不同品种柑橘果皮精油关键香气物质筛选

李 丽，蒋景龙，胡佳乐，师一璇，黄 佩，丁德宽

（1.陕西省催化基础与应用重点实验室，陕西理工大学化学与环境科学学院，陕西汉中 723001；2.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723001；3.城固县果业技术指导站，陕西汉中 723200）

柑橘是世界上第一大水果，我国的种植面积和产量均居世界第一[1]。据国家统计局数据，我国柑橘2021 年产量5595.61 万t[2]，按照柑橘果皮占柑橘全果重30%～50%计算，年产柑橘果皮超过1600 万t。然而受深加工技术限制，柑橘加工中大部分皮渣则被当成废料丢弃[3]，其实柑橘果皮是柑橘精油含量最高的部分，柑橘果皮精油是柑橘加工中的重要副产物，为果皮鲜重的0.5%～2.0%，据估算，全球年产柑橘精油高达4 万t，是目前产量最大的天然香精油[4-5]。

柑橘精油具有令人愉悦的独特芳香风味，其组成成分具有抗菌、防腐、消炎及抗癌等多种功效，近年来柑橘香气物质的研究已成为研究的热点，涉及香气物质的提取及检测、香气物质的组成及不同品种柑橘香气物质的比较等[6-8]，对柑橘精油的开发利用已经受到广泛重视，柑橘精油销售量占精油总销售量的40%～50%[4]，被广泛运用于食品、化妆品和医疗行业中[9-11]。柑橘精油产业发展需要优良香味品质的柑橘品种，香气性状由挥发性物质种类或含量决定，由于研究材料的不统一、香气物质提取、检测及分析方法的差异，难以系统比较不同种类柑橘果实香气的特征性组分，哪些物质对不同类型柑橘香气差异有贡献，还需要进一步的研究。

本研究以陕南柑橘综合试验站种质资源圃相同生境下6 个品种柑橘果皮为研究材料，衢州香橙（Citrus junosQuzhou）原产长江上游，是我国柑橘栽培的重要砧木类型，其果皮香气浓郁，是以加工为主的品种，因其独特的香味广泛应用于食品和烹饪中[12-14]。资阳香橙（Citrus junosZiyang）因其在四川资阳市分布较多而命名，是我国近年主推的柑橘砧木品种,果皮香气浓郁，其果皮精油方面的研究报道较少[15-16]。青皮（Citri ReticulataePericarpium）为常用中药，具有疏肝破气、消积化滞等多种功效，其香气浓厚、味苦[17]。青皮的成分含量测定文献报道较多[18]，但汉中地区青皮的成分检测报道甚少。南丰蜜橘（Citrus reticulataBlanco）是我国柑橘的优良品种，江西省南丰县特有品种，果皮香气浓，近年来南丰蜜桔副产物的开发也受到广泛重视[19]。金秋砂糖橘（Jinqiu Shatangju）是中国农业科学院柑橘研究所由砂糖橘和爱媛30 号杂交育成的品种（中柑所5 号），是本世纪中国第一个拥有自主知识产权的优质杂柑新品种，果皮香气浓[20]。红美人（Citrus‘Hongmeiren’）是日本用‘南香’和‘天草’育成的橘橙类杂交品种，果香浓郁，该品种商业化生产的效益非常可观，我国部分地区已经有了大面积的设施种植[21]。本研究采用顶空固相微萃取技术对相同生境下具有独特香味的6 种柑橘果皮精油中挥发性成分进行了萃取富集，然后采用气相色谱-质谱联用技术对其化学组成进行分析，评价不同柑橘种质中挥发性物质，筛选富含挥发性成分的特殊种质及其关键香气成分，为进一步开发和利用柑橘精油提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

衢州香橙、资阳香橙、青皮、南丰蜜橘、金秋砂糖橘、红美人果实 6 种柑橘果实均于2021 年11 月2 日采自陕西省汉中市城固县陕南柑橘综合试验站，按代表性采样原则，每种柑橘均选择树龄一致、长势相近的健康植株3 株，于树冠中部外围随机选取大小一致、无病害的果实。

手动固相微萃取装置和固相微萃取头（含有50/30 μm CAR/DVB/PDMS） 美国Supelco 公司；7890B-5977B 顶空气相色谱-质谱联用仪及20 mL顶空萃取瓶、色谱柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 µm） 美国Agilent 公司；EYELA旋转蒸发仪N-1300D 东京理化；SL-J010 粉碎机 广东苏兰电器有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器郑州长城科工贸有限公司；ME104E 电子分析天平梅特勒-托利多。

1.2 实验方法

1.2.1 6 种柑橘果皮精油提取 将柑橘果实洗净晾干后，剥下果皮，将果皮的中果皮（白层）去掉后粉碎至4～5 mm，加入2%氯化钠，混匀，置于5000 mL 圆底瓶中，水蒸气蒸馏提取48 h，直至挥发油含量不再增加，正己烷萃取，旋转蒸发浓缩备用。柑橘果皮精油含量（%）=（精油体积×精油比重/柑橘果皮质量）×100，精油比重为0.85[22]。

1.2.2 柑橘果皮精油挥发性成分的萃取富集方法取20 μL 样品加1 mL 乙醇进行稀释，置于20 mL 顶空瓶中。用带有隔垫的瓶盖密封，置于集热式恒温加热磁力搅拌器中，在40 ℃条件下孵育15 min 后，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头顶空吸附40 min 后，将萃取头插入GC 进样口，解析5 min[20]。

1.2.3 GC-MS 分析 GC 条件：进样温度：250 ℃；分流比：5:1；载气：氦气（99.999 %）；流量：1 mL/min；柱温：35 ℃保持5 min，以3 ℃/min 升至180 ℃，以5 ℃/min 升至240 ℃保持1 min。

MS 条件：接口温度：280 ℃；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；电离方式：EI+，70 eV；扫描方式：全扫描；质量范围：m/z 35～350[23]。

1.2.4 定性定量方法 定性分析：检测出的挥发性物质通过计算机检索与NIST 05 标准谱库对照，仅报道正反匹配度大于80%的物质。通过正构烷烃计算各挥发性物质的保留指数（Retention index，RI）[24]。

定量分析：每种挥发性物质的浓度可通过与TMP 峰面积的比率来确定，校准系数均假定为1.00，柑橘果皮中每种挥发性物质的估计浓度计算参考，每个样品重复 3 次。

1.2.5 相对气味活度值（Relative Odor Activity Value，ROAV）结合GC-MS 分析6 种柑橘果皮精油关键香气物质 通过计算ROAV，确定挥发性物质对样品风味的贡献。一般认为ROAV＞1 的挥发性物质是样品中的关键风味物质，0.1＜ROAV≤1 的挥发性物质是对样品的总体风味起修饰作用[25]。选取化合物中对样品风味贡献最大的ROAV 为100，其余各组分的ROAV 按下式计算：

式中：CA为化合物A 的相对百分含量；TA为化合物A 的香气阈值，可以通过查阅文献获得（mg/kg）；Tstan及Cstan分别为对样品风味贡献最大的组分的香气阈值和相对百分含量。

1.3 数据处理

所有样品均3 次重复，实验结果均以平均值±标准偏差（mean±S.D.）表示。采用Excel 计算柑橘果皮精油含量，进行原始数据处理；采用Origin 2019 对6 种柑橘果皮精油中的挥发性成分进行聚类热图分析，Graphpad prism 8 绘制物质含量堆积图。

2 结果与分析

2.1 6 种柑橘果皮精油挥发性物质分析

通过GC-MS 检测，在衢州香橙、资阳香橙、青皮、南丰蜜橘、金秋砂糖橘和红美人的果皮精油中分别分离出28、36、26、17、17 和13 个主要色谱峰，6 种柑橘果皮精油成分的总离子流图能够明显区分（图1）。

6 种柑橘果皮精油共检测到75 种挥发性物质，包括13 种单萜烯、19 种倍半萜烯、4 种烷烃、16 种醇类，10 种醛类、7 种酯类、4 种酮类、1 种酚类和1 种醚类（表1）。不同品种柑橘果皮精油成分和含量存在明显差异，衢州香橙、资阳香橙、青皮、南丰蜜橘、金秋沙糖橘和红美人果皮精油分别检测到135、151、142、105、113 和95 种化合物，其中鉴定出的化合物分别为51、55、57、46、49 和45 种，鉴定出的成分占检测出成分的37.78%、36.42%、40.14%、43.81%、43.36%和47.37%。6 种柑橘果皮精油均以单萜烯含量最高，衢州香橙、资阳香橙、青皮、南丰蜜橘、金秋砂糖橘和红美人单萜烯含量分别占所有化合物总含量的80.41%、73.82%、84.27%、79.32%、84.13%和91.19%，其次是醇类（4.32%～12.63%）、倍半萜烯（1.51%～10.20%）、烷烃（0.07%～4.18%）、醛类（0.04%～2.71%）、酯类（0.01%～0.86%）、酮类（0.03%～0.43%）、酚类（0.00～1.61%）和醚类（0.00～1.17%）（图2）。这与先前研究对不同产地香橙[12]、南丰蜜橘[22]、青皮[18]、红美人[21]的其组成成分一致，同时跟柑橘其他品种[8,22-23]果皮精油的主要成分一致，只是这些各具独特气息的精油成分以不同的比例搭配在一起，就形成了每种精油独特的具有辨识度的芳香气味。

表1 6 种柑橘果皮精油成分及相对含量Table 1 Compounds and relative content in essential oils from six different citrus peels

图2 6 种柑橘果皮精油挥发性物质占比Fig.2 Proportions of volatile substances in essential oils from six different citrus peels

Lota 等[26]通过柑橘果皮精油化学成分分析，将16 种宽皮柑橘分为3 个重要化学类型：柠檬烯型、柠檬烯/γ-萜品烯型和乙酸芳樟酯/柠檬烯型。Fanciullino 等[27]对15 种宽皮柑橘果皮精油化学成分进行分析，将其分为柠檬烯化学型和柠檬烯/γ-萜品烯化学型2 类，并且前者数量多于后者。6 种柑橘果皮精油中相对含量排前三的挥发性成分别为：衢州香橙、南丰蜜橘和金秋砂糖是D-柠檬烯（58.29%、62.59%、70.82%）、γ-萜品烯（12.57%、8.68%、5.53%）和芳樟醇（6.00%、6.94%、3.52%）；资阳香橙是D-柠檬烯（51.61%）、γ-萜品烯（12.01%）和α-萜品醇（4.99%）；青皮是D-柠檬烯（60.53%）、3-蒈烯（13.13%）和β-月桂烯（3.66%），红美人是D-柠檬烯（84.48%）、β-月桂烯（4.07%）和芳樟醇（1.71%）。6 种柑橘果皮精油南丰蜜橘、金秋砂糖橘和红美人以D-柠檬烯为主要成分，其他挥发性成分含量均小于10%，为柠檬烯化学型；衢州香橙和资阳香橙以D-柠檬烯和γ-萜品烯为主要成分，为柠檬烯型/萜品烯化学型；青皮以D-柠檬烯和3-蒈烯为主要成分，为柠檬烯型/蒈烯化学型。

柑橘中最主要的挥发性物质为萜烯类物质，萜烯类物质的共同前体为异戊烯焦磷酸（Isopentenyl diphosphate， IPP），进而被分别催化形成单萜、倍半萜等的直接前体物质牻牛儿焦磷酸、法尼基焦磷酸等萜烯类物质，IPP 主要是通过甲基赤磷酸糖醇（2-C-methyl-d-erythritol 4-phosphate pathway，MEP）和甲羟戊酸（Mevalonate pathway，MVA）途径合成，直接合成基因是萜烯合酶基因（Terpene synthase，TPS）[28]。大多数TPS 基因在柑橘果实的发育前期都有较高水平的表达，但随着果实发育进入成熟阶段以后，这些TPS 基因的表达水平逐渐降低甚至不表达，而柠檬烯合成酶基因一直保持很高水平的表达，这解释了柑橘果皮精油中柠檬烯含量很高的原因[29]。

MEP 途径中最主要的限速酶是脱氧木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphatesynthase，DXS），猕猴桃中研究表明DXS 基因中的DXS1 基因与TPS 共表达可显著提高单萜物质积累[30]。葡萄中DXS 基因在芳樟醇、香叶醇、香茅醇和α-萜品醇等物质积累中起重要作用[31]。此外，猕猴桃中研究表明NAC 和EIL 转录因子可结合Aa TPS1基因的启动子调控β-月桂烯、α-蒎烯和d-柠檬烯等单萜物合成[28]。黄花蒿G-box 转录因子HY5 可结合QH6基因调控β-蒎烯生物合成[32]。薄荷Ms MYB 可负调控Ms GPPS.LSU基因影响单萜物质积累[33]。甜橙中Cit ERF71 可激活CitTPS16调节E-香叶醇（E-Geraniol）积累[34]。后期将从代谢和分子水平对柑橘种质香味形成相关基因进行挖掘和验证。

2.2 6 种柑橘果皮精油挥发性物质热图分析

从聚类热图（图3）可以看出，6 种柑橘果皮精油挥发性物质南丰蜜橘和金秋砂糖橘聚为1 类后依次与红美人、衢州香橙、资阳香橙聚为1 类、最后与青皮聚为1 类。说明南丰蜜橘和金秋砂糖橘果皮精油挥发性物质差异较小，这二者与青皮果皮精油挥发性物质差异较大。75 种挥发性物质根据变化趋势的类型可以分为5 类，化合物（Ⅰ）中辛烷、壬烷、癸烷和β-蒎烯在金秋砂糖橘、南丰蜜橘和青皮果皮精油中含量高，其余3 个品种果皮精油中含量较低或未检测到；辛醇和乙酸辛酯在金秋砂糖橘和红美人中含量较高，其余4 个品种果皮精油中未检测到；D-胡椒酮、牻牛儿烯、α-法尼烯和熏衣草醇在南丰蜜橘和金秋砂糖橘果皮精油中含量高，其余4 个品种果皮精油中含量较低或未检测到；壬醛和癸醛在南丰蜜橘和金秋砂糖橘和资阳香橙果皮精油中含量高，其余3 个品种果皮精油中含量较低或未检测到；化合物（Ⅱ）在红美人果皮精油中含量最高，其余5 个品种果皮精油中含量较低或未检测到；化合物（Ⅲ）在资阳香橙果皮精油中含量最高，其余5 个品种果皮精油中含量较低或未检测到；化合物（Ⅳ）中乙酸芳樟酯、γ-萜品烯和丁香烯在衢州香橙和资阳香橙含量高，其余4 个品种果皮精油中含量较低或未检测到；α-萜品油烯仅在衢州香橙中检测到，含量较高；化合物（Ⅴ）在青皮果皮精油中含量最高，其余5 个品种果皮精油中含量较低或未检测到。

图3 6 种柑橘果皮精油挥发性物质聚类热图Fig.3 Clustering heat map of volatile substances in essential oils from six different citrus peels

我国柑橘资源丰富，分布范围广，彼此之间均能自然杂交等，使得柑橘分类学研究困难，植物精油成分可用于研究柑橘分类学，柑橘的起源等[18]，本研究可通过柑橘果皮精油挥发性成分将宽皮柑橘和甜橙分类。

2.3 6 种柑橘果皮精油挥发性物质比较分析

6 种柑橘果皮精油共有的化合物有23 种，为D-柠檬烯、γ-萜品烯、芳樟醇、α-萜品醇、β-月桂烯、环葑烯、4-萜烯醇、α-水芹烯、β-蒎烯、3-蒈烯、γ-榄香烯、δ-杜松烯、癸醛、β-萜品醇、δ-榄香烯、丁香烯、甘香烯、β-可巴烯、紫苏醛、薄荷二烯醇、α-荜澄茄烯、香叶醇和香芹酮，其中单萜烯7 种、倍半萜烯7 种、醇类6 种，醛类2 种和酮类1 种。这23 种化合物在衢州香橙、资阳香橙、青皮、南丰蜜橘、金秋砂糖橘和红美人中的含量分别占所有化合物总含量的89.24%、80.33%、86.78%、88.84%、90.09%和94.59%，也是其主要的组成成分。

6 种柑橘果皮精油挥发性成分均为D-柠檬烯含量最高，其中红美人含量最高，达到83.49%。红美人独有的化合物为乙酸香叶酯和反式-香苇醇，甜橙醛的含量高于其他品种；衢州香橙和资阳香橙果皮精油中γ-萜品烯、α-萜品醇、α-水芹烯、丁香烯、甘香烯和香叶醇含量高于其他品种，衢州香橙独有的化合物为α-萜品油烯；资阳香橙独有的化合物为2-己烯醛，γ-榄香烯、δ-杜松烯、β-可巴烯含量高于其他品种；南丰蜜橘、金秋砂糖橘和青皮果皮精油β-蒎烯含量较高；衢州香橙和南丰蜜橘果皮精油芳樟醇较高；青皮独有的化合物为己醛，紫苏醛含量高于其他品种，3-蒈烯含量高于其他品种。

2.4 ROAV 法结合GC-MS 分析6 种柑橘果皮精油关键香气物质

目前多数植物油香气的研究都采用GC-MS，该方法仅能从化学成分及含量上对其挥发性组分进行阐述，但不是所有挥发性成分对柑橘果皮精油特征香气有贡献，有的成分虽然相对含量高，但是因为其气味阈值高，香气活度值相应低，不能对整体特征香气有显著影响，而有的成分虽然相对含量低，但是因为其气味阈值极低，所以其所具有的香气活度值高，对整体特征香气的贡献也大，ROAV 法可以结合GCMS 分析结果快速筛选出关键香气化合物。本实验根据文献[35-37]得到的香气阈值计算出柑橘果皮精油挥发性物质ROAV 值，芳樟醇是柑橘果皮精油中风味贡献最大的物质。一般认为ROAV＞1 的挥发性物质是样品中的关键风味物质[38]。6 种柑橘果皮精油共筛选到关键香气物质27 种（表2），其中衢州香橙果皮精油的关键香气物质共8 种：芳樟醇、α-萜品醇、β-蒎烯、香叶醇、D-柠檬烯、α-萜品油烯、γ-萜品烯和β-月桂烯；资阳香橙果皮精油的关键香气物质共14 种：芳樟醇、α-萜品醇、香叶醇、D-柠檬烯、辛醛、β-蒎烯、γ-萜品烯、紫苏醛、β-萜品醇、α-水芹烯、β-月桂烯、癸醛、乙酸芳樟酯和3-蒈烯；青皮果皮精油的关键香气成分共11 种：芳樟醇、甲酸异龙脑酯、紫苏醛、3-蒈烯、β-蒎烯、D-柠檬烯、反式-氧化芳樟醇（呋喃）、香叶醇、β-月桂烯、辛烷和香芹酮；南丰蜜橘果皮精油的关键香气物质共8 种：芳樟醇、β-蒎烯、α-萜品醇、D-柠檬烯、紫苏醛、γ-萜品烯、辛醛和香叶醇；金秋砂糖橘果皮精油的关键香气物质共13 种：芳樟醇、β-蒎烯、D-柠檬烯、α-萜品醇、乙酸辛酯、紫苏醛、辛醛、γ-萜品烯、辛烷、β-月桂烯、香茅醛、癸醛和香茅醇；红美人果皮精油的关键香气物质共18 种：芳樟醇、D-柠檬烯、紫苏醛、甜橙醛、α-萜品醇、香芹酮、香茅醛、β-月桂烯、香茅醇、辛醛、乙酸辛酯、乙酸香叶酯、乙酸香草酯、β-水芹烯、癸醛、柠檬醛、β-萜品醇和香叶醇。

表2 6 种柑橘果皮精油中关键香气成分Table 2 Key aroma components in essential oils from six different citrus peels

6 种柑橘果皮挥发性成分红美人果皮关键香气物质种类最多，多为醛类、醇类物质；其次是资阳香橙，主要为单萜类物质；青皮果皮关键香气物质种类多，其中单萜4 种、醇类2 种、醛类1 种、酯类1 种、烷烃1 种、醚类1 种、酮类1 种；金秋砂糖橘多为单萜类、醛类、醇类；南丰蜜橘果皮关键香气物质为醇类、单萜类、醛类，衢州香橙果皮关键香气物质种类最少，为单萜类和醇类。果实香气的形成可根据香气合成过程中底物种类的不同，分为萜类代谢途径、脂肪酸代谢途径和氨基酸代谢途径。果实萜烯类物质主要由萜类代谢途径合成，大部分的醇、醛、酮、酯类物质均以脂肪酸为前体通过脂肪酸代谢途径形成，支链脂肪族醇、醛、酮和酯类等香气物质主要是通过氨基酸代谢途径形成，不同的底物和酶活性会生成不同的香气物质，从而决定了果实的香气[39]。

3 结论

柑橘精油挥发性成分与遗传型、起源、气候、季节以及成熟度等条件有关，不同柑橘类型、不同栽培种类差异较大[40]。柑橘精油的化学成分和含量能够揭示不同柑橘品种和栽培种的遗传差异[41]。本研究结果中，相同生境下、相同株龄的衢州香橙、资阳香橙、青皮、南丰蜜橘、金秋砂糖橘和红美人果皮精油含量具有明显差异。

6 种柑橘果皮精油共检测出75 种挥发性成分，其中共有成分23 种，这23 种共有成分占6 种柑橘果皮精油所有化合物总含量的80.33%～94.59%，天然的风味和芳香源于多种化合物的复杂混合物[42]。通过ROAV 法确定精油中的关键香气成分，6 种柑橘果皮精油共筛选到27 种关键香气成分，其中单萜烯8 种、醛类6 种、醇类5 种、酯类5 种、酮类1 种、醚类1 种和烷烃1 种。芳樟醇是6 种柑橘果皮精油中风味贡献最大的物质。单萜烯β-蒎烯、D-柠檬烯、α-萜品油烯、γ-萜品烯、β-月桂烯、α-水芹烯、β-水芹烯、3-蒈烯和辛烷阈值较高，但在6 种柑橘果皮精油中含量较高，所以这9 种烃类物质对果皮风味贡献较大，是关键风味成分。醛类、醇类和酯类物质普遍具有强烈的气味特征，因其香气阈值一般较低，对6 种柑橘果皮风味也做出了较大的贡献。这些关键风味成分和重要修饰成分共同构成了柑橘果皮的特征香气。

柑橘果皮精油化学成分组成和含量的差异反映了不同品种间的遗传差异，本研究6 个品种柑橘果皮精油挥发性物质组成显示南丰蜜桔和金秋砂糖桔相近、衢州香橙和资阳香橙相近，这可能与品种间的遗传差异有关。本研究分析比较了汉中生境的6 个柑橘种质果皮精油挥发性物质组成并筛选了其关键香气成分，柑橘果皮挥发性成分组成及含量与柑橘品种、产地、树龄、栽培方式、管理技术、生长阶段等多种因素有关，后续将扩大香气物质的研究范围、加大样本量，进一步分析不同柑橘果皮中各特征香气物质对香气风味的贡献程度，这对特殊香气资源的开发和利用具有重要意义。