CRISPR/Cas9介导的KIFC1基因敲除对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响

范晓静，魏雅岚，叶洲杰，朱丽萍，王心睿,3

0 引言

驱动蛋白14家族成员C1（Kinesin family member C1, KIFC1, NP_002254）是一种从微管正极端向负极端运动的驱动蛋白，KIFC1可以促进微管间的交联、滑动和捆绑，在有丝分裂过程中参与纺锤体极体的聚集和组装，并在含有多个中心体的癌细胞中参与中心体的聚集。关于KIFC1的重要性尚存在争议，但在癌细胞中，KIFC1的过量表达是维持多个中心体肿瘤细胞正常分裂所必需的[1-2]。研究发现KIFC1在乳腺癌[3]、卵巢癌[4]、肝癌[5-6]、胃癌[7]、前列腺癌[8]、胰腺癌[9]等恶性肿瘤中特异性过表达，并可促进肿瘤细胞的增殖、迁移和上皮间质转化[4]。KIFC1通过调节PI3K/AKT信号通路调控子宫内膜癌进程，其表达量与子宫内膜癌的临床分期、病理类型及预后显著相关[10]。此外，KIFC1已被确定为三阴性乳腺癌患者预后不良的生物标志物之一[11]。KIFC1也可诱导多西他赛耐药，并与前列腺癌患者的不良预后有关[12]。敲低KIFC1可以抑制肝癌细胞增殖和侵袭，增加其对紫杉醇的敏感度[13]。因此，KIFC1作为肿瘤选择性治疗的靶点，值得进一步探讨。然而，关于KIFC1在宫颈癌发病机制中的作用研究较少，具体调控机制尚不清楚。

CRISPR/Cas9系统是目前最主流的基因编辑系统，具有效率高、成本低、操作简便等优点，广泛运用于基因敲除、基因敲入和多重基因编辑。本研究运用CRISPR/Cas9系统在人宫颈癌HeLa细胞中构建KIFC1基因敲除细胞系，探讨KIFC1表达缺失对细胞形态、细胞增殖、周期与凋亡的影响，为进一步研究KIFC1蛋白在宫颈癌发生发展中的作用提供细胞模型。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人宫颈癌细胞系HeLa（来源于ATCC细胞库CCL-2编号的细胞系）、CRISPR/Cas9系统质粒pSpCas9（BB）-2A-GFP（简称PX458）源于本实验室保存，DMEM培养基、胎牛血清和0.25%胰酶均购自美国Gibco公司，兔抗人KIFC1和鼠抗beta-actin单克隆抗体均购自英国Abcam公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗购自美国Cell Signaling Technology公司，TurboFect转染试剂（R0531）、T4 DNA连接酶（EL0016）和BbsⅠ酶（ER1011）均购自美国Thermo Scientific公司，感受态细胞DH5α（C502-03）、染料法qPCR预混液（Q711-02）、TA克隆试剂盒（C601-01）和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（A211-02）均购自南京诺唯赞公司，ExTaq酶（RR001Q）和反转录试剂盒（RR047A）均购自日本TaKaRa公司，PMSF（A610425）、RIPA缓冲液（C500005）、EdU细胞增殖检测试剂盒（E607204）和吖啶橙染色试剂盒（E607307）均购自上海生工公司，细胞周期与凋亡检测试剂盒（C1052）购自上海碧云天公司，细胞基因组DNA提取试剂盒（DP304）、无内毒素质粒小提中量试剂盒（DP118）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP219）、细胞总RNA提取试剂盒（DP451）均购自天根生化科技（北京）有限公司，引物合成和DNA测序由铂尚生物技术（上海）有限公司完成。

1.2 实验方法

1.2.1 靶向人KIFC1基因sgRNA的设计及表达载体的构建

在美国国家生物技术信息中心官网（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索Homo sapiensKIFC1基因序列（NM_002263.4），将序列输入到在线sgRNA设计网站（http://chopchop.cbu.uib.no/），根据预测结果设计两对sgRNA序列（见表1）和测序引物hKIFC1 target（见表2）。sgRNA与BbsⅠ酶切后的PX458质粒连接，转化到大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒鉴定。

表1 sgRNA寡核苷酸序列Table 1 sgRNA oligonucleotide sequences

表2 测序及qPCR相关引物Table 2 Primers for sequencing and qPCR

1.2.2 HeLa细胞培养及转染

HeLa细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，待细胞密度达到70%时，按照转染试剂说明书分组转染，其中实验组为PX458-sgRNA1+PX458-sgRNA2，阴性对照组为PX458质粒，空白对照组为脂质体试剂。转染48和72 h后，使用倒置荧光显微镜（Nikon, Ts2R-FL）观察绿色荧光蛋白表达情况以确定转染效果。

1.2.3KIFC1敲除单克隆HeLa细胞株的筛选及鉴定

转染72 h后的HeLa细胞经胰酶消化吹打成单细胞悬液，流式细胞术分选收集绿色荧光蛋白表达阳性的细胞悬液。采用有限稀释法将单个细胞接种至96孔板中进行培养，待单孔细胞增殖至50%融合度时，传代并扩大培养获得单克隆细胞株。

提取细胞基因组DNA，进行PCR扩增。PCR扩增体系为：PCR程序为：95℃ 3 min；95℃ 15 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，33个循环；72℃ 10 min，4℃保温。胶回收PCR产物并进行TA克隆，挑选单克隆菌落进行菌落PCR验证及测序分析。最终以KIFC1敲除细胞株为实验组，野生型HeLa细胞为对照组进行后续实验操作。

1.2.4 Western blot检测KIFC1蛋白表达情况

使用含1%PMSF的RIPA缓冲液裂解细胞，提取细胞总蛋白。制备好的蛋白样品进行SDSPAGE，电转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，HRP标记二抗孵育1 h，TBST洗涤3次，在膜上滴加显影液，放入显影系统（Bio-Rad，ChemiDoc MP）中成像。

1.2.5 RT-qPCR检测KIFC1基因转录水平

提取细胞RNA，进行反转录反应。以cDNA为模板，采用SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR检测。qPCR反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl，ddH2O上下游引物各1 μl，模板cDNA 1 μl，补ddH2O至20 μl。qPCR反应程序为：95℃ 30 s, 95℃ 10 s, 60℃ 30 s，40个循环；融解曲线95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

1.2.6 免疫荧光法检测敲除KIFC1对细胞形态结构的影响

将细胞接种于含12 mm爬片的24孔板中，待细胞贴壁生长后，吸弃培养基，PBS漂洗1次后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS浸洗3次。0.25%Triton X-100/PBS透化10 min，PBS浸洗3次，用含3%BSA/PBST的封闭液室温孵育1 h，加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温避光孵育1 h，两步分别用PBS浸洗3次去除多余抗体，DAPI与抗荧光淬灭剂等体积混匀封片，激光扫描共聚焦显微镜（Leica SP8）成像。

1.2.7 细胞生长曲线绘制及EdU染色

细胞生长曲线绘制：各组细胞用胰酶消化成单细胞悬液并进行计数，调整细胞浓度为5×104/ml，接种至24孔板中正常培养。24 h后开始计数，连续计数8 d，绘制细胞生长曲线。

EdU染色：细胞爬片过夜培养后，按EdU染色试剂盒说明书进行染色，共聚焦显微镜（Leica SP8）获取图像，检测细胞增殖。

1.2.8 流式细胞术检测细胞周期

收集各组细胞，使用预冷的PBS洗涤和重悬，缓慢加入预冷的75%乙醇，4℃固定过夜。次日，PBS洗涤，加入碘化丙啶（PI）37℃避光染色30 min，上流式细胞仪（BD LSRFortessa）检测，记录激发波长488 nm处的红色荧光。

1.2.9 流式细胞术及吖啶橙染色法检测细胞凋亡

流式细胞术：细胞接种至6孔板中培养48 h后，胰酶消化收集细胞，按Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，1 h内上流式细胞仪（BD LSRFortessa）检测。

吖啶橙（AO）染色法：细胞消化后，PBS洗涤两次，按吖啶橙染色试剂盒说明书进行染色，荧光显微镜观察成像。

1.3 统计学方法

所有实验均重复3次，采用GraphPad Prism 7.0和Microsoft Excels软件进行数据分析，结果以均值±标准差表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KIFC1在HeLa细胞中的时空表达定位分析

为评估KIFC1在HeLa细胞分裂中的功能，我们对KIFC1在细胞间期与分裂期的表达情况及亚细胞定位进行分析，利用免疫荧光技术对HeLa细胞的细胞核、微管及KIFC1蛋白进行荧光标记，测量荧光强度和相对细胞位置，见图1A。结果显示，在细胞间期，KIFC1分散定位在细胞质中或大量转运进入细胞核，见图1B。分裂期，尤其是在有丝分裂后期，KIFC1大量定位在中央纺锤体与星极纺锤体区，参与牵拉染色体的分离，见图1C。

图1 KIFC1在HeLa细胞间期与分裂期的表达定位Figure 1 Location of KIFC1 in HeLa cells during interphase and mitosis

2.2 构建sgRNA-Cas9重组载体

利用BbsⅠ酶对PX458质粒进行线性化处理，将合成的sgRNA序列与线性化PX458质粒连接，经转化、涂板、测序验证，构建sgRNA-Cas9重组载体，见图2。该载体含有人U6启动子，带有Cas9和EGFP标签，并具有氨苄青霉素抗性。琼脂糖凝胶电泳结果显示，酶切成功的质粒在相应位置出现明显条带，见图3A。

图2 sgRNA-Cas9重组载体构建模式图Figure 2 Schematic diagram of sgRNA-Cas9 recombinant vector construction

图3 转染质粒后EGFP阳性细胞形态F i g u r e 3 E G F P p o s i t i v e c e l l morphology after plasmid transfection

2.3 sgRNA-Cas9重组载体成功转染至HeLa细胞

将PX458-sgRNA1和PX458-sgRNA2质粒共转染至HeLa细胞中，使用倒置荧光显微镜观察转染效果，转染48 h后可见多数细胞成功表达EGFP信号，72 h后大量EGFP阳性细胞表现出巨核或多细胞核的表型，见图3B。

2.4 流式细胞术分选EGFP阳性细胞

通过荧光流式细胞分选技术，收集EGFP强信号的细胞群，检测其转染效率为28.6%，见图4A，收集该部分细胞群。经过荧光显微镜镜检，可以观察到所有分选后的细胞都携带绿色荧光，见图4B。

图4 流式细胞术分选EGFP阳性HeLa细胞群Figure 4 Flow cytometry sorting of EGFP-positive HeLa cells

2.5 成功构建KIFC1敲除单克隆HeLa细胞株

靶序列测序分析显示，KIFC1敲除细胞在386 bp和563 bp位点各缺失1个鸟嘌呤（G），在564 bp位点缺失1个胸腺嘧啶（T），见图5A，这些碱基缺失可以造成KIFC1蛋白截断翻译。与对照HeLa细胞相比，敲除细胞株中KIFC1蛋白表达量和转录水平明显下降，见图5B～D，与预期结果一致，证明HeLa细胞KIFC1基因敲除成功。

图5 敲除细胞KIFC1转录与蛋白表达水平验证Figure 5 Verification of KIFC1 transcription and protein expression levels in knock-out cells

2.6 KIFC1基因缺失影响HeLa细胞的形态结构维持

在KIFC1敲除株中，大量细胞核表现出多核、微核、染色质异常包装和微管骨架装配错误，见图6。细胞骨架异常延伸并过度组装，但细胞的贴壁能力明显变弱，细胞的增殖能力降低，部分细胞在生长过程中表现出明显的凋亡或死亡，见图7A。

图6 KIFC1敲除细胞微管骨架形态分析Figure 6 Morphological analysis of microtubule cytoskeleton in KIFC1 knockout cells

图7 KIFC1缺失对HeLa细胞形态、增殖及周期的影响Figure 7 Effects of KIFC1 deletion on morphology,proliferation and cell cycle of HeLa cells

2.7 敲除KIFC1抑制HeLa细胞增殖并影响细胞周期调控

EdU染色结果显示，与对照组相比，KIFC1敲除组中EdU标记的细胞明显减少，且DNA复制强阳性信号的细胞数量较少, 见图7A。通过分析细胞生长曲线，KIFC1敲除组细胞生长速率显著低于对照组，见图7B。以上结果均表明KIFC1敲除可使HeLa细胞增殖能力下降。

流式细胞术检测细胞周期分布结果显示，细胞周期调控发生显著的变化。其中，KIFC1敲除组G0/G1期和G2/M期细胞比例均显著高于对照组（P<0.05），而S期细胞比例则明显低于对照组，提示细胞DNA合成受到抑制，见图7C～G，进一步印证了KIFC1敲除导致HeLa细胞的增殖水平降低。

2.8 敲除KIFC1可促进HeLa细胞凋亡

KIFC1敲除组细胞经吖啶橙染色后，通过荧光显微镜可观察到不同程度的细胞凋亡情况，凋亡细胞核呈致密浓染的黄绿色，而对照组细胞的细胞核表现为均匀的绿色荧光，见图8A。

图8 KIFC1缺失对HeLa细胞凋亡的影响Figure 8 Effects of KIFC1 deletion on HeLa cell apoptosis

通过Annexin/FITC共标的流式细胞术检测进一步发现，敲除KIFC1后正常细胞比例减少（P<0.01; HeLa, 95.60±0.29%;KIFC1-/-Clone,93.23±0.12%），见图8B～D，早期凋亡细胞比例有所增加，见图8E，晚期凋亡细胞比例显著增加（P<0.05；HeLa，1.05±0.23%；KIFC1-/-Clone，2.67±0.28%），见图8F。综上结果表明，敲除KIFC1可促进HeLa细胞凋亡。

3 讨论

驱动蛋白是一类沿着微管运输分子的马达蛋白，在细胞器运输、细胞分裂、组织器官发育、信号转导等过程中发挥重要作用[14]。驱动蛋白的异常表达影响染色体的正确分布，引起有丝分裂过程中遗传物质变化和异常纺锤体形成，促进癌症的发生发展。近年来，驱动蛋白已经成为癌症药物开发的潜在靶点[15-18]。其中KIFC1是多种癌症诊断、治疗和预后的潜在生物标志物。KIFC1蛋白通过聚集中心体在癌细胞有丝分裂中发挥关键作用[19]。研究表明，KIFC1蛋白可直接结合CEP215，促进中心体与纺锤体极的连接，从而提高中心体聚集[20]。KIFC1还可能参与染色体排列、细胞周期中细胞器的运输，调节细胞周期G2-M期的进程。KIFC1的过表达驱动了控制有丝分裂检查点基因的过量表达，从而产生非整倍体，加速癌症发展的进程[21]。KIFC1蛋白参与多条肿瘤形成相关的信号通路。在子宫内膜癌中，KIFC1通过结合HMGA1促进c-myc的表达，从而加快c-myc介导的下游糖酵解基因的表达[22]。在肝癌中，KIFC1通过激活gankyrin/AKT/TWIST1通路，促进上皮间质转化和癌症转移[23]。KIFC1还可以通过Akt/GSK3β信号通路加速膀胱癌细胞增殖并诱导上皮间质转化[24]。在多种类型癌组织中，KIFC1的表达随着肿瘤发展级别的增加而增加，且KIFC1高表达易引起耐药性，与癌症患者的不良预后相关[25-28]。近期研究表明，DNA修复途径的ATM和ATR激酶诱导KIFC1-Ser26磷酸化，促进中心体聚集，导致耐药性和肿瘤复发[29]。这些研究揭示了KIFC1可能多方面参与癌症的发生发展过程。

目前KIFC1蛋白相关的研究通常使用基于RNAi机制的敲低细胞模型，我们利用CRISPR/Cas9技术在宫颈癌HeLa细胞中成功构建KIFC1敲除模型，可以更好地阐述KIFC1在宫颈癌中的作用机制。免疫荧光实验结果显示，在细胞间期，KIFC1大量定位在细胞核中，这与KIFC1尾部结构域的核定位序列（NLS）有关，KIFC1可与入核转运蛋白复合体中的Importin β结合，入核参与细胞周期的调控，并且其与核孔复合物NUP62相互作用可能介导核孔的重组[30]。在有丝分裂中后期，KIFC1与纺锤体共定位，表明KIFC1主要作用于纺锤体。在细胞分裂过程中，KIFC1参与微管交联、纺锤体两级形成、纺锤体组装和染色体分离等生命活动过程。之前的研究发现，KIFC1敲低可延长细胞的前中期，延缓细胞周期蛋白A的降解，进而破坏染色体凝集和排列，导致染色体错位、核型异常及微核的形成[31]。本研究观察到类似的结果，KIFC1基因的敲除可使细胞形态发生明显的改变，出现多核、微核等异常核结构，诱发微管骨架紊乱，还可以阻滞细胞周期，抑制DNA合成并诱导细胞凋亡，进而抑制HeLa细胞的增殖。这一结果提示作为宫颈癌治疗的潜在靶点，KIFC1具有广阔的发展前景。

综上所述，本研究以宫颈癌HeLa细胞系为研究模型，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除KIFC1基因，成功抑制KIFC1蛋白的表达。研究结果发现，KIFC1敲除可导致细胞骨架的异常装配，诱导细胞阻滞在G0/G1期、G2/M期，诱导HeLa细胞凋亡，从而减少细胞的增殖。未来，在KIFC1敲除细胞模型基础上可以结合临床实际问题如肿瘤治疗耐药性，深入研究KIFC1在宫颈癌中的潜在功能机制，为宫颈癌筛查、诊断和治疗提供新的思路。

利益冲突声明：

所有作者均声明不存在利益冲突。