中医药调控信号通路治疗骨肉瘤的研究❋

杨浩东,谢兴文,李 宁,△ ,李鼎鹏,丁聚贤,柳 博,袁可馨,刘 凯,姚乾宁

(1.甘肃中医药大学,兰州 730000;2.甘肃中医药大学附属医院,兰州 730000;3.甘肃省第二人民医院,兰州 730030)

骨肉瘤是临床常见的骨恶性肿瘤,以儿童和青少年为主要发病人群,其中男性的发病率远高于女性,患者5年生存率低于50%[1-3]。骨肉瘤的疾病特点为好发于人体的长骨干骺端,以股骨远端和胫骨近端发病较为多见,容易发生局部侵袭和早期肺转移[4]。目前其发病机制尚不明确,并且可供选择的治疗方式也十分有限[5-6]。现代医学所采用的新辅助化疗结合保肢术的治疗方式虽提高了骨肉瘤的治疗效果,但仍有许多患者疗效不佳,经常出现肿瘤复发或肿瘤细胞向肢体远端转移。这些问题的产生和发展涉及多基因参与、多信号通路交叉作用的复杂过程,同时与长期使用化疗药物使得肿瘤细胞对药物的敏感度降低有关[7]。此外,化疗药物的不良反应较大,治疗费用也较为昂贵,因此,该疗法具有一定的局限性。

近年来,中医药在肿瘤相关疾病的防治中发挥了越来越重要的作用,并且以其独特优势和确切疗效受到了广泛关注[8-10]。相关研究发现,中医药具有多生物活性成分、多靶点、多通路协同作用、高效价廉和不良反应小等优势,能够有效抑制肿瘤生长和新血管的生成并逆转肿瘤细胞对抗癌药物的多药耐药[11-14]。随着骨肉瘤发病机制研究的日渐深入,近年来已发现细胞内的多条信号通路都与该病的发生和发展密切相关,信号通路通过改变其下游信号分子的活化状态,从而诱导靶基因表达以影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、自噬、侵袭、细胞周期及肿瘤新生血管的生成[15-16]。本研究通过对应用中医药调控分泌型糖蛋白(Wnt)、神经源性位点缺口同源蛋白(Notch)、核转录因子(nuclear factor,NF)-κB、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB别名Akt)、有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)、Janus激酶(janus kinase,JAK)/信号转导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)等信号通路治疗骨肉瘤的文章进行分析、整理,阐明中医药治疗骨肉瘤与相关信号通路之间的关系,以期为中医药治疗骨肉瘤提供参考。

1 Wnt 信号通路

Wnt信号通路是细胞内的一条高度保守的信号通路,在组织胚胎的发育过程中扮演着十分重要的角色[17]。Wnt通路根据下游激活物的不同被分为β-链蛋白(β-catenin)激活基因转录的经典Wnt信号通路、Wnt/Ca2+信号通路和与细胞骨架重排相关的Wnt/平面细胞极性(planar cell polarity,PCP)通路,其中Wnt/β-catenin是研究最多的一条通路,此条信号通路能够调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和细胞间质化等多个生物学功能[18]。相关研究证实,Wnt/β-catenin信号通路参与了肿瘤细胞的发生发展以及化疗耐药等过程[19-20]。在骨肉瘤细胞中,Wnt信号通路常被异常激活并促进肿瘤细胞的增殖和发生早期肺转移[21],而且常规化疗方案的失败也与 Wnt/β-catenin 信号通路的激活有关,通过抑制Wnt通路的活性可以有效阻止骨肉瘤细胞自我更新、减缓肿瘤生长和侵袭等过程。

李国湘等[22]的研究表明,半枝莲碱溶液(scutebarbatine,SBT)能够减少Wnt/β- catenin信号通路中关键分子β-catenin的蛋白表达,从而使下游原癌基因和细胞周期素(Cyclin)D1蛋白质表达水平降低,并且SBT可抑制糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase,GSK)-3β被GSK-3β第9位丝氨酸(Ser9)磷酸化,从而促进了GSK-3β对β-catenin蛋白的降解,通过阻滞Wnt/β- catenin信号通路的传导达到抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用。李增等[23]发现石见穿多糖可以通过降低细胞中β-catenin mRNA及波形蛋白(Vimentin)等表达,从而促进E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达来抑制上皮间质转化过程,从而达到抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的作用。董伯升等[24]研究丹参酮ⅡA对荷骨肉瘤裸鼠的影响,发现丹参酮ⅡA低、中、高剂量各干预组血清中的白细胞介素(interleukin,IL)-2、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α的表达水平、肿瘤组织中Dickkopf相关蛋白(Dkk)-1和Dkk-1 mRNA的表达均依次升高,而血清中可溶性血管细胞黏附因子(soluble vascular cell adhesion molecule,sVCAM)-1表达水平及肿瘤组织中β-catenin蛋白的表达依次降低,提示丹参酮ⅡA可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性发挥抗骨肉瘤的作用。

2 Notch 信号通路

Notch信号通路是重要的细胞间通信系统,可程序性地调控细胞命运和组织分化。在Notch信号通路中有4种主要的受体,分别是Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。这些受体是跨膜蛋白家族的成员,有着相似的结构,包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域,它们在细胞间的相互作用中起着关键的调节作用。除此之外,Notch 信号通路还拥有 5 种配体:Jagged1、Jagged2,Delta1、3、4[25]。Notch信号通路的激活是通过配体和跨膜受体的结合来完成的,一旦配体与受体结合,跨膜 Notch 受体蛋白会被γ-分泌酶裂解,使Notch受体的细胞内结合域(notch intracellular domain,NICD)释放出来,并迁移到细胞核,与DNA结合蛋白胞内效应分子(CBF-1/Suppressor of hairless/Lag,CSL)、核转录激活蛋白家族(mastermind-like,MAML)和转录激活因子相结合,从而诱导下游Hes等目标基因的表达,产生生物学效应。因此,通常将Hes-1作为Notch1通路激活的生物标志物[26]。相关研究发现,Notch信号通路在不同生理过程中维持稳态对保证生物体内微环境的正常运转至关重要,一旦 Notch 信号发生改变,就会导致疾病的发生[27-28]。李珂等[29]观察Notch信号通路在γ-分泌酶阻断剂和激动剂Jagged1的影响下对人骨肉瘤细胞的影响,发现γ-分泌酶阻断剂能够明显抑制143B细胞和 MG-63细胞的增殖,且呈现浓度依赖性,而Jagged1能促进肿瘤细胞的增殖,证实了可以通过抑制Notch信号通路的激活来影响肿瘤细胞的增殖,从而达到治疗骨肉瘤的效果。

梅红军等[30]探究不同浓度的黄芩素对143B骨肉瘤细胞增殖的抑制作用,发现骨肉瘤细胞被黄芩素处理后,细胞中B淋巴细胞瘤(B cell leukemia iymphoma,Bcl)-2相关X基因(Bcl-2 associated X protein gene,Bax)水平显著升高,Bcl-2蛋白水平显著降低,并且细胞中的分叉毛发与增强子(hairy and enhancer of split,Hes)家族成员Hes-1和NICD1的蛋白水平也显著降低,提示黄芩素可诱导细胞周期阻滞,并能通过促进细胞凋亡来抑制骨肉瘤细胞的增殖,其机制可能与抑制Notch信号通路活性有关。徐慧等[31]探究不同浓度的三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)对人骨肉瘤U2OS细胞的影响,发现PNS通过阻断Notch信号通路从而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡。亦有研究发现,虫草素可通过促进人骨肉瘤MG-63细胞中切割型胱天蛋白酶(cleaved Caspase)-3、9和Bax蛋白的表达,并降低Bcl-2、NICD1和Hes1蛋白的表达,停滞细胞周期,诱导肿瘤细胞凋亡从而起到抗骨肉瘤的作用,这一途径可能与虫草素下调Notch信号通路的活性有关[32]。

3 NF-κB 信号通路

NF-κB转录因子家族由5个普遍表达的成员(p50、p52、p65/RelA、RelB和c-Rel)组成,形成同源或异源二聚体。在正常情况下,非活化状态下的NF-κB在胞浆内与抑制蛋白κB(inhibitoryκB,IκB)家族的抑制蛋白相结合[33]。当细胞受到外界刺激,如在机体发生炎症、产生肿瘤以及免疫功能改变的情况下,活化蛋白激酶并释放NF-κB,自由的NF-κB进入细胞核,调控其所编码的靶基因蛋白转录表达。相关研究表明,骨肉瘤细胞的增殖与NF-κB蛋白的表达水平呈正相关,并且能够促进骨肉瘤细胞的转移和侵袭[34]。

董嵩等[35]探究不同浓度甘草次酸对人骨肉瘤细胞MG-63的抑制作用,发现甘草次酸能够明显抑制肿瘤细胞的增殖,并且促进肿瘤细胞的凋亡,蛋白印迹检测结果显示高浓度甘草次酸组中NF-κB蛋白的表达量明显低于其他组,提示其抗肿瘤机制可能通过影响NF-κB信号通路实现。范兆阳等[36]的研究表明石斛酚能够有效抑制人骨肉瘤U20S细胞的增殖、迁移及侵袭,抑制细胞中TNF-α、IL-6、NF-κB、促肝再生磷酸酶蛋白(phosphatase of regenerating liver,PRL)-3等的表达,减少炎症因子分泌,其作用机制与石斛酚调控NF-κB信号通路有关。江波等[37]研究松乳菇多糖对人骨肉瘤细胞Saos-2的影响机制,发现松乳菇多糖可以显著降低细胞的增殖率和侵袭、迁移数,提高细胞凋亡率,其抗肿瘤作用机制可能与下调NF-κB信号通路蛋白的表达水平, 以及抑制COX-2蛋白的表达有关。

4 PI3K/Akt信号通路

PI3K是一种由调节亚基P85和催化亚基P110的异源二聚体构成的脂质激酶,根据其结构可分为PI3K Ⅰ,PI3K Ⅱ和PI3K Ⅲ,当前对PI3K Ⅰ的研究最为广泛,PI3K Ⅰ能被细胞表面的受体激活,分为IA和IB两个亚型,IA在肿瘤细胞中最为常见,具有蛋白激酶和类脂激酶的双重活性,在细胞膜的信号转导、膜转运和代谢等过程中具有十分关键的调节作用[38-39]。Akt是PI3K下游非常重要的活性信号靶点,由Pleckstrin同源结构域(pleckstrin homology,PH)、催化域及调节域3部分构成。PI3K作为脂质激酶,与被磷酸化的酪氨酸残基缔合,激活自身的催化亚基p110,将磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol trisphosphate,PIP)2磷酸化生成PIP3[40],诱导Akt三级结构的构象发生改变,PIP3作为第二信使将Akt转运到质膜上,将Akt的磷酸化残基磷酸化,从而完全激活Akt,使其成为有活性的激酶进一步调节下游信号分子[41]。PI3K/Akt信号通路在细胞内广泛存在,并能够被多种蛋白受体激活并参与调控细胞内的许多过程,包括影响细胞周期、糖代谢、蛋白质合成以及维持基因组的稳定性。由于其在癌症细胞中最常见且作用关键,PI3K/Akt信号通路经常被作为癌症、炎症和其他疾病的治疗靶点[42-44]。相关研究证明,在骨肉瘤的发生和发展过程中PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路经常被激活,激活后的信号通路发挥相关调节作用,影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、自噬和凋亡[45]。

杨志强等[46]探究紫草素(shikonin, SK)对骨肉瘤的影响,发现不同浓度的SK对人骨肉瘤U2OS和MG-63细胞都有显著的毒性作用,导致骨肉瘤细胞的存活率明显下降,且表现出浓度和时间依赖性。在SK高浓度组,肿瘤细胞中Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值均显著上调,PI3K和Akt蛋白磷酸化水平显著降低,而PI3K激活剂血清胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)-1能够显著逆转上述指标的变化,表明紫草素可能通过抑制PI3K/Akt信号通路途径抑制U2OS细胞的生长并诱导细胞凋亡。杜兵强等[47]用不同剂量的槲寄生溶液处理人骨肉瘤U20S细胞,结果显示高剂量槲皮素组中PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的相对表达量以及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B, p-Akt)/Akt表达水平最低,提示槲寄生素可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路相关基因和蛋白的表达来抑制细胞增殖和侵袭能力、促进细胞凋亡, 从而发挥抗肿瘤作用。Liu等[48]研究人参皂苷(ginseng saponin,GS)Rg5对人骨肉瘤细胞增殖以及凋亡的影响,发现GS-Rg5能够降低PI3K、Akt和mTORC1的磷酸化水平,同时提高微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassociated protein1 light chain 3,LC3)-Ⅱ/LC3-I 水平,有效抑制人骨肉瘤细胞的增殖,且该作用呈剂量依赖关系,进一步实验结果表明,PI3K/Akt通路刺激因子IGF-1能够逆转GS-Rg5对MG-63细胞自噬的诱导作用,证实GS-Rg5通过自噬相关蛋白LC3介导的自噬途径诱导人骨肉瘤细胞凋亡。

5 MAPK信号通路

MAPK信号通路是一组能够被细胞外刺激物激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,包括p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases, p38 MAPK)、细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、ERK 5和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase,JNK)等4个亚族,能够影响细胞的增殖、凋亡、分化和生存等活动[49-51]。MAPK信号通路在癌症的发生和发展中有着十分重要的作用,阻断或抑制MAPK信号通路已经成为肿瘤治疗的新方向[52-53]。相关研究显示,JNK和p38作为MAPK通路的主要组成部分,与细胞凋亡过程密切相关,可以通过激活JNK、p38通路活性诱导骨肉瘤细胞发生凋亡[54-55]。

黄乾等[56]探究鹰嘴豆芽素A (biochanin-A, BA)对人成骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用机制,发现BA能够抑制肿瘤细胞的活性,通过上调磷酸化(phosphorylation,p)-p38,p-JNK和p-ERK1/2的表达水平,下调Bcl-2和上调Bax的表达来诱导骨肉瘤细胞的凋亡,而与凋亡相关的蛋白cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶降解产物cleaved-(poly ADP-ribose polymerase,PARP)都随着BA浓度的上升而增加,提示骨肉瘤细胞的凋亡可能与激活MAPK信号通路有关。张露露[57]探究小豆蔻明(cardamonin,CAR)对人骨肉瘤细胞株143B和MG-63细胞的抑制作用及相关机制,发现CAR可抑制骨肉瘤细胞增殖相关蛋白的表达,并且下调与肿瘤细胞迁移和侵袭相关蛋白的表达水平,上调促凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(Bcl-xL/Bcl-2 associated death promoter,BAD)、Bax的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的水平,说明CAR能够抑制骨肉瘤细胞的增殖,阻止其迁移和侵袭,并促进肿瘤细胞凋亡,当加入p38及JNK通路抑制剂后,可部分逆转CAR对肿瘤细胞的抑制作用,说明CAR抑制骨肉瘤细胞增殖并促进其凋亡的机制与激活MAPK信号通路有关。林淼雄等[58]的研究发现雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)能显著抑制LPS诱导的骨肉瘤MG-63细胞中TNF-α、IL-6、缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子的表达水平,TPL能够下调p-p38蛋白的表达量,提示TPL抗LPS诱导的促血管生成和抗炎作用可能与下调p38 MAPK信号通路的活性有关, 表明p38 MAPK可能是TPL作用的靶点。

6 JAK/STAT信号通路

JAK/STAT信号通路由JAKs家族和STATs家族组成[59]。JAKs家族拥有JAK1、2、3和Tyk2共4种激酶,除JAK3之外,其余蛋白都在组织细胞中广泛存在。STATs家族是JAKs的靶蛋白,共有7种类型的蛋白,分别是STAT1、2、3、4,STAT5a、5b和STAT6。在与之相关的细胞活动中,被磷酸化激活的JAKs家族蛋白进一步与STATs家族蛋白相结合,将集合在该位点的 STAT蛋白激活,活化的STAT蛋白与其受体形成二聚体进入到细胞核,启动对应的基因转录,从而调控下游靶基因的转录和表达[60]。JAK/STAT信号通路是重要的细胞因子信号传导途径,大量研究证明,骨肉瘤的进展与JAK/STAT 信号传导失调有关[61-62],其在肿瘤细胞中高度活化,能够将细胞膜感受到的刺激信号向细胞核传递[63],广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等过程,抑制JAK/STAT信号通路的活性能够抑制肿瘤细胞的周期进程以及诱导细胞凋亡等过程从而抑制肿瘤细胞的增殖。

宋奇等[64]研究不同浓度的山竹醇抗骨肉瘤U2OS细胞的作用机制,发现随着药物作用时间和浓度的增加,肿瘤细胞的活力逐渐降低,大多数细胞周期停滞于S期。检测结果表明山竹醇能使U2OS细胞中p-JAK2、p-STAT3、B细胞淋巴瘤(B cell leukemia iymphoma,Bcl)-xl等蛋白的表达水平下调,Bax蛋白的表达水平上调,且呈现浓度依赖性,从而有效促进细胞发生凋亡,证明山竹醇抗肿瘤机制可能与抑制JAK/STAT信号通路的活性有关。Lu等[65]的研究表明,姜黄素类似物可有效抑制人骨肉瘤U2OS细胞和MG-63细胞的运动、迁移和侵袭,能够降低肿瘤细胞中STAT3、JAK1、JAK2 和 JAK3 等蛋白的磷酸化,但不影响ERK、JNK、p38 和 Akt 等的磷酸化,当应用STAT3激活剂后,由姜黄素类似物诱导的尿激酶纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)的降低以及迁移侵袭潜力的下降可以被抵消,表明姜黄素类似物可以通过抑制uPA表达和JAK/STAT 信号传导来发挥抗骨肉瘤细胞迁移和侵袭的作用。吴倩等[66]探究二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)对人骨肉瘤细胞株MG-63的影响,发现DMY可呈时间和浓度依赖性地抑制细胞生长,阻止细胞的侵袭和迁移,上调促凋亡蛋白Bax、Bak的表达,减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而诱导细胞凋亡,JAK2、STAT3的磷酸化水平降低说明DMY可通过调控JAK2/STAT3信号通路抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡。

7 结语

骨肉瘤作为临床常见的原发性骨恶性肿瘤,具有较高的肺转移率和病死率,严重危害患者的生存质量,但其发病机制尚不明确,故现有的治疗方式并未取得理想的治疗效果。在现今的肿瘤防治领域,中医药以其多生物活性成分、多靶点、多通路协同作用的治疗优势被社会各界广泛关注,其通过对肿瘤细胞中的多条信号通路进行有效调控从而发挥抗肿瘤的作用,在抑制骨肉瘤细胞增殖、促进骨肉瘤细胞凋亡、诱导骨肉瘤细胞自噬和抑制血管化进程等方面具有良好的效果,并对减轻家庭、社会负担和提高患者的生存质量具有较大的意义。因此,基于信号通路探究中医药治疗骨肉瘤拥有广阔的发展前景。

但是,现有的研究主要停留在中药单体及其提取物治疗骨肉瘤的基础实验研究阶段,多为药物作用于体外骨肉瘤细胞系的研究,未在实际的临床应用中考量其治疗效果,并且忽略了中医辨证论治的特点以及组方中药和方剂配伍的治疗优势。因此,今后的研究应重点关注中医药应用于骨肉瘤患者的临床治疗效果,并且基于中医辨证论治理论以及从方药配伍角度探讨中医药对骨肉瘤进行靶向治疗的可能性,以期为中医药更好地应用于肿瘤疾病的防治提供新的治疗思路。