猪圆环病毒2型快速检测方法研究进展

申秋平,唐雨萌,沈静怡,庄林林

江苏农林职业技术学院,江苏 镇江 212400

0 引言

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)可引起猪的生殖和呼吸道疾病、断奶仔猪综合征、皮炎和肾炎,给全球养猪业造成了严重的经济损失[1-2]。目前,根据PCV基因组序列分析,PCV可分为4种类型:PCV1、PCV2、PCV3、PCV4。其中,PCV2是我国目前猪群流行的主要亚型,其感染途径多样、传播速度较快。此外,该病毒易与其他猪源病毒(如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒)等混合感染,给兽医临床诊断带来较大难度[3]。因此,建立快速高效的PCV2检测方法对于我国乃至世界养猪业均具有重要意义。

本文通过对近年来国内外报道的PCV2快速检测方法进行综述,以期为行业工作者科学防控PCV2提供可选的参考方法。

1 基于核酸的检测方法

1.1 基于聚合酶链反应的检测方法

1.1.1 常规聚合酶链反应

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是基于目标基因序列设计特异性扩增引物以实现快速检测的一种核酸技术,具有敏感、特异、结果准确等优点。唐万寿 等[4]基于PCV2ORF1基因设计扩增引物,通过对反应体系和条件进行优化建立了一种可快速检测PCV2的PCR方法。该方法具有快速、灵敏、选择性好等优点,适用于PCV2快速检测。徐引弟 等[5]建立了一种直接PCR方法。在该方法中,组织样品研磨后采用灭菌PBS缓冲液进行稀释并离心,取上清液即可直接用于PCR检测。该方法最低可检测到10-3稀释度的模板,具有样品处理简单、反应快速等优点,整个过程可在1 h内完成。

1.1.2 巢式PCR

巢式PCR(nested PCR,nPCR)又称“套式PCR”,是基于PCR的一种改良方法,其基本原理与常规PCR相同,都是在体外进行DNA扩增。不同之处在于,该方法需要在常规PCR的基础上多设计1对引物,并将PCR反应分为2个步骤进行:第1步反应基于外引物扩增出1个较长的DNA片段;第2步反应则用1对内引物在第1步PCR产物的内部区域进行扩增,从而得到1个更短的靶基因扩增产物。这种方法可以有效减少非特异性扩增,同时提高PCR方法的敏感性。靳玉芬 等[6]对可疑病料进行PCR扩增并构建质粒,建立了一种套式PCR方法,可用于PCV2临床检测。该方法最低可检测到10 μL的阳性细胞培养物,且具有良好的特异性和可重复性。夏嘉鑫 等[7]通过正交试验筛选出优选反应体系,建立了一种PCV2单管巢式PCR方法。该方法具有高度特异性,针对DBN-SX07和ZJ/c株的检测限分别为0.6×10-6和0.6×10-3ng。

1.1.3 荧光定量PCR

荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,qPCR)是一种通过在PCR反应体系中加入荧光标记的探针或染料进行目标DNA定量检测的核酸技术。荧光定量PCR具有高灵敏度、特异性和准确性等优点,已广泛应用于基因表达、病原体检测、遗传疾病诊断等领域。冯华 等[8]以PCV2ORF2为靶基因建立了一种基于SYBR Green的qPCR方法,并对该方法的引物浓度、退火温度等进行了优化。结果表明,该方法的检测限可达3.0×102copies/mL,比常规PCR低2个数量级。经临床样品验证,该方法检出率高于常规PCR,更适于PCV2早期诊断。基于相同的基因,吴晓燕 等[9]建立的qPCR方法检测限达10 copies/μL,且批内和批间重复性试验的变异系数均小于2.5%。吴佳鑫[10]使用TaqMan探针建立的qPCR方法最低可检测到浓度为10 copies/μL的模板,且具有良好的特异性和重复性。Vilcek et al.[11]利用荧光标记的引物(light upon extention)开发了一种可用于高敏检测PCV2的qPCR方法。经优化后,该检测方法可检测到20 copies的PCV2 DNA。同时,最佳定量分析范围为2×102～2×107copies。

1.1.4 多重PCR

多重PCR(multiplex PCR,mPCR)是一种同时扩增多个目标DNA片段的PCR技术。在该技术中,多对特异性引物被设计用于识别并扩增不同的目标序列。这使得在一个反应中可以检测多个基因或变异。多重PCR具有高通量、节省时间和成本等优点。值得注意的是,多重PCR的优化和引物设计相对复杂,需要避免引物间的非特异性结合和扩增偏差。Zhang et al.[12]建立了一种基于TaqMan探针的多重qPCR/RT-qPCR方法用于检测常见的猪病毒和细菌。该方法以双管形式在反应中可同时检测4种病毒和4种细菌。通过使用每种病毒和细菌的质粒优化反应组分,提高了该方法的灵敏度、特异性和重现性。其中针对PCV2的检测限为4.74×102copies,比常规PCR低10倍。谢燕婷 等[13]基于猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)gB、PCV2ORF2和猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)VP2基因保守区域设计引物,建立了一种可快速检测PRV、PCV2与PPV的mPCR方法。其中,该方法针对PCV2的检测限为1.47×106ng,且与其他猪病毒无交叉反应性,适于临床上PCV2混合感染的快速诊断。

1.1.5 纳米PCR

纳米PCR(nano-PCR)技术是一种结合纳米材料的PCR技术。在这个方法中,纳米颗粒(如金纳米颗粒、磁性纳米颗粒等)由于其高比表面积、优异的光学性能和高热传导性等优点,可被用作PCR反应的助剂,以提高PCR的特异性、敏感性以及扩增效率等。其中,金纳米粒子还可作为热稳定剂,提高PCR反应的热稳定性。目前,nano-PCR技术在基因检测、病原筛查等方面已有相关应用。梁琳 等[14]建立了一种同时检测PCV2和PCV3的双重nano-PCR方法,该方法具有良好的特异性,对PCV2和PCV3的检测限分别为93.2、91.6 copies/μL,比常规PCR低2个数量级。沈鹤柏 等[15]研究同样证明基于金纳米颗粒的nano-PCR效果优于常规PCR。

1.1.6 数字PCR

数字PCR(digital PCR,dPCR)技术是一种高灵敏度和精确度的分子生物学技术,可检测到样品中极低浓度的DNA或RNA分子。数字PCR先将样品分离成数千个微小的反应单元,每个区域只包含1个或0个目标分子,然后进行PCR扩增,最终通过检测每个单元中的荧光信号来确定目标分子的数量。相比于qPCR,dPCR可以更准确地检测出目标分子的数量,适用于分子拷贝数低、样品差以及含有杂质的样品等。按照独立单元的实现方式来划分,dPCR可分为微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)和微滴芯片数字PCR(crystal digital PCR,cdPCR)。赵珊[16]根据PCV2ORF2基因设计引物及探针,对反应温度优化后建立了qPCR和ddPCR 2种方法。试验表明,2种方法在靶标浓度为12.5～9.85×105copies/μL区间时均具有良好的线性关系。其中,ddPCR的检测限约为25 copies/μL,且具有更宽的动态检测范围。使用ddPCR方法检测PCV1、PRV、PPV、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),结果均呈阴性。吴朦晨[17]根据PCV2基因序列设计特异性探针和引物,建立了ddPCR和三重cdPCR方法。其中,ddPCR的检测限为2.93 copies/μL,比qPCR的灵敏度高10倍,且对饲料样品的检测更加敏感,对复杂成分样品具有较好的适应性。三重cdPCR则可同时检测PCV1、PCV2、PCV3。标准曲线显示,该方法可特异性检测3种病毒,且具有较高的扩增效率和相关性。该方法对PCV2质粒样品的检测限为12.29 copies/μL。

1.1.7 微纳米材料在PCR样品制备中的应用

微纳米材料(micro/nano materials)具有尺寸小、比表面积大、形貌可控等优异特性。在PCR样品制备中,微纳米材料如磁性珠或金纳米颗粒可以作为模板提取的载体,通过特定的表面化学修饰,可以选择性地捕获目标DNA分子,快速而高效地纯化样品中的目标DNA,从而提高PCR检测的灵敏度和准确度。Huang et al.[18]使用涂有PCV2特异性DNA探针的磁性微粒从样品中富集PCV2 DNA,然后加入PCV2特异性寡核苷酸修饰的金纳米颗粒形成夹心核酸复合物。复合物形成后,寡核苷酸被释放并通过PCR进行扩增。该方法针对PCV2 DNA和血清样本的检测限分别为2、10 copies,比常规PCR低约500倍。该方法对所有的PCV2基因型都有很宽的检测范围,并且具有可靠的重复性。同时,该方法与其他猪相关病毒无交叉反应,包括PCV1、PRV、PRRSV和CSFV等。经临床样本验证,该方法的检出率高于常规PCR和qPCR,在评估临床样品的病毒载量方面具有应用价值。

1.2 核酸等温扩增技术

1.2.1 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年由Notomi et al.[19]提出的一种基于链置换DNA聚合酶的核酸扩增技术,可以在等温条件下(通常60～65 ℃)高效扩增目标DNA序列。LAMP技术通过使用2～3对引物识别目标DNA的6～8个区域,可有效增加反应的特异性。此外,LAMP技术也可以检测低浓度的靶基因,灵敏度比常规PCR高1～2个数量级[20]。Zhao et al.[21]基于PCV2ORF2基因设计引物建立了一种可用于PCV2检测的LAMP方法。该方法对PCV2的检测限为10 copies,比常规PCR低2个数量级。同时,该方法与PCV1、PRRSV、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒以及轮状病毒等无交叉反应性。谢志勤 等[22]基于CSFVE2和PCV2ORF2基因设计引物和探针,建立二重荧光LAMP方法以快速区分CSFV和PCV2。通过对CSFV和PCV2探针分别标记不同的荧光基团和淬灭基团,即可根据不同荧光判断检测结果。试验分析表明,该方法可特异性检测CSFV和PCV2,检测限均为100 copies/μL。Lei et al.[23]利用LAMP无需特殊设备以及CRISPR/Cas12a系统能够切割单链DNA的特性,建立了一种快速有效的PCV2检测方法。经过一系列反应条件优化后,该LAMP-CRISPR方法的检测限达1 copies/μL,且可在1 h完成,并实现结果可视化。张琪 等[24]通过优化LAMP试剂盒检测性能,建立了一种可用于PCV2现场可视化定性检测的LAMP方法。利用该方法可在40 min内可检测到最低5 copies/μL的PCV2 DNA。同时该方法具有特异性强、简单实用、仪器简单等特点,有望应用于临床诊断。

1.2.2 重组酶介导等温核酸扩增技术

重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)是一种基于重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白等共同作用在恒温条件下(37～42 ℃)进行核酸高效扩增的分子技术。范乐佳[25]将RAA与CRISPR/Cas系统结合,建立了一种可快速、精准检测PCV2的方法。该方法有效简化了样品处理和操作步骤,可在30 min内完成检测。同时,该方法的检测限为10 copies/μL,比PCR方法低3个数量级。经52份临床样品检测验证,该方法检测结果与PCR的符合度为98%,表明该方法适用于临床PCV2检测。

1.2.3 重组酶聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)利用重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白等,通过引物引导DNA扩增,可在等温条件下将目标DNA序列扩增至数量足以检测的水平。Wang et al.[26]基于PCV2ORF2基因设计特异性引物和exo探针建立了一种可实时检测PCV2的RPA方法。检测可在38 ℃、20 min内完成,灵敏度为103 copies,且与猪其他常见病原无交叉反应。基于同样的靶基因,Yang et al.[27]建立实时荧光RPA和结合RPA与侧向层析试纸(lateral flow dipstick,LFD)的RPA-LFD方法进行PCV2快速检测。结果表明,RPA可在37 ℃、20 min内完成扩增。实时RPA和RPA-LFD方法的灵敏度均为102copies,且均具有高度特异性。进一步地,陈思楠 等[28]根据PCV2Cap基因建立的基于侧向层析试纸的RPA方法可在5 min内实现可视化检测。同时,该方法检测限为10 copies/μL,且具有高度特异性。Wang et al.[29]基于Cas12a在切割目标dsDNA后会以非特异性的方式继续切割ssDNA这一原理,通过RPA扩增的目标序列被Cas12a和crRNA切割以激活Cas12a的反切活性。由于G-四链体ssDNA被活化的Cas12a切割,不能形成空间结构,失去氧化酶活性。当没有靶序列时,G-四链体ssDNA不会被Cas12a切割。完整的具有氧化酶活性的G-四链体和血红素相结合以催化TMB显色。因此,检测结果阳性呈无色,阴性呈蓝色。该方法检测PCV2的灵敏度为103copies,且可以实现可视化和无标签的PCV2现场检测,无需依赖仪器和电源。该方法为PCV2鉴定提供了一种新的选择,有望应用于现场即时诊断。

1.3 基因芯片技术

基因芯片(gene chip)检测是以DNA分子杂交为原理的生物分析技术。芯片上含有大量DNA探针的固定阵列,每个探针均可用于检测特定序列,因此可实现对生物样品中大量基因的高通量和高效率分析。姜永厚 等[30]基于PCV复制酶基因保守序列成功建立了一种可用于区分检测PCV1和PCV2的芯片。该方法可以检测到的最低约4×108copies/μL的PCR产物以及0.15 μg/L的PCV2重组质粒。肖驰 等[31]研制的三重DNA芯片可用于同时检测CSFV、PRRSV和PCV2混合感染。该芯片具有特异性强、灵敏度高和可重复利用等优点。

1.4 原位杂交技术

原位杂交技术(in situ hybridization,ISH)是基于外源核酸(探针)与待测DNA或RNA以显示该核酸所在位置的分子技术。该技术敏感性较强,可以准确定位到细胞或组织中特定的DNA或RNA序列。姚鑫 等[32]利用高辛标记的核酸探针建立了一种PCV2 ISH检测方法,最低可检测到1.78 pg的病毒DNA。应用该方法对人工感染PCV2的猪组织进行检测,可以发现PCV2最早侵染和滞留的组织。结果表明该方法可以准确反映病毒在组织中的状态与细胞的分布,对PCV2的早期诊断具有应用价值。

1.5 液相芯片系统

液相芯片系统(flexible multi-analyte profiling,xMAP)是基于微球体悬浮芯片的一种生物芯片技术。它是在不同荧光编码的微球上进行多种结合反应及核酸杂交,通过不同激光分别检测微球编码和报告荧光以实现定量[33]。王晶钰 等[34]联合不对称二重PCR和液相芯片系统,建立了一种可同时检测PPV和PCV2的方法。该芯片特异性良好,针对PCV2的检测限为2.58×102copies,且临床样品检测结果与PCR方法一致。

2 免疫学检测技术

2.1 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术(immunocolloidal gold techniques)是一种用于检测生物分子(如蛋白质、抗体等)的简单、快速的方法。该技术基于免疫反应原理,将目标分子与适当的抗体结合,然后使用胶体金颗粒标记另一种抗体来检测这个复合物。该技术通常通过裸眼观察胶体金颗粒的颜色变化来诊断结果,具有操作简单、快速和成本可控等优点[35]。时建立 等[36]采用胶体金颗粒建立了一种检测PCV2抗体的免疫层析试纸。试验结果表明,该试纸只与PCV2阳性血清发生反应,最低可检出100倍稀释的阳性血清,具有较好的特异性和灵敏度。

2.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一种常用的免疫检测方法。该技术利用抗原与抗体反应,通过酶催化底物进行显色从而实现抗体或抗原的检测分析。ELISA操作简单、快速、重复性好,目前已广泛应用于医学、生物学等领域中的诊断和监测等研究。葛猛 等[37]制备可溶性的Cap重组蛋白作为诊断抗原,建立了一种间接ELISA抗体检测方法。该方法可以检测到稀释100倍的PCV2阳性血清,且可重复性好,对394份血清的检测结果与临床诊断相符。陈清清 等[38]基于PCV2 Rep建立间接ELISA抗体检测方法。该方法采用大肠杆菌原核表达获得的重组PCV2 Rep蛋白,纯化后的抗原可以被PCV2抗体阳性血清特异性识别,具有良好的免疫反应性。同时,该方法具有较好的特异性,且可有效鉴别自然感染以及疫苗免疫猪只。Han et al.[39]通过使用PCV2病毒颗粒作为包被抗原和PCV2单克隆抗体作为竞争抗体来建立竞争性ELISA。该方法表现出良好的特异性和可重复性,有助于简单地检测猪血清样品中的PCV2特异性抗体,而不受PCV1抗体干扰,可用于评估PCV2抗体水平。Yang et al.[40]利用噬菌体展示技术,从1只PCV2-Cap蛋白免疫的双峰驼身上筛选出19个抗PCV2-Cap蛋白纳米抗体。基于纳米抗体(Nb)-辣根过氧化物酶(HRP)融合蛋白平台表达PCV2-Nb15-HRP构建了一种竞争性ELISA方法以快速检测PCV2抗体[41]。分析表明,该ELISA的临界值为20.72%。经360份猪血清样本验证,建立的ELISA和商业试剂盒相比,灵敏度和特异性分别为99.68%和95.92%,且2种方法的重合率为99.17%。

2.3 琼脂扩散试验

琼脂扩散试验(agargel precipitation test,AGPT)是一种常用的免疫学试验方法。该方法利用抗原与抗体之间的特异性反应,在琼脂板上形成不可溶性复合物,通过测量复合物的直径或面积来判断待检测物质是否存在或浓度大小。琼脂扩散试验操作简单、成本低廉,但分辨率和准确性有限,适用于检测大分子物质如蛋白质等。苗丽娟 等[42]以PCV2 Cap蛋白为抗原建立琼脂扩散试验方法。该方法具有较好的特异性和稳定性,与胶体金试纸条检测结果符合率达到94.1%,可用于临床检测。庄金秋 等[43]制备出兔抗PCV2 Cap蛋白多克隆抗体,建立了可用于Cap蛋白效价测定的琼脂扩散试验方法。由于抗原成分单一,免疫效率大大提升,也避免了用全病毒作为免疫原制备抗体过程中的大量繁琐工作和结果的不确定性,有望代替PCV2标准抗体以用于临床检测。

2.4 斑点测定法

斑点测定法(spot assay)是一种常用的快速、便捷且经济的免疫检测方法,可用于检测多种生物分子如蛋白质、抗体等。它基于抗原与相应抗体之间的特异性结合反应,通过标记在试纸或膜上的单克隆或多克隆抗体来检测样本中的目标分子。该方法具有操作简便、快速、经济等优点。Fossum et al.[44]建立了一种PCV2斑点测定法(PCV2-SPOT)以计数从自然感染的猪获得的分泌病毒的淋巴细胞。该检测方法的原理与常规斑点检测法相似,将PCV2颗粒固定化并作为滤色斑检测。该方法为半定量检测感染猪细胞释放的PCV2病毒颗粒提供了可选方法支持。

2.5 表面等离子体共振技术

表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance,SPR)是一种基于光学原理的快速分析技术。在恒定光源波长和金属薄表面的条件下,SPR角取决于金属表面附近材料的折射率。当生物分子与金属表面相互作用时,会改变金属薄膜的折射率,从而影响到SPR波长的位置和强度,这种改变可以被SPR仪器检测到,并转化为生物分子之间的相互作用强度和动力学参数[45]。Hu et al.[46]以表面等离子体共振(SPR)技术为基础,结合免疫学技术,通过在金膜上修饰PCV2抗体并对生物传感器进行化学处理,建立了一种敏感、无标记、实时检测PCV2的方法。该方法最低可检测到样品中浓度为0.04 μg/mL的PCV2,回收率介于81.0%～89.3%,且在宽浓度范围内具有较好的线性响应(R2为0.996 25)。该方法可靠、稳定,为直接检测PCV2提供了一种新的工具支持。

3 结束语

基于核酸的检测技术和免疫学技术的发展为PCV2快速检测提供了重要工具和技术支持。这2种检测技术分别通过检测病毒核酸和特异性免疫反应来实现PCV2检测。2类检测方法各有优缺点,如:基于PCR的方法结果准确、灵敏度高、特异性强,但这类方法均需要借助热循环仪且操作要求较高;核酸等温扩增技术为PCV2现场即时检测提供了可选工具支持,但目前相关方法在技术成熟度上仍需要完善,难以广泛应用;免疫学检测方法操作简单、快速,但在灵敏度、特异性等方面仍有待提升。

随着科学技术的不断发展,未来PCV2快速检测方法的潜在发展方向包括但不限于以下3个方面:①可视化检测。基于PCV2现场(栏边)即时检测需求,支持裸眼观察或简单设备读取结果、无需复杂仪器和操作的检测技术将得到不断优化和发展,有望开发出更加灵敏、快速、高效的检测方法。②便携式检测系统。开发便携式PCV2快速检测系统,包括一体化PCR及恒温检测仪、手持式核酸/蛋白分析仪等,提高快速、精准检测PCV2的能力和现场检测水平。③高通量检测。针对PCV2易与其他多种病毒共感染的特点,期待未来能发展出更高通量的检测方法,提高多种病毒混合感染的检测能力,为养猪业的可持续发展提供有力技术保障。