MRM），持续监测时间7 min；气帘气：35 PSI；离子源温度550 ℃，离子化电压-4.5 kV；喷雾气GS1：50 PSI；辅助加热气GS2：50 PSI；定性离子（q）、定量离子（Q）、去簇电位（DP）、碰撞能量（CE）见表2。

表2 质谱条件参数

1.5 标准溶液的配制

标准储存溶液：准确称取适量灭草松及两种代谢物标准物质，分别用甲醇进行溶解并定容配制成500 mg/L的标准储存液。

中间储存溶液：准确移取3种标准储存溶液各2.5 mL 于25 mL 的容量瓶中，分别用甲醇定容至25 mL，配制成50 mg/L的中间储存溶液。

混合标准储存溶液（依据3种药物响应强度不同，灭草松0.5 mg/L、6-羟基灭草松和8-羟基灭草松为0.1 mg/L）：分别移取灭草松中间液0.25 mL、6-羟基灭草松和8-羟基灭草松中间液各0.05 mL 于25 mL的容量瓶中，并用甲醇定容至25 mL。

基质匹配标准工作溶液：取灭草松及代谢物为阴性的茶叶样品，依照下文样品前处理的方法进行处理，获得茶叶基质空白提取液。再依据实际需要，用此基质空白提取液配制基质匹配标准工作溶液，该溶液应临配现用。

1.6 样品前处理方法

本试验前处理过程参照茶叶QuEChERS 方法进行提取净化[24-25]。具体处理过程如下：将各茶类样品用茶叶微型粉碎机磨成粉末，并过70 目筛后作为分析样品冷冻保存备用。称取1 g（精确到0.01 g）分析样品于5 mL的离心管中，再先后加入0.1 g CH3COONa、0.1 g MgSO4、5 mL 0.1%冰乙酸-甲醇溶液，摇匀后超声提取5 min，5 000 r/min离心5 min，移取上清液2 mL至净化管中（向5 mL离心管中加入0.05 g PSA、0.05 g GCB、0.15 g Mg-SO4混合制得），涡旋震荡，5 000 r/min离心5 min，移取上清液0.5 mL 加0.5 mL 0.1%甲酸水溶液，涡旋混匀过0.22 μm有机滤膜，以待超高效液相色谱-串联质谱联用仪测定。

1.7 方法验证

依据《合格评定化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017），通过讨论线性、检出限、定量限、基质效应、回收率和精密度等6个方面对方法进行验证。

2 结果与分析

2.1 线性回归方程和相关系数

GB 2763.1—2022 规定，茶叶中灭草松的限量要求为不得大于0.1 mg/kg，对应方法进样含量为0.01 mg/L。在日常监控中很少有超过这一限值的残留，这一限量作为线性的关注限量在实际中并不合适，因此本方法将关注限量定为2 倍定量限。先选取灭草松及代谢产物为阴性的不同茶类茶叶作为参试样品，按照前述前处理步骤进行处理，获得不同茶类茶叶基质空白提取液，分别配制成灭草松0.001、0.002、0.004、0.006、0.010 mg/L；6-羟基灭草松和8-羟基灭草松0.000 2、0.000 4、0.000 8、0.001 2、0.002 0 mg/L 系列基质匹配线性工作溶液，经超高效液相色谱－串联质谱联用仪测定获得不同茶类茶叶基质对应线性方程。数据显示，六大茶类3 种药物的线性方程的相关系数（R2）均大于0.995，线性相关性良好（表3）。

表3 六大茶类中灭草松及其代谢物的线性方程及相关系数

2.2 灭草松及其代谢物的检出限与定量限

本方法下灭草松、6-羟基灭草松和8-羟基灭草松的保留时间分别为2.89、2.84、2.72 min，其空白茶样基质，灭草松0.005 mg/kg及6-羟基灭草松、8-羟基灭草松0.001 mg/kg，灭草松0.010 mg/kg 及6-羟基灭草松、8-羟基灭草松0.002 mg/kg添加量下的MRM 色谱图见图1。灭草松在0.005 mg/kg 及6-羟基灭草松、8-羟基灭草松在0.001 mg/kg 的添加量下，其离子丰度强度与噪音信号的比值已满足检出限S/N=3 的要求；灭草松在0.010 mg/kg 及6-羟基灭草松、8-羟基灭草松0.002 mg/kg 的添加量下，其离子丰度强度与噪音信号的比值已满足定量限S/N=10的要求；在不同添加量下，3种农药出峰时间稳定，空白茶样基质色谱图在保留时间未出现干扰峰，进一步说明了该方法稳定可靠，灭草松检出限为0.005 mg/kg，定量限为0.010 mg/kg；6-羟基灭草松、8-羟基灭草松检出限为0.001 mg/kg，定量限为0.002 mg/kg。定量限远低于《食品安全国家标准食品中2,4-滴丁酸钠盐等112种农药最大残留限量》（GB 2763.1—2022）中0.1 mg/kg 的限量要求。

图1 不同添加量下灭草松及其代谢物的MRM色谱图

2.3 不同茶类的基质效应

茶叶中含有丰富的有机质和色素成分，这些复杂基质成分对农药残留的检测分析有一定的干扰，影响分析结果的准确性，一般表现为对分析物检测信号起到增强或抑制的作用，这些作用被称为基质效应。斜率对比法是基质效应评估常用的方法，即用不同茶类茶叶的基质空白液配制线性曲线获得的曲线斜率与空白溶剂所配制线性曲线获得的斜率的比值进行评估。比值大于1说明有基质增强作用，值越大增强效果越显著；比值小于1有基质抑制作用，值越小抑制效果越显著。试验结果（表3）表明，六大茶类中除了绿茶对6-羟基灭草松有一定的抑制作用外，其他都是基质增强作用；3种农药中8-羟基灭草松的基质增强效应最明显，其次是灭草松，6-羟基灭草松相对最弱。当基质起抑制作用时，农药响应受到削弱，检测结果会偏小；当基质起增强作用时，农药响应受到增强，检测结果则会偏大。为了抵消基质效应的影响，本研究采用不同茶类基质匹配标准溶液来进行测量。

2.4 回收率与精密度

选用不含灭草松及其代谢物的六大茶类茶叶样品为试验样本，灭草松及其代谢物分别添加3个含量水平（定量限、2 倍定量限和10 倍定量限），每个水平平行添加6个参试样品，按前述步骤进行前处理操作测试，采用基质匹配标准曲线外标法进行定量分析，获得相应的回收率和相对标准偏差（RSD）数据（表4）。数据显示，灭草松、6-羟基灭草松和8-羟基灭草松在相应加标水平下的平均回收率为65.3%～110.5%，RSD（n=6）在1.3%～13.2%之间。回收率和RSD 均符合《合格评定化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）标准要求。

表4 不同茶类不同添加浓度下灭草松及其代谢物的回收率和精密度 %

3 小结与讨论

首次建立了利用超高效液相色谱-串联质谱仪检测茶叶中灭草松及其代谢物残留量的方法。试验结果表明，试验条件下，在0.001 ～0.010 mg/L含量范围内灭草松具有较好的线性关系，其代谢物在0.000 2～0.002 0 mg/L含量范围内同样具有较好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.995；灭草松及其代谢物的定量限分别为0.010 mg/kg 和0.002 0 mg/kg；在对应加标水平下的平均回收率65.3%～110.5%，RSD（n=6）1.3%～13.2%。该方法提取净化步骤简单、快捷、成本低，方法灵敏度和精密度能够满足茶叶中灭草松及其代谢物的检测需求。