1 株新型降解玉米赤霉烯酮的沙福芽孢杆菌及其关键酶分析

赵程程，孙长坡，孙 晶，王 峻，刘虎军

（国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是由禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、黄色镰刀菌等多种镰刀菌产生的次级代谢产物，是污染粮食谷物最广泛的真菌毒素之一，谷实类原料在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节中，都有可能受到ZEN的污染，ZEN在玉米、高粱、燕麦、小麦、谷子、豆类等农作物及其制品中的污染均有报道[1-2]。ZEN及其代谢产物具有与17β-雌二醇相似的结构，可竞争性地结合生殖器官中的雌激素受体，主要破坏动物的生殖系统，同时破坏免疫系统，并具有一定的肝毒性、细胞毒性和潜在的致癌性，已被国际癌症研究机构列为Ⅲ类致癌物[3-5]。我国制订了ZEN国家限量标准，配合饲料、玉米中的ZEN含量不超过500 μg/kg[6]，谷物及其制品中ZEN含量应低于60 μg/kg[7]。雷元培等[8]随机抽取2019年和2020年国内各省区域的玉米、玉米副产物、小麦及麸皮、杂粕和全价饲料等样品，ZEN检出率超过82%，尤其玉米副产物中ZEN检出率为100%，超标率大于17%。ZEN的毒性和污染普遍性给食品安全和人类健康带来严重威胁，因此，脱除或降解ZEN以避免其通过饲料和食品原料进入食物链非常有必要。

目前对ZEN的脱毒主要有物理、化学和生物方法。常规的物理和化学法存在降解效率低、营养物质流失和使用设备较为昂贵等问题，利用微生物或酶对ZEN进行降解的方法更为绿色、高效和安全[9-11]。微生物在生长过程中能够通过代谢或分泌的酶对ZEN进行转化，生成低毒或无毒的产物，因而ZEN降解菌株的筛选和降解酶的挖掘一直是生物方法消减ZEN的研究热点。Kakeya等[12]筛选得到1 株粉红螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）IFO 7063能够将ZEN转化成无雌激素活性的降解产物，并确定降解过程的关键酶为内酯水解酶ZHD101[13]。Kosawang等[14]研究也表明由于ZHD101对ZEN的脱毒，粉红螺旋聚孢霉对禾谷镰刀菌的生长具有拮抗作用，可用于ZEN的生物防控。Altalhi等[15]筛选得到可降解ZEN的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ZEA-1，并从菌株质粒中克隆得到降解酶的表达盒，在大肠杆菌中重组表达后可高效降解ZEN。Molnar等[16]从白蚁后肠中分离到1 株酵母菌Trichosporon mycotoxinivorans可以同时降解赭曲霉毒素A和ZEN，Vekiru等[17]进一步解析该酵母菌对ZEN的降解产物为ZOM-1，ZOM-1并未表现出雌激素活性。Złoch等[18]发现副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）能够将ZEN转化成毒性减弱的β-玉米赤霉烯醇。近年来芽孢杆菌对ZEN的降解能力被广泛报道。Chen等[19]分离几株能够降解ZEN的芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B2可用于ZEN污染玉米的发酵，能够提高其发酵特性。段锦等[20]从发霉饲料、动物粪便等样品分离鉴定出的降解ZEN枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌能够缓解ZEN中毒引起的小鼠脏器损伤。Zhu Yan等[21]从玉米青贮饲料样品中筛选ZEN降解菌株时，分离到的芽孢杆菌S62-W能够快速脱除ZEN，并解析其机制是对ZEN进行磷酸化修饰生成新型衍生物ZEN-14-磷酸盐（ZEN-14-phosphate，ZEN-14P）；Yang Shibin等[22]也在筛选时发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Y816能够对ZEN、α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇进行转化，生成其磷酸化产物，通过转录组测序分析获得ZEN转化过程的关键作用酶是ZEN磷酸转移酶（ZEN phosphotransferase，ZPH），并通过基因工程酵母传感器表征雌激素活性的方法表明ZEN-14P的雌激素活性与ZEN相比有明显下降。但是目前ZEN降解菌株和ZEN降解酶资源仍然较为匮乏。

本研究从安徽、山东的小麦样品中筛选能够快速降解ZEN的新型菌株，挖掘降解菌株中的关键酶基因，旨在为粮食谷物中真菌毒素的污染控制提供新的菌种和酶资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦样品取样自安徽、山东。

甲醇、乙腈（均为色谱级）美国Thermo Fisher公司；甲酸、甲酸铵（均为质谱级）美国Sigma-Aldrich公司；ZEN为国家有证标准样品（GSB 11-3429-2017），纯度＞98%；PremixTaq（ExTaqVersion 2.0）、PrimeSTAR HS（Premix）、DNA Ligation Kit宝日医生物技术（北京）有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物 英国Oxoid公司；马铃薯浸出粉 北京奥博星生物技术有限责任公司；其他常规试剂均为国产分析纯。

基础盐培养基（minimal salt medium，MSM）配方（1 L）：(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 6.15 g，KH2PO41.52 g，CaCl20.05 g，pH 7.0～7.2；LB培养基配方（1 L）：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，固体培养基添加1.5%～2.0%的琼脂粉；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基配方（1 L）：马铃薯浸出粉10 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）配方（1 L）：NaCl 8 g，K C l0.2 g，Na2HPO4·12 H2O 3.63 g，KH2PO40.24 g，pH 7.4。

1.2 仪器与设备

e2695高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配备2475荧光检测器、2489二极管阵列检测器）美国Waters公司；UPLC1290-QTOF6545超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联高分辨质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS/MS）联用仪 美国Agilent公司；生物安全柜 美国ESCO公司；C1000聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、Gel Doc XR＋凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 ZEN降解菌的筛选和分离

取5 g小麦样品置于50 mL离心管，加入5 mL生理盐水，30 ℃、200 r/min摇床振荡2 h后静置10 min，取上层液体50 μL到450 μL MSM培养基中（其中ZEN初始质量浓度为10 μg/mL），以不加菌液、含有相同质量浓度ZEN的MSM培养基作为空白对照，30 ℃、200 r/min振荡培养7 d，然后取50 μL到新的MSM培养基中（其中ZEN质量浓度为10 μg/mL）富集3 次，培养7 d后HPLC检测ZEN残留量。验证具有降解效果的样品稀释后分别涂布于PDA和LB平板上，然后挑取纯化后单菌落接种到500 μL含10 μg/mL ZEN的MSM培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养培养7 d后检测ZEN残留量。选取降解效果较好的菌株，接种至LB液体培养基，在30 ℃、200 r/min培养20 h，吸取一定量发酵液接种至含10 μg/mL ZEN的MSM培养基（起始OD600nm=1.0）中，定时取样检测ZEN残留量。

样品中ZEN含量采用HPLC测定，色谱柱为Waters XBridge®C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相为乙腈∶水=1∶1，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样10 μL，荧光检测器激发波长274 nm，发射波长440 nm。ZEN降解率计算如式（1）所示：

1.3.2 菌株鉴定

形态鉴定：分离得到的菌株在LB平板划线，30 ℃培养24 h观察菌落形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落颜色等。对菌株进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细胞的形态特征。

16S rDNA序列比对与进化分析：对筛选获得的菌株，按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取基因组DNA作为模板，进行16S rDNA序列扩增，引物为27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’），PCR扩增体系：27F 1 μL，1492R 1 μL，模板1 μL，ExTaq酶25 μL，ddH2O 22 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环30 次。PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后测序分析，将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，并使用MEGA7.0构建进化树。

促旋酶B亚单位（gyrase B，gyrB）基因序列比对与进化分析：以提取的细菌基因组DNA为模板，进行gyrB序列扩增，引物为UP-1（5′-GAAGTCATCATGAC CGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′）和UP-2r（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCN GCRTCNGTCAT-3′）[23-25]，PCR扩增体系：UP-11 μL，UP-2r 1 μL，模板1 μL，ExTaq酶25 μL，ddH2O 22 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环35 次。PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后测序分析，将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，并使用MEGA7.0构建进化树。

1.3.3 菌株吸附与降解ZEN活性

将菌株M7L4培养至稳定期的LB液体培养物进行等分，一部分作为发酵液，另一部分经5 000 r/min离心5 min，收集的培养基上清液，经0.22 μm无菌PES滤膜后，一部分作为发酵上清液暂存于4 ℃，一部分经121 ℃、20 min的高压蒸汽处理，作为灭活发酵上清液。收集的菌体分为3 部分，一部分用MSM洗涤菌体3 次后用等体积的MSM重悬，作为细胞重悬液；一部分用MSM洗涤3 次后用等体积的MSM重悬，经121 ℃、20 min的高压蒸汽处理，作为灭活细胞重悬液；另一部分用PBS洗涤后用等体积的PBS重悬，然后在冰浴中超声破碎，12 000 r/min、4 ℃离心20 min，离心上清液经0.22 μm无菌PES滤膜后，作为胞内液。

取5 μL 1 mg/mL ZEN溶液作为底物，加入495 μL上述各反应组分，置于摇床，37 ℃、200 r/min孵育24 h后取样进行HPLC检测ZEN残留量并计算降解率。

1.3.4 菌株M7L4对ZEN的降解产物解析

将菌株M7L4培养至稳定期的发酵液收集菌体，用MSM洗涤菌体3 次后，用等体积MSM重悬菌体并接种到含有ZEN的MSM反应体系中（M7L4菌体的起始浓度OD600nm=0.1，ZEN质量浓度为10 μg/mL），定时取样，UPLC-QTOF-MS/MS检测菌株M7L4对ZEN的降解及产物生成情况，通过降解产物的质荷比（m/z）和二级质谱结果解析产物结构。

UPLC-QTOF-MS/MS测定条件：色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相：A 相为水（含0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸铵），B相为甲醇（含0.1%甲酸）。梯度洗脱程序：0～1 min，90% A、10% B；1～1.5 min，90%～55% A、10%～45% B；1.5～8.5 min，55%～0% A、45%～100% B，保持1 min后回到初始流动相保持0.5 min，准备下一次进样。流速为0.3 mL/min，柱温度为30 ℃，进样2 μL。采用电喷雾电离源，负离子模式扫描，扫描范围为m/z100～1 700；二级质谱中的诱导碰撞解离能量为20 eV。

1.3.5 菌株M7L4中降解酶的基因克隆与蛋白表达

根据文献报道ZPH 能够将ZEN 转化成ZEN-磷酸盐（ZEN-phosphate，ZEN-P）[22]，在NCBI数据库搜索到沙福芽孢杆菌中磷酸烯醇丙酮酸利用酶（Bacillus safensisphosphoenolpyruvate-utilizing enzyme，BsaPUE）基因与zph基因（GenBank Accession No.MZ 170042.1）具有一定相似度。设计简并引物BsaPUE-F（5’-CGGGATCCATGTATTCAGTTTTATTTCAT GC-3’）和BsaPUE-R（5’-CCGCTCGAGKRCACGYG MATGCTGYTTTAAWATC-3’）从沙福芽孢杆菌M7L4中扩增BsaPUE，PCR扩增体系为：BsaPUE-F1 μL，BsaPUE-R1 μL，模板1 μL，PrimeSTAR HS（Premix）酶25 μL，ddH2O 22 μL。PCR扩增程序为：98 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸2 min 40 s，循环30 次。PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后采用限制性内切酶XhoI和BamH I分别对载体pET-28a（＋）和BsaPUE的PCR纯化产物进行双酶切，纯化回收的载体与BsaPUE基因经Solution I连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后提取pET-28a（＋）-BsaPUE质粒，测序正确的pET-28a（＋）-BsaPUE质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，获得BsaPUE表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）（pET-28a（＋）-BsaPUE）。挑取平板上单克隆接种到5 mL LB液体培养基（含50 mg/L卡那霉素），37 ℃、220 r/min条件下过夜培养，次日以1%接种于50 mL LB液体培养基（含50 mg/L卡那霉素），37 ℃、220 r/min条件下培养至OD600nm=0.6～0.8，加入终浓度为0.8 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，18 ℃、180 r/min条件下过夜培养后8 000 r/min离心收集菌体，超声破碎后离心上清液为粗酶液，再经Ni-NTA纯化得到纯化酶液。

1.3.6 重组酶BsaPUE对ZEN的转化效果验证

重组酶BsaPUE对ZEN转化体系体积为500 μL，取5 μL 1 mg/mL ZEN溶液作为底物，反应组1加入10 μL纯化的BsaPUE酶液，PBS补齐反应体系；反应组2加入10 μL纯化的BsaPUE酶液、10 μL ATP（终浓度10 mmol/L）和50 μL Mg2＋（终浓度20 mmol/L），PBS补齐反应体系；反应组3加入495 μL菌株大肠杆菌BL21（DE3）（pET28a-BsaPUE）的细胞重悬液（菌体收集后用PBS洗涤3 次后用等体积的PBS重悬）；以不加酶/菌液、含有相同质量浓度ZEN的PBS作为空白对照。反应体系置于摇床，37 ℃、200 r/min反应30 min后加入500 μL甲醇制备样品，进行检测。

ZEN转化产物采用HPLC测定，色谱柱为Waters XBridge®C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A相为水（含0.5%甲酸），B相为甲醇。梯度洗脱程序：0～10 min，50%～0% A、50%～100% B；10～11 min，0%～50% A、100%～50% B，保持5 min，准备下一次进样。流速为1.0 mL/min，柱温度为30 ℃，进样10 μL。ZEN转化率计算如式（2）所示：

1.4 数据处理

相关数据使用Microsoft Excel 2013软件处理，图表使用GraphPad Prism 6软件绘制，质谱数据采用Mass Hunter软件分析与处理。

2 结果与分析

2.1 ZEN降解菌株的筛选

采集的100 份样品进行3 次富集后，具有ZEN降解能力的样品有11 份（M1～M11），在LB平板和PDA平板上稀释涂布，挑取平板上形态不同的菌落再次划线纯化，然后挑取纯化后23 个单菌落分别接种到含有ZEN的MSM反应体系（ZEN质量浓度为10 μg/mL）中，培养7 d，其中6 个菌株M3P2、M5L2、M7L1、M7L4、M11L2、M11P2具有明显ZEN降解效果，降解率分别为 96.14%、53.22%、75.16%、100%、63.34%和66.49%，对菌株M3P2和M7L4降解ZEN的效果进行复证，如图1所示，来源于安徽宿州的小麦样品中分离到的菌株M7L4较其他菌株降解能力更高效，该菌株经LB培养基培养的发酵液24 h内对10 μg/mL ZEN的降解率高于95%，因此选择此菌株作为后续研究对象。

图1 M3P2和M7L4菌株对ZEN降解效果复证Fig.1 ZEN degradation capacity of strains M7L4 and M3P2

2.2 菌株M7L4的鉴定

菌株M7L4在LB培养基上可较好生长（图2A），菌落符合细菌特征。30 ℃培养24 h后如图2B所示，菌落为白色不透明，边缘较为规则，表面光滑且扁平。显微镜下形态如图2C所示，菌体细胞呈短杆状，革兰氏染色为阳性。

图2 菌株M7L4的鉴定Fig.2 Identification of strain M7L4

采用细菌的16S rDNA通用引物27F/1492R扩增菌株M7L4基因组上的保守序列，扩增产物的测序结果在NCBI上进行BLAST比对，结果显示与南海芽孢杆菌（B.australimaris）、沙福芽孢杆菌（B.safensis）和短小芽孢杆菌（B.pumilus）的16S rDNA序列相似度均高于99.8%。使用MEGA7.0构建菌株的系统发育进化树，如图2D所示，菌株M7L4与南海芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌处于同一分支上。

由于16S rDNA的高度保守性，对相似率极高的近缘种无法做进一步区分，因此扩增gyrB基因进一步鉴别M7L4菌株在芽孢杆菌近缘种所属分支[26-27]，采用Yamamoto等[23]报道的通用引物UP-1/UP-2r扩增菌株M7L4基因组上的gyrB基因，扩增产物的测序结果在NCBI上进行BLAST比对，结果显示与沙福芽孢杆菌的gyrB基因序列相似度最高。使用MEGA7.0构建的进化树如图2E所示，菌株M7L4与沙福芽孢杆菌处于同一分支上。

综合菌株的形态特征、16S rDNA和gyrB序列一致性及系统发育进化树分析，初步鉴定菌株M7L4为沙福芽孢杆菌。沙福芽孢杆菌在生物防控等方面的研究和应用已经有较多报道[28-30]，这是首次发现沙福芽孢杆菌对ZEN具有降解能力。

2.3 菌株M7L4吸附与降解ZEN活性

根据1.3.3节方法获得菌株M7L4发酵液、发酵上清液、胞内液、细胞重悬液、灭活细胞重悬液、灭活发酵上清液，分别测定各组分对ZEN的降解效率。如图3所示，灭活细胞重悬液和灭活发酵上清液对ZEN降解率小于10%，表明该菌株对ZEN吸附作用较弱；发酵上清液对ZEN的降解率小于5%，表明M7L4的胞外分泌物质不能够降解ZEN；发酵液和细胞重悬液在24 h内对ZEN的降解率可达100%，但胞内液几乎不降解ZEN，表明菌株M7L4对ZEN起降解作用的是活细胞，其对ZEN的降解可能需要细胞提供能量或者辅酶和辅因子。

图3 菌株M7L4各组分对ZEN的降解效率Fig.3 Degradation efficiency of ZEN by intracellular and extracellular components of strain M7L4

2.4 菌株M7L4对ZEN的降解产物解析

监测菌株M7L4对ZEN的降解过程并对降解产物进行解析。如图4所示，随着底物ZEN（C18H22O5，m/z317.139 4[－H]）的减少，有极性更强的产物（Compound X）积累（图4A），其m/z为397.109 5[－H]（图4 B），与目前已知的ZEN 代谢产物中ZEN-P（C18H23O8P，m/z=397.105 8[－H]）相符。分析该产物的二级质谱碎片，20 eV碰撞能量下该产物裂解后特征碎片离子的m/z为78.959 7（图4C），与Zhu Yan[21]和Yang Shibin[22]等报道的ZEN-P特征谱图一致，因此推断沙福芽孢杆菌M7L4对ZEN的降解产物为ZEN-P，菌株M7L4对ZEN的“降解”作用是将其转化为ZEN的磷酸化衍生物。

图4 菌株M7L4对ZEN降解产物的质谱分析Fig.4 Identification of the transformation products of ZEN by UPLC-QTOF-MS/MS

2.5 菌株M7L4中降解酶基因的克隆、表达与验证

根据NCBI中与zph基因相似度最高（53.20%）的沙福芽孢杆菌来源BsaPUE基因设计简并引物，从菌株M7L4中扩增得到其BsaPUE，如图5A所示，基因长度约2.5 kb，测序结果显示BsaPUE与zph的基因序列一致性为56.01%，BsaPUE蛋白与ZPH蛋白的氨基酸序列一致性为51.13%。

图5 BsaPUE基因的扩增与表达Fig.5 Amplification and expression of BsaPUE

根据1.3.5节方法对大肠杆菌重组菌株进行诱导表达和蛋白纯化（图5B），并验证重组酶BsaPUE对ZEN的转化效果（图6）。由图6A可以看到，反应组1仅加入重组酶BsaPUE，几乎不能转化ZEN；Yang Shibin等[22]报道的ZPH磷酸转移活性需要ATP和Mg2＋参与，因此反应组2中加入重组酶BsaPUE和ATP及Mg2＋，结果表明在ATP及Mg2＋存在的情况下，30 min内重组酶BsaPUE可将10 μg/mL ZEN全部转化成ZEN-P（图6B）；反应组3加入重组菌株大肠杆菌BL21（DE3）（pET28a-BsaPUE）的细胞重悬液，细胞内存在ATP及Mg2＋的情况下重组菌株也可将ZEN转化成ZEN-P。重组酶BsaPUE对ZEN的转化需要ATP与Mg2＋的参与，这与菌株M7L4对ZEN的降解可能需要细胞提供能量或者辅酶和辅因子的推测一致。已有报道表明ZEN-P与ZEN相比雌激素活性有明显下降[22]，本研究验证了菌株M7L4来源的BsaPUE具有ZEN转化能力并明确其反应体系，这是首次发现沙福芽孢杆菌来源的ZPH能够催化ZEN到ZEN-P的生物转化。

图6 重组酶BsaPUE对ZEN的转化效果Fig.6 Transformation efficiency of ZEN to ZEN-P by BsaPUE

3 结论

本研究采用富集培养法，从不同来源的小麦样品中分离获得1 株快速降解ZEN的微生物菌株，经形态学和分子生物学鉴定为沙福芽孢杆菌，并命名为M7L4。质谱分析表明，沙福芽孢杆菌M7L4的活细胞可将ZEN转化为m/z397.1的ZEN新型磷酸化衍生物ZEN-P。以菌株M7L4的基因组为模板，从中扩增出该沙福芽孢杆菌的BsaPUE基因，经大肠杆菌表达的重组酶BsaPUE，在有ATP和Mg2＋存在的情况下可将ZEN转化成ZEN-P。本研究报道沙福芽孢杆菌可降解ZEN、发现沙福芽孢杆菌来源的ZPH（BsaPUE）可催化ZEN生成ZEN-P，发掘的相关菌株和基因资源，可为粮食谷物中真菌毒素的污染控制提供一定的技术支撑。