天然低共熔溶剂提取黄酮类化合物的研究进展

于德涵，黎 莉，苏 适

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化 152061）

黄酮是植物细胞中一种重要的次级代谢产物，能够消除人体内自由基，有较强抗氧化、抗衰老的功能[1]，在抗菌、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂等方面也颇有功效[2]。近年来，还有黄酮抗肿瘤的相关报道[3]。黄酮的传统提取一般采用有机溶剂提取法，溶剂多选择甲醇、乙醇、乙酸乙酯等。有机溶剂易挥发、不易降解，而且有毒，既污染环境，还会因溶剂残留等问题限制黄酮提取物在医药、食品等领域的应用。

低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DESs）的概念最早于2003 年提出，是由氢键供体（hydrogen-bond donor，HBD）和氢键受体（hydrogen-bond acceptor，HBA）以一定比例组成的均相液态混合物[4]。目前，可采用热混合、真空蒸发、冷冻干燥或研磨等多种方法[5]制备DESs，操作简便，对设备要求低。DESs 有熔点低（低于组成DESs 的单一组分）、热稳定性好、化学稳定性高、挥发量低的特性，又因其组分结构中存在的羟基或羧基能与提取物之间形成氢键，增加目标化合物的提取率、保持其稳定性，故可用于多酚、黄酮、多糖、蛋白质等多种生物活性物质的提取。天然低共熔溶剂（natural deep eutectic solvents，NADESs）又称绿色低共熔溶剂，是由初级代谢产物等天然成分组成的DESs，其被认为是天然存在于生物体中的、独立于水和脂质之外的第三个液相[6]。根据合成NADESs 时使用的化合物，可以将NADESs 分为离子液体型、中性型、中性酸型、中性碱型和含氨基酸NADESs 五大类[7]。目前，氯化胆碱（ChCl）是NADESs 中应用最多的HBA，它可以和多种HBD如尿素、醇、羧酸、糖等化合物组成NADESs。另外，甜菜碱和L-Pro 也常用作HBA。NADESs 的无毒性、可生物降解和可重复使用等和“绿色”有关的优势使其较其它DESs 在活性物质提取领域有着更广泛的应用，有望替代传统有机溶剂解决天然化合物萃取过程中面临的问题。

笔者查阅了近5 年国内、外使用NADESs 萃取黄酮的相关文献，并对其进行综述。文章还详细分析了影响萃取效率的各种因素，以期能为筛选出安全而高效地萃取黄酮类化合物的工艺提供参考。

1 NADESs 在萃取黄酮类化合物的应用

1.1 黄酮和黄酮醇

小分子多元醇基NAESs 常用于提取弱极性黄酮和黄酮醇类化合物。Nguyen 等[8]以芹菜籽为研究对象，筛选出甜菜碱/丙二醇NADES 作为提取芹菜素和木犀草素的最佳溶剂。同样，Hang 等[9]也发现该NADES 在萃取野菊花芹菜素和木犀草素时，萃取效果显著高于其它待选NADESs。Wang 等[10]发现ChCl/1,4 丁二醇在提取槐花中芦丁、槲皮素等6 种黄酮醇化合物时具有显著优势。Mansur 等[11]开发了一套不需要其它辅助技术，也不用任何挥发性溶剂提取荞麦芽中荭草素、异荭草素等黄酮的新工艺，从20 种潜在NADESs 中筛选出最有利的HBA/HBD组合为ChCl/三乙二醇。Yu 等[12]建立了基于醇基NADESs 的高速逆流色谱溶剂系统用于皂荚刺李属素、异牡荆黄素和槲皮素等的提取和分离。小分子多元醇作为HDB 能够给NADESs 体系提供足够的羟基形成氢键，又不会像糖基一样因空间位阻影响目标物质与NADESs 的结合，所以小分子多元醇基NADESs 在弱极性黄酮提取方面的表现通常优于其它类型NADESs。

另外，酸型NADESs 也常用于木犀草素、槲皮素等黄酮和黄酮醇的萃取。Ivanović等[13]首次报道了使用乳酸基NADESs 萃取蓍草中生物活性物质，采用分光光度法和色谱法从提取物中鉴别出两种黄酮成分（木犀草素、芹菜素）。Kaltsa 等[14]验证了以氨基酸作为HBA 的多种NADESs，发现Gly/乳酸最有利于接骨木芦丁的提取。Ciardi 等[15]证实酸型NADES（甜菜碱/羟基乙酸）对洋葱皮中槲皮素的提取率比甲醇提取高2 倍多。Guo 等[16]发现三元NADES 氯化胆碱/乳酸/乙二醇对车前山奈酚和槲皮素的提取效果远高于传统溶剂，并发展出一套集提取、检测、回收为一体的新工艺。Luo 等[17]以不同月份的杜仲叶为提取对象，依据黄酮类有效成分的提取量确定了理想的NADESs 提取试剂，经条件优化后明显提高了芦丁、白果苷等成分的提取率。Li等[18]为提高果渣的附加值，使用NADESs 对果渣中残留的芦丁和槲皮素进行提取，并对提取的芦丁转化率进行了测定。其发现对芦丁和槲皮素提取率最高的两种NADESs 分别是ChCl/乙二醇和ChCl/草酸，提取的芦丁可以快速转化，转化效率可达8.72%/min，转化率近乎100%。另有研究结果表明，ChCl/乳酸作为苹果渣中槲皮素和芦丁的提取溶剂也是可行的，提取率显著高于传统乙醇溶剂[19]。Brahmi-Chendouh等[20]发现柠檬酸基NADESs 能有效提取洋蓟木犀草素和木犀草素糖苷。酸基NADESs 虽然能有效提取黄酮和黄酮醇类化合物，但酸性环境会促使黄酮苷中糖苷键水解，降低黄酮苷的提取量。

1.2 二氢黄酮

橙皮苷和柚皮苷主要存在芸香科植物柑橘和柚子的成熟果皮中，甘草素是甘草的主要活性成分之一，它们都是典型的二氢黄酮类化合物。Liu 等[21]发现，使用甜菜碱/乙二醇对枳壳中芸香柚皮苷、柚皮素、橘皮苷和新橘皮苷的提取较甲醇作为提取溶剂更有效。Toprakçı等[22]建立了一种环保且低成本的回收柠檬皮中柚皮苷和橙皮苷的方法，目标产物的回收效率高，且能保持一定的抗氧化活性，为提高食物残渣附加值提供了一条新思路。为了筛选出提取青柑中活性成分的最适合溶剂，Li 等[23]共制备了30个NADESs 进行实验，发现使用Pro/尿素NADES在提取柚皮素和橙皮苷时提取率最高，并在此基础上建立了产物回收程序，回收后的NADESs 可再次用于提取。Yu 等[24]报道了ChCl/1,3-丁二醇提取甘草中黄酮效果最好，而Shikov 等[25]和Xing 等[26]分别用同品种、不同产地甘草分离甘草素和甘草酸，都得到了ChCl/乳酸NADESs 是提取最佳组合的这一结论。使用NADESs 提取二氢黄酮类化合物，目标物与NADESs 通过氢键结合，保护目标物不被氧化，所以不但其提取率显著高于甲醇、乙醇或水等溶剂，而且提取产物的抗氧化性也明显增强。对于酸性的甘草酸等二氢黄酮，选择pK 值与其接近的乳酸制成酸型NADESs 进行提取，效果更为显著[25-26]。

1.3 异黄酮

异黄酮最早发现于豆科植物中，具有解酒护肝、降血糖、调血脂、缓解绝经性骨质疏松、心脏保护等作用[27]。Shang 等[28]检测了20 种不同极性的NADESs 在提取鹰嘴豆芽中异黄酮的潜力和有效性，以4 种异黄酮的提取量、总黄酮提取量和抗氧化活性综合评价提取效率，并通过响应面法优化了最佳提取工艺。Duru 等[29]建立了一种高效环保的从葛根中提取大豆黄素、染料木素和葛根素等异黄酮的萃取工艺，并证实了NADESs 能有效降低异黄酮的降解。Huang 等[30]从ChCl、甜菜碱和L-Pro 三种常见HBA组成的25 种NADESs 中筛选出最适于提取葛根素的溶剂，该溶剂显示出高于水和甲醇的葛根素提取能力，提取物的生物利用度也高。影响异黄酮萃取的最重要因素是NADESs 的含水量和萃取温度，通过调整溶液的含水量改变NADESs 的粘度和极性能显著影响异黄酮的萃取率；温度在超过70 ℃后，异黄酮会因热分解导致产率下降。

1.4 查尔酮

查尔酮是其它各类黄酮的前体物质，具有抗胃溃疡、抗脱发、抗病毒和抗肿瘤活性[31]。近年对查尔酮的提取研究主要以红花素为主。为了探讨红花素的绿色提取工艺，提高红花活性物质的生物利用度，Tong 等[32]构建了超声辅助NADESs 提取红花中活性成分的新工艺，最优条件下的羟基红花黄素A 和脱水红花黄素B 提取量均高于水提取法和甲醇提取法，而且其生物利用度也明显优于水提物。另有证据证明，超声辅助NADESs 还能有效提取栀子果实中的红花素，提取的红花素具抗糖功效和DNA 保护作用[33]。红花素具有高亲水性，NADESs 的含水量变化对其萃取率没有明显影响，影响萃取效果的显著因素是料液比和萃取温度，结合超声辅助提取，能明显提高提取效率。

1.5 黄烷醇

儿茶素和表儿茶素互为同分异构体，是从茶叶等植物中提取出的一种活性黄烷醇类成分，具有多种药理作用。阮怿航等[34]构建了使用NADESs 从铁观音茶中高效提取儿茶素的新工艺，筛选出的最佳NADES 是甜菜碱/乳酸组合，并发现实验中几种NADESs 对儿茶素的提取率都高于超纯水提取法。Wang 等[35]以罗布麻叶茶为原料采用NADESs 提取活性成分，从17 种待选NADESs 中筛选出最佳溶剂为ChCl/乙酰丙酸，提取的活性成分经HPLC 鉴定以儿茶素等黄酮类物质为主。另有研究证实，使用ChCl/苹果酸NADES 提取的山核桃皮活性物质中，儿茶素是主要成分[36]。儿茶素的多羟基结构导致其在中性或碱性环境中结构不稳定，所以实验用NADESs 中，酸性基NADESs 对儿茶素和表儿茶素等黄烷类化合物的提取率显著高于其它NADESs。当NADESs 的pH 略低于儿茶素的pKa，儿茶素在溶液中处于中性状态时更容易被提取。

1.6 花色素类

花色素类黄酮中以花青素及花青素糖苷的研究最为广泛，可用于染料、医药、化妆品等多领域[37]。甲醇、乙醇是提取花青素最常用的试剂，但醇提取物存在热稳定性差、半衰期短等不足，NADESs 替代醇溶剂提取花青素以克服上述缺点成近年研究热点。Bi 等[38]试验了使用6 种NADESs 对桑葚花青素的提取效果，发现其提取量均高于酸化乙醇，其中尤以ChCl/乳酸提取效果最好。Maclean 等[39]首次开发出用NADES 提取蓝靛果花青素的绿色萃取工艺，证实了使用D-（+）-麦芽糖/柠檬酸提取蓝靛果花青素是可行的。Lin 等[40]报道了一种超声-微波辅助NADESs 结合HPLC-MS 绿色提取及快速鉴定黑果腺肋花楸花青素的方法，证实了ChCl/甘油可用作萃取黑果腺肋花楸花青素的媒介。同样，ChCl/甘油组合也被Zannou 等[41]用于提取蓝蓟花中花色素。Benvenutti 等[42]研发了一种NADESs 结合加压液体快速萃取巴西浆果加工副产品中花青素的工艺，该工艺可以在12 min 内快速完成萃取工作，大大增加了该类原料的附加值。越桔是最重要的花青素来源之一，Jovanović等[43]开发出基于NADESs 的越桔花青素提取工艺。结果表明，以ChCl/山梨醇NADES 提取的越桔花青素抗氧化性和抗菌性最好，稳定性也更高。另外，该研究者还利用环糊精改善NADESs 提取性能，有效提高了野樱桃花青素的得率[44]。花青素的提取率和溶液的酸度有关，酸型NADESs 能保护非酰基化的花青素不被降解，提高萃取效率；非酸基NADESs 能保护花色苷糖苷键不被分解，提高提取产物中花色苷的比例。使用NADESs 萃取花青素，萃取率普遍高于传统溶剂，又因为花青素和NADESs之间的氢键对花青素的保护作用，使其稳定性更好，抗菌、抗氧化能力也更高。

1.7 双黄酮

原花青素是一种双黄酮类化合物，其抗氧化性和清除自由基能力较花青素更强。张欣[45]设计了一套完整的超声辅助NADESs 提取和纯化黑果腺肋花楸原花青素的方法，并对提取物的抗氧化性和抗菌能力进行了检测，检测结果理想。为探索油茶籽壳高值化利用途径，侯黔灵等[46]采用多种环保NADESs 提取原花青素，结果显示实验中有3 种NADESs 的原花青素提取率都优于60%乙醇提取液，其中ChCl/柠檬酸表现最佳，经条件优化后油茶籽壳中原花青素提取率可达5.26%。另一份关于油茶果壳原花青素提取的研究中显示，ChCl/草酸的提取效果更加让人满意，在微波辅助的条件下，原花青素提取量相当于70%乙醇提取量的3.22 倍[47]。周佳悦等[48]则报道了ChCl/丙三醇NADES（实验未筛选酸型NADESs）可用于提取红松皮原花青素，为红松皮的综合利用提供了一个新思路。原花青素的提取量依赖于NADESs的酸度，故多元醇基NADESs 的提取量常低于羧酸基NADESs。在常见酸型NADESs 提取实验中发现，原花青素的提取量随着提取介质的酸度增加而增加。

1.8 总黄酮

NADESs 在生物总黄酮的提取方面也有很多应用。NADESs 被证实可用于红花总黄酮的提取，溶剂选择ChCl/乙二醇[49]。此外，该溶剂还同样适用于萃取金钱草[50]、红豆杉叶[51]、铁皮石斛花[52]、红枣[53]、玉米芯[54]和番石榴叶[55]总黄酮。而在另一项针对铁皮石斛总黄酮提取的研究中发现，ChCl/乳酸才是最优试剂[56]。同时，ChCl/乳酸也是绿茶总黄酮的最佳提取溶剂[57]。孙平等[58]证实，使用ChCl/1,4-丁二醇NADES 结合超声法提取野菊花总黄酮是可行的。另一份野菊花总黄酮提取的文章中报告最佳提取溶剂是ChCl/尿素，总黄酮提取率是72.32%，较孙平报道的总黄酮提取率提高了18%[59]。有最新研究报告指出，ChCl/尿素NADES 结合微波辅助技术，对大枣总黄酮的提取率最高，并能有效延长产物在暗处的保存时间[60]。Zhang 等[61]以番薯叶为研究对象，考察了几种NADESs 对总黄酮提取率的影响，提供了一种绿色高效的提取强抗氧化性和抗菌性黄酮的新思路。不同材料中黄酮类成分差异较大，故各最佳NADESs 中HBD 各不相同，但多以萃取容量较大的乙二醇为主；又因黄酮结构中多含酚羟基，常显酸性，所以以乳酸、苹果酸等有机酸作HBD 的NADESs 也常用于总黄酮的萃取。

总体而言，NADESs 在天然黄酮类物质萃取方面表现优异，产物得率普遍高于传统提取法[8,16]，尤其是在高效、环保、重复利用、保持和提高产物活性、提高产物可及性，以及有助于后续快速分析和检测等方面显示出极大的优越性。上文中未能详尽举例与总结的内容请见表1。

2 影响NADESs 提取黄酮类化合物的因素

一般来说，DESs 对植物中生物活性化合物的提取能力取决于其组成（HBA 和HBD 的类型、摩尔比）、DESs 的物理化学性质（极性、pH、粘度和表面张力）和DESs 与目的物间的相互作用[18,28]等因素，DESs 的含水量和温度又会直接影响其极性、pH、粘度和表面张力等性质。

2.1 NADESs 的组成和摩尔比

DESs 的组成决定了共晶体系能否形成以及是否能稳定存在。HBD 能提供的基团数目是影响DESs 形成的关键因素，如甘氨酸和乳酸组成的NADES，HBD/HBA≤3（摩尔比）时，常温条件下不能形成液体，只有HBD/HBA≥5 时，才能形成稳定的DES[15]。但是HBD/HBA 过大又会导致DES 体系中HBA 相对浓度不足，影响氢键网络的形成。

DESs 是高粘溶剂，溶剂体系中氢键结构越强，粘度也就越大。DESs 的高粘度会影响其与目标化合物的接触，阻碍目标化合物在溶液中的传质，降低目标化合物的提取率，也会对产物回收造成麻烦，所以调整DESs 的粘度处于适当水平是提高萃取率的有效手段。另外，HBD 分子的大小和基团的位置关系也会影响DESs 的萃取效率。HBD 分子过大或者羧基/羟基的位置不合理，都会导致DESs 体系内部产生更大的空间位阻，影响目的物与DESs 组分的相互作用，降低提取率[62]。一些黄酮化合物的萃取率还会受到NADESs 的pH 的影响，如花青素需要在低pH 条件下才能稳定存在，所以萃取花青素时，HBD常选择有机酸或酸化多醇，而尿素基NADESs 中花青素提取量几乎为零[38]。

2.2 NADESs 的含水量

DESs 的高粘度不仅来自体系内的范德华力、氢键和静电相互作用，还受含水量的影响。水会与DESs 中组分形成氢键，导致组分间的作用力减弱，含水量的增加能降低DESs 的粘度，有利于目的物的提取。加水还会增强DESs 的表面张力，利于NADESs与植物基质之间的相互吸引作用，使NADESs 与目的物之间形成氢键，提高目标物的溶解度[34]。但过量的水会破坏DESs 组分间的氢键，导致目标化合物提取效率低下。水还能调节DESs 的极性，根据“相似相溶”的原理，目的物在极性相近的NADESs 中溶出度更高。

2.3 NADESs 的温度

温度与DESs 的粘度负相关。高温会诱导DESs体系内部分子结构重组，削弱离子间的相互作用，降低DESs 粘度[63]；另外，温度提高时，DESs 分子的运动性增强，促进了DESs 对介质细胞的渗透，增强DESs 与目标化合物之间的相互作用[64]。这两方面的作用都能促进目标化合物在DESs 中的溶解，但要注意温度的提升对温度敏感化合物的热稳定性的影响。

2.4 其它因素

萃取时间也会对萃取率产生一定影响。萃取时间不足时，目的成分不能充分溶出，延长提取时间，萃取率会提高；目的物基本溶出后，再继续增加萃取时间，不会对萃取率产生显著影响，还会因为萃取时间过长导致DESs 内部能量积累，促使目的产物分解[55]。

固液比对萃取率的影响和DESs 的萃取能力有关。萃取溶剂用量少，目标化合物溶出不完全，影响收率；适当增加溶剂用量则有助于目标产物快速、充分地溶出；过多的溶剂量不但会导致大量非目标化合物的溶出，影响后续分析和纯化，还会因为过分吸收DESs 能量（热能、空化能）降低提取率[48]。

超声、微波、高压净水等辅助提取手段也会影响黄酮化合物的提取率。通过空化效应、微波能量辐照、震动、高压等方式，促进介质细胞的破碎、加强DESs 的渗入能力和目标化合物的运动能力、降低DESs 的粘度，能有效减少萃取时间，提高萃取效率。辅助提取技术的条件如功率[10]、温度[16]、压力[42]等都会对最终的提取结果有影响。

3 结论与展望

自NADESs 概念被提出以来，其绿色特性受到各个领域的关注，成为绿色化学的研究热点，尤其是在黄酮类活性物质提取领域，因其成本低廉、环境安全、操作简便、灵敏度高和选择性好等特性被广泛应用，拥有极大地取代传统提取溶剂的潜力。

就当前而言，在看到NADESs 优势的同时，也要充分认识其在天然产物提取领域存在的问题：a.NADESs 的种类不够丰富，HBA 和HBD 的选择主要集有限的几种化合物范围内；b.NADESs 的粘度高，限制了此溶剂的渗透和传质，对活性物质的提取会产生不利影响；c.对NADESs 的安全性研究不足，如NADESs 对提取的天然产物活性的影响、其与提取物的协同效应、提取产物在人体内的安全性和对人体代谢的影响以及NADESs 在自然环境中的完全降解性等方面仍有待深入；d.对NADESs 的溶剂化特性研究较少，对该溶剂规律性的变化认识不足。

未来，针对NADESs 在活性物质萃取领域存在的问题，研究可以主要着眼以下几个方面：a.扩大HBA 和HBD 的筛选范围，开发合成对活性物质提取能力更强的NADESs，增加NADESs 在物质提取方面的应用范围，尤其是在针对非热门活性物质的提取方面，更有待深度发掘；b.在超声、微波等传统辅助技术的基础上，采用新型萃取辅助技术协同NADESs，进一步提高NADESs 对目标产物的提取效率，新型辅助技术应重点关注高压、匀浆等更有放大潜力的技术；c.深入分析NADESs 的萃取性能，从分子结构、理化性质、作用机制等不同层面揭示NADESs 在应用领域的变化规律；d.完善对NADESs和萃取产物的安全性评价方法，阐明NADESs 残留对环境和人体安全性的影响，尤其是对产物的生物活性、生物毒性和人体内代谢方面的影响。

随着对NADESs 研究的不断深入，这种可持续的绿色溶剂在生物活性物质提取领域的应用必然愈来愈广。当然，要使其成为“最佳新兴溶剂”仍需要不断探索，但前景必定光明。