高效离子交换色谱法测定一种13C-尿素呼气试验用药品中13C-尿素的含量

詹传红，魏翠雯，关 东，李国威

（深圳市中核海得威生物科技有限公司，广东深圳 518122）

13C-尿素呼气试验（13C-UBT）是诊断幽门螺杆菌（Hp）感染的准确、简便、卫生的非侵入性试验，受到临床医生和病人的普遍欢迎[1]。13C-UBT 的优点是它没有放射性[2]。目前13C-UBT 在临床上用于检测胃幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori，HP）感染，在国际上已被公认为胃部HP 感染诊断的最重要手段之一，并被誉为胃部HP 感染诊断的金标准[3]。13C-尿素是重要的13C 标记基础试剂之一，其最为广泛的应用是临床诊断用13C-尿素呼气试验（13C-UBT）[4-5]。因此需要建立一个准确、可靠的测定13C-尿素含量的方法。

经文献报道现有13C-尿素含量测定方法主要包括凯氏定氮法、显色-紫外分光光度法和液相色谱法。凯氏定氮法专属性不强[6]，显色-紫外分光光度法存在重现性差、操作繁琐及不适合批量分析等问题[7]。随着液相色谱技术的发展和先进仪器设备的引入，目前应用较多，较为灵敏、快速、准确的方法为高效液相色谱法。美国药典收载有13C-尿素原料药含量测定的高效液相色谱法，但是该方法以及已有的分析方法不适用于本研究中13C-尿素呼气试验用药品的含量测定，因该药品中添加了大量的辅料甘露醇、柠檬酸等物质，已有检测方法无法将13C-尿素与辅料分开，且主成分13C-尿素保留时间短、基线噪声大，难以对13C-尿素进行准确定量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

赛默飞Vanquish core 高效液相色谱仪，DAD 二极管阵列检测器（美国Thermo）、XPR225DR 型电子分析天平（梅特勒）；PURELAB flex2纯水仪（ELGA）。

1.2 试剂

13C-尿素标准品（美国药检所，批号1 706701；纯度99.8%）；缩二脲（阿拉丁，批号C2 011021；纯度99.0%）；甘露醇（湖南九典制药股份有限公司，批号TF84210301）；柠檬酸（成都华邑药用辅料制造有限责任公司，批号20210101）；一种呼气试验用药品（国内已上市药品，批号180822）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK SCX UG80S5（4.6 mm×250 mm）；流动相：超纯水；流速：0.6 mL/min；检测波长：200 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

（1）空白溶液（稀释剂）：流动相；

（2）对照品溶液：取13C-尿素对照品约50 mg，精密称定，置100 mL 量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升约含13C-尿素0.5 mg）。

（3）供试品溶液：取供试品约2.0 g，精密称定，置100 mL 量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升约含13C-尿素0.5 mg）。

（4）缩二脲对照品贮备液：取缩二脲对照品约10 mg，精密称定，置100 mL 量瓶中，加稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升约含缩二脲100 µg）。

（5）系统适用性溶液：取13C-尿素对照品约10 mg，精密称定，置20 mL 量瓶中，再精密量取缩二脲对照品贮备液0.1 mL 至同一量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

（6）空白辅料溶液：取根据样品配方制备的不含13C-尿素的空白辅料，精密称定，置100 mL 量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性

精密吸取“2.2”项下各溶液按“2.1”色谱条件进样分析，结果见图1。结果表明，空白溶剂、空白辅料及样品中的其他成分不干扰13C-尿素的测定，13C-尿素与已知杂质缩二脲的分离度大于1.5，理论板数按13C-尿素峰计算大于5 000，该方法专属性良好。

图1 专属性试验高效离子交换色谱图

2.3.2 线性及范围

取13C-尿素对照品约125 mg，精密称定，置25 mL 量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，制得13C-尿素对照品贮备液（5 mg/mL）。精密量取对照品贮备液置10 mL 量瓶中，加稀释剂分别制成0.25 mg/mL、0.4 mg/mL、0.45 mg/mL、0.5 mg/mL、0.55 mg/mL、0.6 mg/mL 的线性溶液。精密吸取上述各浓度的线性溶液进样分析，记录色谱图。以各个线性溶液中13C-尿素的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，得出线性回归方程，报告线性曲线的斜率和相关系数r。结果表明，13C-尿素的回归方程为y=37.451x+0.9305，相关系数r为0.9996（≥0.999），即13C-尿素在浓度为0.25~0.60 mg/mL（相当于测试浓度50%~120%），浓度与响应值呈显著线性关系。

2.3.3 重复性

空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、系统适用性溶液同“2.2溶液制备”的方法配制，供试品溶液平行配制6份，精密吸取各溶液进样分析，记录色谱图，结果表明，6份溶液含量为98.1%~100.4%，RSD 为2%，该方法重复性良好。

2.3.4 准确度

取根据样品配方制备的不含13C-尿素的空白辅料，置100 mL 量瓶中，再分别精密加入40 mg、50 mg、60 mg 的13C-尿素对照品，分别制备得到80%、100%、120%的加标供试品溶液，每个浓度均平行配制3份，精密吸取各溶液进样分析，记录色谱图，计算加标回收率，结果见表1。

表1 准确度试验结果（n=9）

从表1 看出，9 份准确度溶液中，13C-尿素的回收率为98.1%~100.9%，RSD 值为1%，该方法的准确度良好。

2.3.5 稳定性

取“2.2.2”项下对照品溶液、“2.2.3”项下供试品溶液室温放置分别于不同时间点取样检测，考察对照品溶液、供试品溶液在室温条件下放置的稳定性。结果显示，对照品溶液在室温放置39.0 h 内，各时间点检测结果与0 h 比较，13C-尿素峰面积的比值为99.6%~100.0%；供试品溶液在室温放置29.4 h 内，各时间点测得13C-尿素的含量与0 h 比较含量的变化值为0.2%~0.6%。表明对照品溶液、供试品溶液分别在室温放置39.0 h 内和29.4 h 内稳定。

2.3.6 耐用性试验

分别于不同流速、不同柱温、不同检测波长下对对照品溶液和供试品溶液进行分析，考察系统适用性和供试品溶液中13C-尿素的含量是否符合要求。结果见表2。

表2 不同色谱条件下的含量测定结果

从表2看出，该方法对柱温、流速、检测波长的微小变动耐用性良好。

3 方法开发过程

3.1 色谱柱的选择

本研究考察了不同类型色谱柱的分离效果，首先采用普通反相色谱柱ZORBAX SB-C8进行分离，结果显示13C-尿素峰较难保留；之后采用亲水模式的HILIC 色谱柱进行分离，该色谱柱下13C-尿素峰峰形差且基线波动较大；而采用氨基柱Shodex Asahipak NH2P-50 4E 进行分离时发现，该色谱条件下空白辅料对供试品溶液中13C-尿素的测定有干扰，专属性无法满足测试要求，同时基线噪声较大。最终选择磺酸基阳离子交换色谱柱CAPCELL PAK SCX UG80S5为本研究中的色谱柱，该条件下基线平稳、峰形对称且主峰与其他峰能够有效分离。

3.2 流动相的选择

以CAPCELL PAK SCX UG80S5（4.6 mm×250 mm）为色谱柱，分别考察了乙腈-水（5 ∶95，V/V）、超纯水、0.2 mol/L 磷酸氢二铵作为流动相的分离效果，结果见表3

表3 3种流动相体系下13C-尿素的分离情况

从表3看出，3种流动相系统均能对供试品溶液中13C-尿素进行有效分离，对比发现，0.2 mol/L 磷酸氢二铵体系下，供试品溶液中13C-尿素与相邻峰的分离度最好，但考虑到0.2 mol/L 磷酸氢二铵浓度较大，会对色谱柱和色谱仪造成一定程度的损伤，因此，在能满足相应检测需求时，优选超纯水作为本研究的流动相。

4 结论

该方法中主成分13C-尿素保留较好，基线平稳、背景噪声小，同时峰形对称，与溶剂峰、辅料峰和已知杂质的分离度良好，且方法所用流动相为超纯水，不含缓冲盐，不会对色谱柱和仪器造成损伤。通过该色谱方法能够对13C-尿素的含量进行准确测定，从而控制13C-尿素呼气试验用药品的质量。